专利名称：：一种基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-lr的方法
技术领域：
：—种基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR(MC-LR)的方法，属于免疫分析化学
技术领域：
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背景技术：
：随着经济的发展，含有大量的氮、磷营养物质的污水进入湖泊、水库使水体富营养化，致使藻类异常增殖，释放次级代谢物藻毒素(AlgaeToxins)，威胁人类的饮用水的安全和水体中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins，MCs)分布最广、危害最大，其结构如下(6)D-Glu(iso)(7)dehydroAla(l)D-AlaOCOOH(2)variableC3)D-Asp(iso)其含有五个固定成分的氨基酸，两个可变的氨基酸X、Y。即在上述的结构式中其中X和Y分别为Leu和Arg的即为MC-LR。MC-LR是最为常见且毒性又最大的一种微囊藻毒素，世界卫生组织(WHO)推荐的饮用水中的MC-LR的最大残留限量为1.0yg/L，我国现颁布执行的生活饮用水水质卫生规范(2001，0.OOlmg/L)和地表水环境质量标准(GB3838-2002,微囊藻毒素-LR，O.001mg/L)，因此急需建立针对MC-LR检测的一种快速、简单、灵敏、省力的检测方法。常用的检测藻毒素的方法主要有仪器分析方法、生物化学法及免疫检测法等几大类。仪器分析方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、质谱、液质联用等，这些方法虽然灵敏但其需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。生物化学法主要是蛋白磷酸酶抑制试验法，优点是快速，数小时即可实现对大量样品的检测，但其最大的不足之处在于特异性蛋白磷酸酶等没有商品供应、特异性差。免疫分析化学方法具有快速，灵敏度高，操作简单，专一性好等优点。
发明内容本发明的目的是提供一种基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素(MC-LR)的方法，灵敏度高，操作方便，线性范围宽。4本发明的技术方案一种基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法，包括包被原的修饰，抗体的修饰，修饰的包被原和金纳米棒的偶联，修饰的抗体和金纳米棒的偶联，反应条件的优化，抑制曲线的测定，实际样本检测；(1)包被原的修饰将微囊藻毒素-LR包被原与硫辛酸相偶联得到修饰的包被原；(2)抗体的修饰将抗微囊藻毒素-LR抗体与硫辛酸相偶联得到修饰的抗微囊藻毒素-LR抗体；(3)用步骤(1)得到的修饰的包被原与金纳米棒的端面偶联得到金纳米棒_包被原探针；(4)用步骤(2)得到的修饰的抗微囊藻毒素-LR抗体与金纳米棒的端面偶联得到金纳米棒_抗体探针；(5)对抑制反应的各个条件进行优化；(6)标准曲线的建立利用间接竞争免疫检测原理，将微囊藻毒素-LR和(3)金纳米棒-包被原探针同时加入到一个离心管中，而后向离心管中加入(4)金纳米棒-抗体探针，混匀，通过微囊藻毒素-LR和金纳米棒_包被原探针与金纳米棒_抗体探针进行竞争偶联，通过微囊藻毒素-LR浓度的不同会使形成的粒子形成不同的粒径分布，通过纳米粒度仪检测粒径的变化从而检测微囊藻毒素-LR的浓度，建立粒径-微囊藻毒素-LR浓度的标准曲线。(7)检测样品中微囊藻毒素-LR的浓度。包被原的修饰①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，与0.2mL的微囊藻毒素-LR包被原溶液混合；②将75iiL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入步骤①所述溶液中后室温反应4h;③用pH7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换液3次；④将修饰后的包被原放在4t:备用。抗体的修饰①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，与0.4mL抗微囊藻毒素-LR抗体混合；②将75iiL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入步骤①所述溶液中后室温反应4h;③用pH7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换3次透析液；④将修饰后的抗体放在fC备用。金纳米棒-抗体探针的制备采用晶种生长法合成金纳米棒，再经过7500rpm离心15min去除金纳米棒溶液中多余的Vc、AgN03和小的球形粒子金纳米棒后，利用pH3.8、含有0.1%聚乙二醇PEG20000的0.005mol/L十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液进行重悬；重悬液用lmol/LHCl调整至pH3.8;重悬液中的金纳米棒称之为金纳米棒GNRs，在金纳米棒的制备过程中CTAB起着非常关键的作用。CTAB主要是分布在金纳米棒的侧面从而金纳米棒的侧面带有正电荷，而金纳米棒的端面的分布很少，因此采用硫辛酸修饰的抗体会修饰到金纳米棒的端面而非侧面上。0.5mL2nmol/L重分散的金纳米棒GNRs溶液逐滴滴加到由50iiL稀释到lmL的硫酸锌修饰的微囊藻毒素-LR抗体的稀释液中，室温搅拌反应4h，反应结束后6000rpm离心10min，运用pH3.8、含有0.1%PEG20000的lmL0.005mol/LCTAB的溶液进行重分散，用该溶液洗涤两遍，最后用pH3.8、含有0.1%PEG20000的50yL0.005mol/LCTAB的溶液进行重分散，此偶联物置于4。C保存。金纳米棒-包被原探针的制备包被原和金纳米棒的偶联与(3)抗体和金纳米棒的偶联操作相同，只是在包被原的量上有区别，即加入的包被原60yL用pH3.8、含有0.1%PEG20000的940iiL0.005mol/LCTAB的溶液进行稀释。将pH3.8、0.5mL、2nmol/L重悬后的金纳米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修饰的微囊藻毒素-LR包被原的稀释液中，室温搅拌反应4h，反应结束后6000rpm离心10min，运用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液lmL中进行重分散，用该溶液洗涤两遍，最后用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液50yL进行重分散，此偶联物置于4t:保存；抑制反应条件的优化a)金纳米棒-抗体(GNR-Ab)与金纳米棒_包被原(GNR-Ag)的配比GNR-Ab与GNR-Ag的配比采用了3:1，2:l，l:l，l:2和1:3进行优化，通过动态光散射仪测定的最大的粒径作为该条件的最优条件，最终i:i的配比所得到的纳米链的粒径最大，因此选择1:1作为GNR-Ab与GNR-Ag的最佳配比；b)反应时间的优化—般来说，随着反应时间的延长纳米链的长度会变长，但是金纳米棒的聚合度到了一定的聚合程度，纳米链的长度随着反应时间的延长变化就不是非常明显，并且反应时间过长也会导致检测不是非常灵敏。因此，选用15min，30min和lh最为抑制反应时间的优化条件，通过测定形成的纳米链的粒径可以得出30min的纳米链的粒径和lh的粒径变化程度不是很大并且30min反应时间短故而采用30min作为抑制试验最佳的反应时间。c)反应温度的变化温度对于抗体和抗原反应有比较大的影B向，因此对于反应温度进行了优化，选用4t:，25t:和37t:反应30min作为反应温度优化条件。通过实验结果可知37。C形成的纳米链的长度最长，因而采用37t:作为最佳反应温度。标准曲线的建立通过测定纳米链的粒径可以建立基于金纳米棒探针的端面与端面相互连接的针对微囊藻毒素-LR的检测方法，步骤为①向离心管中加入20iiL的GNR-Ag后加入用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液稀释的0.01，0.05，0.1，1，10，50，100ng/mL的微囊藻毒素-LR后混匀，按照与GNR-Ag与GNR-Ab的体积比为1:1加入GNR-Ab混匀，放入37°C反应30min。②反应结束，取10iiL的反应液加入pH3.8、含有0.1%PEG20000的990yL的0.005mol/LCTAB溶液稀释，混匀。静置2分钟，用动态光散射仪DLS测定该反应液的粒子的粒径，重复两次。运用MC-LR的浓度作为横坐标，纳米链的粒径作为纵坐标建立抑制标准曲线。检测样品中微囊藻毒素-LR的浓度步骤为①向离心管中加入20iiL的GNR-Ag后加入用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液稀释的含微囊藻毒素_LR的样品液后混匀，按照与GNR-Ag与GNR-Ab的体积比为1:1加入GNR-Ab混匀，放入37。C反应30min;②反应结束，取10iiL的反应液加入pH3.8、含有0.1%PEG20000的990iiL的0.005mol/LCTAB溶液稀释，混匀。静置2min，用动态光散射仪测定该反应液的粒子的粒径，重复两次；根据所测得的粒径值对照标准曲线求出样品液中微囊藻毒素-LR的含量。本发明的有益效果与传统的ELISA方法相比，本发明利用晶种生长法合成的金纳米棒分别与微囊藻毒素的包被原和抗微囊藻毒素的抗体相连，在液体的环境下金纳米棒偶联抗体和金纳米棒偶联包被原反应形成纳米链，微囊藻毒素可以和金纳米棒偶联的包被原进行竞争结合金纳米棒偶联抗体的结合位点，因此微囊藻毒素的含量会影响纳米链的长度。故通过动态光散射测定液体环境中的纳米链的粒径分布来测定微囊藻毒素的含量。本发明只在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反应，简化了反应的条件，减轻劳动强度，提高了检测的灵敏度。图1微囊藻毒素检测的标准曲线。具体实施例方式实施例1(1)包被原修饰包被原的修饰采用碳二亚胺法进行硫辛酸和包被原的结合，具体操作步骤如下①0.3mL的硫辛酸的乙醇溶液(含硫辛酸1.625mg)与0.2mL的包被原溶液混合。②将75iiL的含碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述溶液中后室温反应4h。③用pH值7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换液3次。④将修饰后的包被原放在fC备用。(2)抗体修饰①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液(含硫辛酸1.625mg)与0.4mL的抗体混合。②将75iiL的碳二亚胺在磁力搅拌下逐滴滴入上述溶液中，室温反应4h。③用pH7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换3次透析液。④将修饰后的抗体放在fC备用。(3)抗体和金纳米棒端面偶联采用晶种生长法合成金纳米棒首先要经过7500rpm离心15min去除溶液中多余的Vc、AgN03和小的球形粒子金纳米棒后，利用pH3.8、0.005mol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)含有O.1%聚乙二醇(PEG20000)的溶液进行重悬。重悬液的pH值用lmol/LHC1的进行调整。在金纳米棒的制备过程中CTAB起着非常关键的作用。CTAB主要是分布在金纳米棒的侧面从而金纳米棒的侧面带有正电荷而金纳米棒的端面的分布很少，因此采用硫辛酸修饰的抗体会修饰到金棒的端面而非侧面上。0.5mL、2nmol/L重分散的GNRs逐滴滴加到由50iiL修饰后抗体稀释到lmL的抗体的稀释液。室温搅拌反应4h。反应结束后6000rpm离心10min，运用lmL的0.005MCTAB(pH3.8)含有0.1%PEG的溶液进行重分散。用该溶液洗涤两遍。最后用50iiL的0.005mol/LCTAB(pH3.8)含有0.1%PEG20000的溶液进行重分散。此偶联物置于4t:保存。(4)包被原和金纳米棒端面偶联包被原和金纳米棒的偶联与(3)抗体和金纳米棒的偶联相似，只是在包被原的量上有区别，即加入的包被原60iiL用940iiL的0.005mol/LCTAB(pH3.8)含有0.1%PEG20000的溶液进行稀释。将pH3.8、0.5mL、2nmol/L重悬后的金纳米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修饰的微囊藻毒素-LR包被原的稀释液中，室温搅拌反应4h，反应结束后6000rpm离心lOmin，运用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液lmL中进行重分散，用该溶液洗涤两遍，最后用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液50yL进行重分散，此偶联物置于4t:保存；(5)抑制试验反应条件的优化抑制试验受到了许多条件的影响，在此我们对影响抑制试验最大的三个条件进行了优化即GNR-Ab与GNR-Ag的配比，抑制试验反应时间，反应温度。a)GNR-Ab与GNR-Ag的配比GNR-Ab与GNR-Ag的配比采用了3:1，2:l，l:l，l:2和1:3进行优化，通过动态光散射仪测定的最大的粒径作为该条件的最优条件。最终i:i的配比所得到的纳米链的粒径最大，因此选择1:l作为GNR-Ab与GNR-Ag的最佳配比。b)反应时间的优化—般来说，随着反应时间的延长纳米链的长度会变长，但是金纳米棒的聚合度到了一定的聚合程度，纳米链的长度随着反应时间的延长变化就不是非常明显并且反应时间过长也会导致检测不是非常灵敏。因此，选用15min，30min和lh最为抑制反应时间的优化条件，通过测定形成的纳米链的粒径可以得出30min的纳米链的粒径和lh的粒径变化程度不是很大并且30min反应时间短故而采用30min作为抑制试验最佳的反应时间。c)反应温度的变化温度对于抗体和抗原反应有比较大的影响因此对于反应温度进行了优化选用4t:，25t:和37t:反应30min作为反应温度优化条件。通过实验结果可知37。C形成的纳米链的长度最长，因而采用37t:作为以后进一步实验的反应条件。(6)标准曲线的建立微囊藻毒素-LR(995.2Da)作为一个小分子不可能被两个抗体分子进行识别。当GNR-Ab和GNR-Ag混合时，由于抗体抗原反应导致金纳米棒发生自组装形成长的纳米链。当加入微囊藻毒素MC-LR时。MC-LR就会与包被原竞争抗体的结合位点导致GNR-Ab不能两端同时与GNR-Ag发生免疫反应，因此MC-LR的浓度会影响纳米链的长度，通过测定纳米链的粒径可以建立基于金纳米棒探针的端面端面相互连接的针对MC-LR的检测方法，具体的步骤为①向离心管中加入20iiL的GNR-Ag后加入用0.005mol/LCTAB(pH3.8)含有0.1%PEG20000的溶液稀释的0.01，0.05，0.1，1，10，50，100ng/mL的微囊藻毒素后混匀，按照与GNR-Ag与GNR-Ab的体积比为1:1加入GNR-Ab混匀，放入37。C反应30min。②反应结束，取lOiiL的反应液加入990iiL的0.005mol/LCTAB(pH3.8)含有0.1%PEG20000的溶液稀释，混匀。静置2分钟，用DLS测定该反应液的粒子的粒径，重复两次。运用MC-LR的浓度作为横坐标，纳米链的粒径为纵坐标建立抑制标准曲线。(7)实际样本的检测。实际样本是来自无锡不同区域的太湖水。我们通过对实际样本的添加回收率实验来验证本方法的可靠性。太湖水中的含有的原始的微囊藻毒素通过传统的ELISA进行测定。在搅拌的条件下添加微囊藻毒素MC-LR标准品至预先采集的实际样本太湖水中，添加的浓度为0.05，0.l，O.5，1，2.5，5ng/mL。添加后将太湖水在4摄氏度静置两个小时以达到水中藻毒素的含量达到一致。而后通过本专利建立的检测方法测定MC-LR的浓度计算回收率。通过对数据分析得到回收率在92.21%和109.38%之间。两组平行试验的变异系数均小于3.73%。通过这个结果可以得出本专利建立的检测方法是可行的并且简单、快速和省力的一种方法。表1实际样本检测即添加回收率实验。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1原始浓度采用传统的ELISA方法测定。2检测浓度通过标准曲线计算得到。权利要求一种基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于包括包被原的修饰，抗体的修饰，修饰的包被原和金纳米棒的偶联，修饰的抗体和金纳米棒的偶联，反应条件的优化，抑制曲线的测定，实际样本的检测；(1)包被原的修饰将微囊藻毒素-LR包被原与硫辛酸相偶联得到修饰的包被原；(2)抗体的修饰将抗微囊藻毒素-LR抗体与硫辛酸相偶联得到修饰的抗微囊藻毒素-LR抗体；(3)用步骤(1)得到的修饰的包被原与金纳米棒的端面偶联得到金纳米棒-包被原探针；(4)用步骤(2)得到的修饰的抗微囊藻毒素-LR抗体与金纳米棒的端面偶联得到金纳米棒-抗体探针；(5)对抑制反应的各个条件进行优化；(6)标准曲线的建立利用间接竞争免疫检测原理，将微囊藻毒素-LR和(3)金纳米棒-包被原探针同时加入到一个离心管中，而后向离心管中加入(4)金纳米棒-抗体探针，混匀，通过微囊藻毒素-LR和金纳米棒-包被原探针与金纳米棒-抗体探针进行竞争偶联，通过微囊藻毒素-LR浓度的不同会使形成的粒子形成不同的粒径分布，通过纳米粒度仪检测粒径的变化从而检测微囊藻毒素-LR的浓度，建立粒径-微囊藻毒素-LR浓度的标准曲线；(7)检测样品中微囊藻毒素-LR的浓度。2.根据权利要求1所述的基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征是包被原的修饰①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，与0.2mL的微囊藻毒素-LR包被原溶液混合；②将75i！L的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入步骤①所述溶液中后室温反应4h;③用pH7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换液3次；④将修饰后的包被原放在4t:备用。3.根据权利要求1所述的基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征是抗体的修饰①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，与0.4mL抗微囊藻毒素-LR抗体混合；②将75iiL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入步骤①所述溶液中后室温反应4h;③用pH7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换3次透析液；④将修饰后的抗体放在4t:备用。4.根据权利要求1所述的基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征是金纳米棒_抗体探针的制备采用晶种生长法合成金纳米棒，再经过7500rpm离心15min去除金纳米棒溶液中多余的Vc、AgN03和小的球形粒子金纳米棒后，利用pH3.8、含有0.1%聚乙二醇PEG20000的0.005mol/L十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液进行重悬；重悬液用lmol/LHC1调整至pH3.8;0.5mL、2nmol/L重分散的金纳米棒GNRs溶液逐滴滴加到由50L稀释到lmL的硫酸锌修饰的微囊藻毒素-LR抗体的稀释液中，室温搅拌反应4h，反应结束后6000rpm离心10min，运用pH3.8、含有0.1%PEG20000的lmL0.005mol/LCTAB的溶液进行重分散，用该溶液洗涤两遍，最后用pH3.8、含有0.1%PEG20000的50yL0.005mol/LCTAB的溶液进行重分散，此偶联物置于4。C保存。5.根据权利要求1所述的基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征是金纳米棒-包被原探针的制备包被原60iiL用pH3.8、含有0.1%PEG20000的940iiL、0.005mol/LCTAB的溶液进行稀释；将pH3.8、0.5mL、2nmol/L重悬后的金纳米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修饰的微囊藻毒素-LR包被原的稀释液中，室温搅拌反应4h，反应结束后6000rpm离心10min，运用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液lmL中进行重分散，用该溶液洗涤两遍，最后用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液50yL进行重分散，此偶联物置于4t:保存。6.根据权利要求1所述的基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征是抑制反应条件的优化a)金纳米棒_抗体GNR-Ab与金纳米棒-包被原GNR-Ag的配比选择1:1作为GNR-Ab与GNR-Ag的最佳配比；b)反应时间的优化采用30min作为抑制试验最佳的反应时间；c)反应温度的变化采用37t:作为最佳反应温度。7.根据权利要求1所述的基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征是标准曲线的建立通过测定纳米链的粒径可以建立基于金纳米棒探针的端面与端面相互连接的针对微囊藻毒素-LR的检测方法，步骤为①向离心管中加入20iiL的GNR-Ag后加入用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液稀释的0.01，0.05，0.1，1，10,50，100ng/mL的微囊藻毒素-LR后混匀，按照与GNR-Ag与GNR-Ab的体积比为1:1加入GNR-Ab混匀，放入37°C反应30min;②反应结束，取10iiL的反应液加入pH3.8、含有0.1%PEG20000的990yL的0.005mol/LCTAB溶液稀释，混匀。静置2分钟，用动态光散射仪测定该反应液的粒子的粒径，重复两次；运用MC-LR的浓度作为横坐标，纳米链的粒径作为纵坐标建立抑制标准曲线。8.根据权利要求1所述的基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征是检测样品中微囊藻毒素-LR的浓度步骤为①向离心管中加入20iiL的GNR-Ag后加入用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液稀释的含微囊藻毒素_LR的样品液后混匀，按照与GNR-Ag与GNR-Ab的体积比为1:1加入GNR-Ab混匀，放入37。C反应30min;②反应结束，取10iiL的反应液加入pH3.8、含有0.1%PEG20000的990yL的0.005mol/LCTAB溶液稀释，混匀。静置2min，用动态光散射仪测定该反应液的粒子的粒径，重复两次；根据所测得的粒径值对照标准曲线求出样品液中微囊藻毒素-LR的含量。全文摘要一种基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法，属于免疫分析化学
技术领域：
。本发明以金纳米棒的端面与微囊藻毒素包被原及抗微囊藻毒素抗体分别偶联形成金纳米棒的探针，利用合成的金纳米棒探针与微囊藻毒素-LR进行免疫反应从而由于金纳米棒端面的抗原抗体反应形成纳米链，通过纳米链的粒径的变化达到检测微囊藻毒素-LR的目的。本发明是在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反应，简化了反应的条件，减轻劳动强度，提高了检测的灵敏度。文档编号G01N33/531GK101699288SQ20091003579公开日2010年4月28日申请日期2009年10月16日优先权日2009年10月16日发明者刘丽强,徐丽广,徐乃丰,朱颖越,胥传来,许定华,陈伟,马伟申请人:江南大学