一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA5及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物谷蛋白分选相关蛋白osgpa5及其编码基因与应用。
背景技术：
水稻是世界上近一半人口的主粮。第一次绿色革命和杂交稻的大面积推广实现了水稻产量的两次飞跃。近期，我国科学家又提出了超级理想型籼-粳f1杂种的分子设计模型，以期实现水稻产量的第三次飞跃。然而，由于我国稻米品质欠佳，远不能满足大众对品质尤其是食味品质越来越高的要求，从而导致连年丰收后的“国产稻米粮满仓”与大米进口不断增长的矛盾日益突出。淀粉是稻米中最主要的营养物质，其含量、组成和结构对稻米的品质有着决定性的影响，因此目前稻米食味品质的改良往往以淀粉的改良为主，但蛋白质在稻米食味品质形成中的作用也不容忽视。谷蛋白是稻米中最重要的贮藏蛋白，是稻米蛋白品质改良的首选目标。因此，解析水稻谷蛋白合成、转运、加工和积累的分子机制对稻米的品质改良至关重要。57h突变体是稻米蛋白品质改良研究的良好遗传材料。目前已经克隆了6个调控谷蛋白分选的关键基因，并初步描绘了谷蛋白分选的分子途径，但谷蛋白分选的确切机理我们仍知之甚少。px结构域由100-120个氨基酸构成，首次在人类nadph氧化酶复合体细胞质组分p47phox和p40phox中被鉴定。它是继ph(pleckstrinhomology)、fyve和enth结构域之后，加入脂信号途径的又一新成员。目前尚无报道关于含有px结构域蛋白参与水稻谷蛋白分选的研究。技术实现要素：本发明通过水稻谷蛋白分选突变体gpa5的表型分析和目标基因的初步定位，最终克隆得到谷蛋白分选相关蛋白osgpa5，因而本发明提供一种谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的谷蛋白分选相关蛋白（osgpa3），来源于稻属水稻（oryzasativavar.kitaaake），是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有所述功能的衍生蛋白质。序列表中的序列1由710个氨基酸残基组成，自氨基末端第67至179位为px结构域,435-559为cc结构域。为了使（a）中的osgpa5便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6（通常为5个）rrrrrpoly-his2-10（通常为6个）hhhhhhflag8dykddddkstrep-tag8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述（b）中的osgpa5可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的osgpa5的编码基因可通过将序列表中序列2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5´端和/或3´端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码上述贮藏蛋白分选相关蛋白的基因（osgpa5）也属于本发明的保护范围。所述基因osgpa5可为如下1）或2）或3）或4）的dna分子：1）序列表中序列2所示的dna分子；2）序列表中seqidno.3所示的dna分子；3）在严格条件下与1）或2）限定的dna序列杂交且编码所述蛋白的dna分子；4）与1）或2）或3）限定的dna序列具有90%以上同源性，且编码谷蛋白分选相关蛋白的dna分子。序列表中的序列2由2133个核苷酸组成。所述严格条件可为在0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1%sds的溶液中，在65oc下杂交并洗膜。含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（camv）35s启动子、玉米的泛素启动子（ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（gus基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体可为在pcambia1305.1载体(http://www.cambia.org/daisy/cambia/585)的多克隆位点smai之间重组插入所述基因（osgpa5）得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pcambia1305.1-osgpa5；所述pcambia1305.1-osgpa3是将由osgpa3基因组编码序列连同上游2724bp的启动子区和下游3138bp的片段通过重组技术插入到pcambia1305.1多克隆位点smai之间得到的(clontech公司，infusion重组试剂盒)。将含有osgpa5的pcambia1305.1命名为pcambia1305.1-osgpa5。含有以上任一所述基因（osgpa5）的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法。本发明提供的培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入谷蛋白分选异常的植物中，得到谷蛋白分选正常的转基因植物；所述谷蛋白分选异常植物为胚乳中谷蛋白前体剧增并伴随成熟谷蛋白含量降低的植物；所述谷蛋白分选正常的转基因植物为谷蛋白前体能被正常加工成为成熟谷蛋白的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入谷蛋白分选异常植物中；所述谷蛋白分选异常植物可为gpa5。所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本发明的谷蛋白分选相关蛋白影响水稻胚乳中谷蛋白的分选过程。将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。附图说明图1野生型kitaake和突变体gpa5的外观表型；图2野生型kitaake和突变体gpa5sds-page和westernblot分析；图3野生型kitaake和突变体gpa5发育胚乳的考马斯亮蓝染色观察；图4野生型kitaake和突变体gpa5发育胚乳的免疫胶体金观察；图5突变基因的图位克隆；图6转基因互补株系的表型分析；图7pcambia1305.1载体图谱。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、水稻中谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因的发现一、水稻谷蛋白分选突变体gpa5的表型分析在粳稻品种kitaake的60co辐射突变体库中筛选出籽粒粉质的突变株系gpa5。与野生型相比，gpa5的主要特征是籽粒粉质，不透明（见图1a）。扫描电镜分析证实gpa5中淀粉颗粒松散，可能是导致胚乳粉质不透明的主要原因（见图1b）。gpa5种子蛋白的sds-page图谱显示谷蛋白57kda前体增加，相应成熟的谷蛋白酸性亚基和碱性亚基含量降低，同时球蛋白含量也有所降低（见图2a）；westernblot分析进一步验证了上述变化（见图2b）。发育中期胚乳半薄切片经过考马斯亮蓝染色后观察发现，野生型存在两类蛋白体，球形的蛋白体i和不规则形状的蛋白体ii，蛋白体ii略大于蛋白体i（见图3a和3c，黑色三角标示蛋白体i，红色三角标示蛋白体ii）。有趣的是，在gpa5中除上述两种蛋白体外，在细胞壁附件还发现一类填充有大量蛋白质的壁旁体类结构（见图3b和3d，红色星号标示）。此外，gpa5中蛋白体ii相比野生型明显变小（见图3d，红色三角标示）。上述结果表明gpa5突变体中蛋白体ii发育异常，大量蛋白质填充在细胞壁附近形成的壁旁体类结构中。为了解析壁旁体类结构的形成过程，利用透射电镜结合免疫胶体金技术观察了发育中期的胚乳（见图4）。研究表明谷蛋白的后高尔基体运输由一类称之为致密囊泡的运输工具介导完成（图4a，4c和4k）。和野生型一样，突变体gpa5中致密囊泡可以从高尔基体正常出芽（图4b）。然而，有趣的是，gpa5中大量致密囊泡错误分选到胞外体空间（图4d），逐渐积累并形成大的壁旁体类结构（图4e-4j），因此，导致gpa5中的蛋白体ii变小（图4l-4n）。综上所述，上述结果证实gpa5中负责运输谷蛋白的致密囊泡发生错误分选，进而导致大量谷蛋白前体进入胞外体空间而不能被切割为成熟的酸性亚基和碱性亚基。二、目标基因定位1、目标基因的初步定位利用突变体gpa5与广亲和品种dular（购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库）杂交，在gpa5/dular的f2分离群体中选取10粒gpa5表型（籽粒粉质不透明且谷蛋白前体增加）的隐性极端个体，抽提种子dna，构建dna混池。利用覆盖水稻全基因组的175对indel标记进行连锁分析，将负责gpa5突变体表型的突变基因定位在第6号染色体indel标记m124和m85之间，物理距离为358.6kb。2、目标基因的精细定位依据初定位结果，在indel标记m124和m85之间寻找公共图谱上的分子标记，并依据ncbi公布的水稻基因组序列信息在此区间自行开发indel标记。利用198个隐性极端个体对目标基因进行了精细定位（用于精细定位的分子标记见表2）。表2用于精细定位的分子标记最终将目标基因osgpa5精细定位在indel标记m161和lk48之间，物理距离为60.9kb（图5a）。经过对该区间内基因进行测序，发现第4个orf的第4个外显子上存在一个单碱基的缺失，使得目标蛋白翻译提前终止（图5b和5c）。三、目标基因osgpa5的获得提取粳稻品种kitaake叶片cdna，以cdna为模板，采用引物primer1和引物primer2进行pcr扩增，对扩增产物进行测序，测序结果如seqidno.2所示，其编码的蛋白质如seqidno.1所示。primer1：5'-atggcgacgccgtcgtcgttttc-3'；primer2：5'-ctatctgtccaataaccaattaag-3'。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为osgpa5蛋白，由710个氨基酸残基组成。将编码osgpa5蛋白的基因命名为osgpa5基因，其开放阅读框如seqidno.2所示。实施例2、osgpa5蛋白及其编码基因的应用一、基因组互补载体的构建将pcambia1305.1载体（参考文献：hegao,mingnajin,etal.,daystoheading7,amajorquantitativelocusdeterminingphotoperiodsensitivityandregionaladaptationinrice.procnatlacadsciusa,2014,111(46):16337-16342）的ecori和ncoi酶切位点之间的小片段替换为序列表中seqidno.3所示的双链dna分子（包括osgpa5基因上游2.6kb的启动子序列和下游2.7kb的终止子序列），得到pcambia1305.1-osgpa5基因组互补载体（已测序验证），pcambia1305.1载体图谱见图7。二、过表达转基因植物的获得1、将步骤一得到的pcambia1305.1-osgpa5过表达载体导入农杆菌eha105菌株（美国英俊公司），得到重组农杆菌。2、采用步骤1得到的重组农杆菌转化粳稻品种kitaake（野生型），具体步骤如下：（1）取步骤1得到的重组农杆菌菌体，采用n6液体培养基（sigma公司，c1416）重悬并调整菌液od600nm为0.5。（2）将培养至一个月的粳稻品种kitaake（野生型）成熟胚胚性愈伤组织在步骤（1）得到的菌液中侵染30min，滤纸吸干菌液后转入含有10g/l琼脂的固体n6培养基（sigma公司，c1416）中，24℃共培养3天；（3）将步骤（2）培养的愈伤组织接种在含有10g/l琼脂，100mg/l潮霉素的固体筛选n6固体培养基（sigma公司，c1416）上培养16天（第一次筛选）；（4）将步骤（3）培养后的健康愈伤组织接种在含有10g/l琼脂，100mg/l潮霉素的固体筛选n6培养基（sigma公司，c1416）上培养15天（第二次筛选）；（5）将步骤（4）培养后的健康愈伤组织接种在含有10g/l琼脂，100mg/l潮霉素的固体筛选n6培养基（sigma公司，c1416）上培养15天（第三次筛选）；（6）将步骤（4）培养后的健康愈伤组织接种在分化培养基（phytotechnologylaboratories公司，m524）上分化，得到t0代植株。3、对步骤2得到的t0代植株进行鉴定，提取待测植株叶片的总dna，采用引物primer3和引物primer4进行pcr扩增，对扩增产物进行测序，缺失位点后为双峰的为转基因阳性植株（结果如图6a所示）。primer3：5'-aattgcttgcttctccagtgac-3'；primer4：5'-cactcctccaaagcgttcct-3'。三、表型鉴定分别将t0代转pcambia1305.1-osgpa5植株，gpa5和野生型kitaake种植在中国农业科学院转基因试验田内。结果显示转基因株系t2种子中出现了透明的籽粒（图6b），sds-page检测透明种子（l1，l2和l3）与野生型表现一样。由此验证了转基因前的不透明粉质和谷蛋白前体增加性状是由osgpa5基因控制的，即该osgpa5基因为谷蛋白分选相关基因。将pcambia1305.1-osgpa5转化水稻gpa5突变体，可以使其成熟谷蛋白含量上升至正常水平（图6c）。<110>中国农业科学院作物科学研究所<120>一种植物谷蛋白分选相关蛋白osgpa5及其编码基因与应用<160>3<210>1<211>710<212>氨基酸<400>11matpssfssarkkapsppkhrhdgtsglpfgmdwspppkrwegrntiwphnpqtgwsycv61mipswiaqtpeasatadnflksivfyrihvgiqspegissshgvlrrfsdflklssdlkq121efprkgippappkhafsrinssrvlleerrnaleewmqkllsdielsrsapvaaflelea181aarsyyqdwnqrpsevgssakssadssprpdehgsgvlsessqmnsafahgngptgatgn241gmlgesildqpnerassmsnhrkknhvflehgvrngsidtykgvvseedhdsnpgharkd301saesigsdlsslrgselsvpgvssslwdgpvdlpsgidghsqteqftgldmqllydmdaq361iilpadqrpkltrllismdrrqvtaktdmedliarlnqevavkeylatkvkdleveleat421kkkdkeilhqavlterekitqlqwdkdelyrkysemesnlkieqnektrvqsekttasge481kemlleeletkrkeveslqqhigefeakskadikvlvkevkslrnsqkemkkvlnqyhee541ktelerivnrekqrstrarfsrekilhecrllrerlqectakfvadeqdtmtidlsslpd601aldlvttsdnrirllvaeaqllsrddeqgssddgdnsdgkssvtmssedayvtdeettkm661lsdllidnaqlrlrlnslirnavntavktekegsdgtvpkktvlnwlldr<210>1<211>2133<212>dna<400>21atggcgacgccgtcgtcgttttcgtcggcgaggaagaaggcgccgagcccgccgaagcac61cgccacgacggcacctccgggctgccgttcggcatggactggagcccgcccccgaagaga121tgggagggaaggaacaccatatggccacataaccctcaaaccggatggagttactgtgtg181atgattccttcttggatcgctcagacacctgaagctagtgcgactgctgacaacttcttg241aaatccatagttttttacaggatacatgttggtatacaatctccagaaggcatcagctct301agccacggagttcttcgaaggtttagtgactttctaaagttatcttctgatcttaagcag361gaatttcccagaaaaggaatcccccctgctccaccgaagcatgccttttcaagaataaat421tcaagcagggtgcttctagaagagagaaggaacgctttggaggagtggatgcaaaagcta481ctttctgacattgagttgtcgagaagtgcacctgttgctgcttttcttgagctggaagct541gctgcacgctcatattaccaagattggaatcagcgcccttctgaagtgggttcttcagca601aaaagtagtgcagattcttctccgcgtcctgatgaacatggttcaggtgttctctctgag661tccagtcaaatgaattcagcctttgctcatggtaacggtccgacaggagcaactggtaat721ggtatgctgggagagtctatcttagatcagcccaatgagcgggctagtagcatgtcaaat781cacaggaaaaagaaccatgtctttttggaacatggtgttaggaatggttccatagatact841tataagggagtggtttccgaagaggatcacgattctaaccctggccatgccaggaaggac901tctgctgaaagtataggaagtgatttgagttctttgaggggcagtgaattatcggttcct961ggagttagtagttccctttgggatggtcctgtggatcttccaagtggaattgatggacat1021agccaaacagaacaatttacaggtttagatatgcagcttttatatgatatggatgcacaa1081atcatccttcctgctgatcaaaggccgaagttgactagacttttgatcagcatggacaga1141agacaggtgacagcaaaaactgatatggaggatctcatagcacgactaaatcaggaagtg1201gctgtcaaagaatatcttgcgacaaaggtcaaagatttggaggttgagttggaagctacg1261aagaaaaaagacaaagagattctacatcaggctgttttgaccgaaagagagaaaattacc1321caacttcaatgggataaggatgagctctacaggaagtactctgaaatggagtcaaacctg1381aagattgaacaaaatgagaaaactcgtgtgcagtcagagaaaacaactgctagcggtgaa1441aaagaaatgttactggaagagctagaaactaaacgaaaagaagttgagagtttgcagcaa1501catattggagaattcgaggcaaagtctaaagcagatataaaagttcttgttaaagaggtg1561aaatctcttcggaactcccaaaaagagatgaagaaagtgctgaatcagtatcatgaggag1621aagactgaattagagaggattgttaacagggagaaacagcggtcaacacgtgcaaggttc1681tcccgtgaaaaaattcttcacgaatgcagactgctccgtgagcgtctacaggaatgtact1741gccaagtttgttgcagatgagcaagacactatgactattgatttatcatctttgcctgat1801gctttagatcttgtgacgacatcagacaatagaatacgtttgcttgttgctgaggctcaa1861cttctgtcacgagatgatgaacagggctcttctgatgatggtgataattctgatggtaaa1921tcctcagttaccatgagcagtgaagatgcatatgttactgatgaagagacaacaaaaatg1981ttatctgatctgcttattgacaatgcacaactgaggttgcgcttgaattctctcatccgt2041aatgctgtaaatactgctgtgaagacggagaaagaaggtagtgatggaaccgtgccaaaa2101aagacggtgcttaattggttattggacagatag<210>1<211>12681<212>dna<400>31cctgatatgtctgattaggcgtttgaacgcttgtttctcatattcttgtgagctgattga61ggatgtttatttctgtgcagggaactagctaaggatttcgttgtatcggggacagcatcg121gagtctctatatggtgcttgtgagtccatgtacaaaccaaacatggtatgcatttgtttg181tttgtatgatcacatttagcccgtgtaacattctttatgggataacatcatgggctatag241caatttcgcatttctgtttggatctgtataatatattataattctgttgcattgtactgt301ttagatttctaccactattttgaatgatagatgttacatgacaacatattatttttcttg361acaaaggaacctgaagaactctttgagactatctcacaagctctgcagtcatcagttgat421cgtgattgcctcagtggttggggaggctttgttctgcttgtgtaagttcacttcactaat481tcaagattggatgagtggcttcatttt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