一种微囊藻毒素的克级别的大规模提取纯化方法与流程

本发明属于天然生物质的资源化利用技术领域，更具体涉及一种利用天然产毒水华蓝藻这一生物量资源来大规模提取纯化克级单位的微囊藻毒素纯品的方法，尤其适用于以为克级单位的微囊藻毒素的大规模制备。

背景技术

近年来，国内多处重要水体藻类水华频发，已成为我国可持续性发展中迫切需要解决的关键科技问题之一。据资料统计，三峡库区蓄水至135m水位后，库区多条一级支流逐渐出现了不同程度水华现象。三峡水库的水华暴发呈现出时间提前、频次增多、范围扩大的趋势。至2017年三峡库区17条主要支流发生水华，三峡库区的水华现象早已成为一种经常性态势。水华的发生，不仅破坏了水体景观，而且水华消亡时消耗大量溶氧，可造成鱼虾等水生动物缺氧窒息死亡。更严重的是，多种藻类水华能产生微囊藻毒素和藻源异味物，直接影响到供水安全和人民群众健康。其中，2007年太湖由于产毒微囊藻水华大规模爆发，导致中国无锡市近200万人在一周内无水源饮用；2000年汉江硅藻水华导致给120万居民供水的武汉宗关水厂产生严重的取水危机。在国外，水华问题给美国造成的经济损失每年高达22-46亿美元。

鉴于藻类水华的巨大危害，捕捞水华藻类已被大量应用到水华控制工作中。当前大规模的蓝藻水华的打捞、捕获已作为一种常用的水华治理方法，在滇池、太湖中采用。而捕捞得到的水华藻类其中含量巨大生物量的微囊藻毒素，若不及时安全处置，势必将对环境造成二次污染。蓝藻水华捕获后的安全处置是一个不容忽视的问。另一方面，当前微囊藻毒素的检测和毒理学研究已逐渐普及，水体及水产品中微囊藻毒素含量的检测均有相应的国家标准。而相应作为高效液相色谱(hplc)检测标准样品的微囊藻毒素纯品的价格始终十分昂贵。如国内常用sigma公司的微囊藻毒素标准品，单一毒素变体的价格十分昂贵。微囊藻毒素标样昂贵的价格严重制约了毒素检测和相关毒理学研究在国内的普及。利用现有的产毒水华藻类资源，开展微囊藻毒素的大规模提纯技术，将这一环境污染物变废为宝，具重大的经济、社会价值。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种以天然产毒水华蓝藻为材料大量提取纯化微囊藻毒素的方法。方法易行，操作简便，有效的利用了天然产毒水华蓝藻的生物资源，将这一环境污染物变废为宝，该方法适用于克级单位微囊藻毒素的大规模制备，纯化得到的微囊藻毒素，高效液相色谱(hplc)检测的纯度>85％，可作为色谱标准样品使用，以及用于微囊藻毒素的毒理学实验中。

为达到上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种微囊藻毒素的克级别的大规模提取纯化方法，其步骤是：

a、野外水华藻类样品筛选：在产毒水华蓝藻严重爆发的水体，进行产毒微囊藻样品的预采集和筛选。野外产毒微囊藻样品的要求：显微镜镜检微囊藻优势度>98％；经分析型高效液相色谱(hplc)检测野外产毒微囊藻毒素的总含量>0.7‰(干重比)；高效液相色谱检测中，野外产毒水华微囊藻经分析，其微囊藻毒素不同异构体的出峰分离度良好，且毒素峰与相邻共存物出峰的分离度>1.5。

所述的产毒微囊藻样品为野外水华微囊藻群体，呈球形、长圆形，形状不规则网状或窗格状，微观或肉眼可见。群体无色、柔软而具有溶解性的胶被。细胞球形或长圆形，多数排列紧密；细胞淡蓝绿色或橄榄绿色，往往有气泡。自由漂浮于水中，或附着于水中的各种基质上。

b、样品采集、清洗、阴干、粉碎：上述步骤a野外产毒水华微囊藻样品用孔径50-100μm滤网采集至产毒水华蓝藻严重爆发的水体。采集的水华微囊藻样品除去杂物，用自来水冲洗3-5次。将处理后的藻样在塑料布上平摊均匀，温度控制在室温(20－25℃，以下相同)下，在通风避光的环境下自然阴干处理6-72h，研磨粉碎，制成粒径在50-200目的干藻粉。

c、毒素抽提：取干藻粉1.0kg，按1：15-1:40重量体积比添加0.1m磷酸缓冲液(ph为6.6－7.5)，室温下搅拌抽提3-6小时，用孔径50-100μm的尼龙筛绢滤布过滤，取滤液。滤渣再按1：10-1：20重量体积比添加0.1m磷酸缓冲液搅拌3-6小时，再次提取1-2次。孔径50-100μm的尼龙筛绢滤布过滤后，合并上述2-3次提取的全部滤液。

d、微过滤：经过1-5μm微滤、0.22-0.45μm微滤过滤，对滤液进行进一步的过滤。取微滤处理后澄清的滤过液。

e、超滤：上述步骤d滤过液采用截留分子量为1-10万的中空纤维超滤器(博纳bona-gm-058型)，在天利tl-bt-600t泵的作用下进行超滤处理。

由于提取液中微囊藻毒素的分子量为1000左右，且其易溶于水，在超滤的作用下，小分组的微囊藻毒素可快速通过超滤柱；各类杂蛋白大分子不能通过超滤柱。基于超滤的膜分离技术，通过超滤实现了基于分子大小的膜分离原理的物理方法对微囊藻毒素的快速分离纯化。

f、纯化、除杂质：将上述步骤e超滤的滤过液分别倒入实验用白瓷盘内，在室内通风、避光的条件下晾干处理6-48h。用蒸馏水将瓷盘内的毒素再次溶解。溶解后的液体用ods-c18反相固相萃取柱(agilentbondelutc18)继续纯化。用固相萃取柱(agilentbondelut)的c18填料10g填充制作固相萃取柱。填充好的固相萃取柱先用100ml的100％(v/v)甲醇活化，再用20ml蒸馏水平衡。

超滤滤过液每过1-3l后清洗c18柱。先用20ml的20％(v/v)甲醇淋洗c18柱，洗去杂质，再用20ml－40ml的90％(v/v)甲醇将毒素洗脱。如此反复2-4次过柱并洗脱毒素。将毒素的洗脱液在旋转蒸发器上蒸发干燥，得到微囊藻毒素的粗提物粉末。

g、制备型高效液相色谱(hplc)纯化：上述步骤f制备的微囊藻毒素的粗提物用5-20％(v/v)乙腈溶液(含0.1％tfa)溶解后，在制备型高效液相色谱(hplc)上，采用乙腈流动相、梯度淋洗技术进行纯化。收集毒素出峰中段，旋转蒸发器蒸干后再次加5-20％(v/v)乙腈(0.1％tfa)溶解，反复制备2-4次，收集包含毒素峰的高效液相色谱(hplc)纯化后溶液，旋转蒸发器上蒸发干燥后，即纯化得到色谱纯度>85％的微囊藻毒素的纯品。

在上述的7个步骤的技术措施中，其中野外水华藻类样品筛选步骤、样品采集清洗、阴干、粉碎步骤是本发明中最关键的步骤。

在藻类样品筛选中，必须科学选择微囊藻毒素产毒量高的微囊藻株，同时藻类样品微囊藻优势度>98％，毒素含量>0.7‰(干重比)。藻类样品筛选保证了后续纯化过程中毒素的分离效果和纯化程度。因为，在本发明中，采用了基于分子量大小膜分离技术的超滤纯化方法，如藻类样品的微囊藻优势度小、和微囊藻毒素含量低，则后续的分离效果难以保证。

在样品采集清洗、阴干、粉碎步骤中，不仅仅要仔细将藻类样品与大量的野外杂质小心分离，同时要求在避光、合适的温度下除去样品中水分的同时避免毒素的降解。最后，藻类样品必须处理成足够细的颗粒，以最大程度增加其颗粒物表面积，为后续毒素抽提的高效率提供良好保证。

本发明主要解决的技术问题和难点：

本发明解决了野外水体广泛存在的产毒水华这一天然环境污染物的生物资源处置技术问题和技术难点。

本发明主要达到的技术效果：

本发明主要达到的技术效果是：利用野外水体广泛存在的产毒水华这一环境污染物，将其变废为宝来提取纯化微囊藻毒素纯品，实现了以克级单位微囊藻毒素的大规模制备，适用于微囊藻毒素制备的工厂化操作。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

①本发明利用野外天然产毒微囊藻的生物量来批量制备微囊藻毒素，有效将水华蓝藻这一环境污染物变废为宝，具有巨大的经济社会价值；

②本发明适合于开展以克为单位微囊藻毒素的大规模纯化和制备，生产效率高，可进行大规模工厂化生产。而当前传统的微囊藻毒素制备仅仅为微克级，个别方法也仅能达到毫克级。

③本发明采用的步骤简单，提取过程中大量采用了基于膜分离的微滤、超滤等物理分离技术，避免了对环境造成二次污染。

附图说明

图1为一种微囊藻毒素的大规模提取纯化方法的工艺流程图。

其中，1－野外水华藻类样品筛选；2－样品采集清洗、阴干粉碎；3－毒素抽提；4－微滤；5－超滤；6－纯化除杂质；7－制备型hplc纯化。

具体实施方式

实施例1：

一种以天然产毒水华蓝藻为材料大量提取纯化微囊藻毒素的方法，其步骤是：

a、野外水华藻类样品筛选1：选择产毒水华蓝藻严重爆发的池糖，进行产毒微囊藻样品的预采集和筛选。野外产毒微囊藻样品的要求：显微镜镜检铜绿微囊藻的优势度>99％；在本实施例中，经分析型高效液相色谱(hplc)检测野外产毒微囊藻毒素的总含量>0.97‰(g/g干重)。其中，微囊藻毒素异构体mc-rr含量0.81‰，相当于含mc-rr1.62g，mc-lr含量0.16‰，相当于含mc-lr0.32g。野外产毒微囊藻样品的毒素峰的分离度良好，毒素峰与相邻共存物出峰的分离度>1.5。

b、样品采集清洗、阴干粉碎2：用孔径50μm滤网从上述水体中采集符合要求的野外产毒水华微囊藻。采集的水华微囊藻样品除去杂物，用自来水冲洗3或4或5次。将处理后的藻样在塑料布上平摊均匀，在通风、避光、温度<25℃的环境下自然阴干，研磨粉碎，制成粒径<100目的干藻粉。

c、毒素抽提3：在本实施例中，取干藻粉2.0kg，按1：20重量体积比添加0.1m磷酸缓冲液(ph＝6.8)，室温下搅拌抽提4小时，用孔径50μm的尼龙筛绢滤布过滤，取滤液。滤渣再按1：10重量体积比添加0.1m磷酸缓冲液搅拌4小时，提取1次。孔径50μm的尼龙筛绢滤布过滤后，合并2次提取的滤液。

d、微滤4：在压力泵的作用下，滤布的滤液依次经5μm微滤、0.45μm微滤过滤，进行进一步的过滤。取微滤处理后澄清的滤过液。

e、超过滤5：上述步骤d滤过液采用截留分子量为10万的中空纤维超滤柱(博纳bona-gm-058型)，在天利tl-bt-600t泵的作用下进行超滤处理。由于提取液中微囊藻毒素的分子量为1000左右，且其易溶于水，在超滤的作用下，小分组的微囊藻毒素可快速通过超滤柱；各类杂蛋白大分子不能通过超滤柱。基于超滤的膜分离技术，实现了基于分子大小的膜分离原理的物理方法对微囊藻毒素的快速分离纯化。至超滤滤过液的流速明显减慢为止停止超滤，取超滤滤过液进行微囊藻毒素的进一步纯化。

f、纯化、除杂质6：在本实施例中，2.0kg干藻粉经上述提取、过滤、微过滤、超过滤处理后，得到40-80l超滤的滤过液。将上述步骤e滤过液分别倒入一批实验用白瓷盘内，在室内通风、避光的条件下晾干。用蒸馏水将瓷盘内的毒素再次溶解。溶解后的液体用agilentbondelut的反相硅胶固相萃取c18柱继续纯化。用agilentbondelutc18填料10g，填充并制作固相萃取柱。填充好的固相萃取柱先用100ml的100％(v/v)的甲醇活化，再用20ml蒸馏水平衡。

每过约1l液体后清洗c18柱，先用20ml的20％(v/v)甲醇淋洗c18柱，洗去杂质，再用20ml－40ml的90％(v/v)甲醇将毒素洗脱。如此反复过柱并洗脱毒素2-4次。将毒素的洗脱液在旋转蒸发器上蒸发干燥，得到微囊藻毒素的粗提物粉末。

g、制备型高效液相色谱(hplc)纯化7：上述步骤f制备的微囊藻毒素的粗提物用10％(v/v)乙腈(0.1％tfa)溶解后，用制备型高效液相色谱(hplc)，采用乙腈流动相、梯度淋洗技术进行纯化。收集毒素出峰的中段，旋转蒸发器蒸干后再次加10％(v/v)乙腈(0.1％tfa)溶解，反复制备两次以上五次以下，收集包含毒素峰的高效液相色谱(hplc)纯化后溶液，旋转蒸发器上蒸发干燥后，即纯化得到色谱纯度>85％的微囊藻毒素的纯品。

经高效液相色谱(hplc)检测，在本实施例中，从2.0kg干藻粉中共提纯得到微囊藻毒素mc-rr达1.056g，此外提纯得到微囊藻毒素mc-lr也达0.159g。共提取得到色谱纯度均大于85％的微囊藻毒素mc-rr和mc-lr达1.215g，实现了微囊藻毒素克级别的大规模纯化制备。

总之，本发明的实施，可充分利用野外产毒蓝藻水华这一天然生物质资源，开展以为克级单位的微囊藻毒素的大规模制备，适用于微囊藻毒素制备的工厂化操作，具有良好的应用价值。