一种可降解聚合物纳米微囊的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种可降解聚合物纳米微囊的制备方法及其应用。以丙烯酸类为单体，通过回流沉淀先制备未交联聚合物纳米微球，然后以含二硫键的N,N’-双(丙烯酰)胱胺为交联剂，在未交联聚合物纳米微球表面通过回流沉淀包覆一层二硫键交联聚合物壳层，将制备的核壳复合微球转移至乙醇或水中刻蚀未交联的聚合物内核，便可制备单分散性的可降解的纳米聚合物纳米微囊，本制备方法快速，后处理简单，且不需要经过强酸或者强碱刻蚀，安全高效。制备的聚合物纳米微囊经冻干处理后，可负载抗癌药物阿霉素，然后在其空腔内进一步填充具有超声响应的全氟己烷，可有效地用作超声造影剂和药物载体。造影剂可在谷胱甘肽或二硫苏糖醇还原剂的存在下快速降解成很低分子量的线性分子(Mn<5000)。
【专利说明】一种可降解聚合物纳米微囊的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备新型可降解的聚合物纳米微囊的制备方法，及其在超声造影剂和药物载体方面应用，属于新材料及生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]超声成像(US)技术利用超声波在人体组织界面发生的反射和散射信号强弱差异来传递生物内部信息，从而达到诊断的技术，是目前全世界应用最广泛的影像技术之一。由于低强度超声对人体组织产生损伤小，具有安全、适用面广、实时、可反复检查、对软组织鉴别能力强、灵活性高及价廉等优点，使超声图像诊断成为医学图像诊断的首选技术。但是，与CT成像、磁共振成像相比，超声成像的灵敏度和分辨率都很低，当两个软组织界面具有相似的声学阻抗时，两者之间的反射回声十分相近，因此仅采用超声诊断技术本身很难辨别健康组织和病变组织，需加入超声造影剂来增强病变部位和正常组织超声图像问的对比度，提高诊断的准确性。超声造影剂(Ultrasound contrast agents, UCAs)理论上包括一切能够引起超声波回波增强的物质，目前研究的超声造影剂主要是指包裹气体的微气泡造影剂。超声微气泡造影剂一般是指直径在1-10 Pm的包膜气泡，是良好的超声波反射介质，具有比其他液体或固体粒子高几个数量级的压缩性，对超声波具有高的声学响应，可产生强散射。在诊断超声频率下(1-15MHZ)，微气泡在血管或病灶部位聚集后发生共振，产生比生物组织更强的回波信号，从而明显提高超声诊断图像的分辨率、敏感度和特异性。但临床用的超声造影剂均为微米级的微泡，粒径过大，无法有效进入癌变等疾病部位，不利于疾病的检测。因此，制备 纳米级的超声造影剂成为现在的研究热点。然而，最近合成的纳米级造影剂多为SiO2等不可降解的微泡，容易在体内积累造成毒副作用。因此，为了临床应用，制备纳米级可降解的超声造影剂成为现阶段研究的难点。超声造影剂除了在组织灌注和肿瘤检测等方面的应用外，在进行微气泡表面修饰靶向特异性分子实现分子显影以及装载药物、基因实现药物、基因靶向治疗等方面发挥了越来越重要的作用。但是，报道的超声造影剂通常载药量过低，不利于其治疗效果，因此制备高载药量的超声造影剂也是十分关键的问题。
【发明内容】
[0003]为了克服现有技术所存在的问题，本发明在于提供一种可降解聚合物纳米微囊的制备方法及其应用。
[0004]本发明提出的可降解聚合物纳米微囊的制备方法，具体步骤如下:
(1):在溶剂中加入聚合单体和引发剂，进行回流沉淀反应，其中单体与引发剂重量比为100:1-100:10，控制反应温度为60-160°C，反应时间为0.5_24h ;反应结束后离心除去溶剂和未反应单体，用乙腈反复洗涤3-5次，真空烘箱内45°C干燥24 h,即得到未交联的聚合物纳米微球；
(2):将步骤(1)得到的未交联的聚合物纳米微球，加入聚合单体、引发剂和二硫键交联剂，在溶剂中进行回流沉淀反应，其中未交联聚合物微球与聚合单体的重量比为1:
0.1-1:20，聚合单体与引发剂的重量比为100:1-100:10，聚合单体与二硫键交联剂的重量比为100:5-100:150，控制反应温度为60-160°C，反应时间为0.5_24h ;在步骤⑴得到的未交联的聚合物纳米微球外面包覆一层二硫键交联的聚合物壳层；离心除去溶剂和未反应原料，用乙腈反复洗涤3-5次，真空烘箱内45°C干燥24 h,即得到形成核壳结构的聚合物纳米微球；
(3):将步骤⑵得到的核壳结构的聚合物纳米微球加入到刻蚀溶剂中，刻蚀去除未交联的聚合物内核，用水反复离心洗涤3-5次，真空冻干，即得到形成纳米级的二硫键交联的可降解的聚合物纳米微囊。[0005]本发明中，步骤⑴和步骤(2)所用聚合单体为甲基丙烯酸(英文名称:Methacrylic acid，简称:MAA)、丙烯酸(英文名称:Acrylic acid,简称:AA)、N_2_ 轻丙基-甲基丙烯酰胺(英文名称:Hydroxypropyl methacrylate,简称:HPMA)、轻乙基甲基丙烯酸酯(英文名称:2_Hydroxyethyl methacrylate,简称:HEMA)、乙烯基吡唳(Vinylpyridine)、乙烯基咪(Vinylimidazole)> N-乙烯基吡咯烧酮(Ar-VinyPyrroIidone)、N-乙烯己内酰胺(英文名称:Vinyl caprolactam,简称:VCL)或N-异丙基丙烯酰胺(英文名称:Ar-1sopropyl acrylamide ,简称:NIPAM)中任一种,或可以均聚，或者它们之间以不同组合共聚。
[0006]本发明中，步骤⑴和步骤(2)所用引发剂为偶氮二异丁腈(英文名称:Azodiisobutyronitrile,简称:AIBN)、偶氮二异戍臆(英文名称:2，2’ -Azobis-(2-methylbutyronitrile),简称:AMBN)、偶氮二异庚臆(英文名称:2，2’ -Azobis-(2, 4-dimethylvaleronitrile),简称:ADVN)或过氧化二苯甲酰(英文名称:Benzoyl peroxide,简称:ΒΡ0)等中任一种。
[0007]本发明中，步骤(2)中所用的二硫键交联剂为含二硫键的二烯类单体，如N，N’-双(丙烯酰)胱胺(英文名称:N, N-Bis (acryloyl) cystamine,简称:BACy)。
[0008]本发明中，步骤(1)和步骤(2)中回流沉淀所用溶剂为单一溶剂或混合溶剂，所述单一溶剂为乙腈、乙醇、水、四氢呋喃、甲基异丁基酮或甲苯中任一种；所述混合溶剂为不同比例的乙腈一乙醇、乙腈一四氢呋喃、乙腈一水、乙醇一甲苯或甲基异丁基酮一乙腈的组合物中任一种。
[0009]本发明中，步骤(3)中所述刻蚀溶剂为乙醇或水中任一种。
[0010]本发明中，所述含二硫键的二烯类单体浓度为0.01 wt %-50 wt%。
[0011]利用本发明方法制备得到的聚合物纳米微囊大小为50-1000 nm，聚合反应体系壳层交联度为5%到60%之间，具有良好的单分散性。
[0012]利用本发明方法制备得到的聚合物纳米微囊在超声造影剂和药物载体方面应用。
[0013]本发明中，所述药物载体为抗癌药物阿霉素。
[0014]本发明中，所述超声造影剂采用的超声响应物为全氟已烷。
[0015]利用本发明方法制备得到的聚合物纳米微囊作为超声造影剂采用还原剂降解，降解的测试条件为:在25 mL的单口烧瓶里加入5 mg的聚合物纳米微囊和10 mL的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)，然后加入10 mM的还原剂，然后放入恒温摇床(200 rpm摇速，37.5°C)匀速振荡。所述还源剂为二还原型谷胱甘肽(GSH)或二硫苏糖醇(DTT)。[0016]载药的条件为:50 mg的聚合物纳米微囊和30 mg盐酸阿霉素，超声分散在100 mL的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)中，磁力搅拌24h，然后离心移去上清液，用磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)洗涤3次除去表面吸附的阿霉素，即得物理负载阿霉素的聚合物纳米微囊。
[0017]填充全氟己烷的条件:50 mg负载阿霉素的聚合物纳米微囊冻干后，储存于50 ml容量的离心管中，缓慢加入150 μ?的全氟己烷，超声震荡，再缓慢加入25 mL的磷酸盐缓冲溶液(ρΗ=7.4)，轻微震荡，即可形成负载有药物和填充全氟己烷的聚合物纳米微囊悬浮液。
[0018]释药的条件为:将10 mg负载药物和填充全氟己烷的聚合物纳米微囊分散在10mL的两种缓冲溶液中(磷酸盐缓冲溶液，pH=7.4 ;醋酸一醋酸钠缓冲溶液，pH=5.0),超声分散均匀，然后分为5份，每份2 mL,将一份溶液移入透析袋中(透析分子量Mn=14000)，再放Λ 80 mL的含不同浓度的还原剂的缓冲溶液中，即刻开始计时释药。在预订时间，从瓶内取出3 mL释药的缓冲溶液进行紫外测量，再补充3 mL纯的缓冲溶液保持体积恒定。
[0019]本发明所制备的可降解聚合物纳米微囊具有以下特点:(1)回流沉淀制备过程简单、高效；(2)粒径为50-1000 nm，具有很好的单分散性；(3)还原剂降解后，分子量小于5000且分子量分布均匀，远小于代谢阈值(45 — 50 kDa),可以很好的代谢排出体外；(4)阿霉素的载药率和载药量均很高；(5)阿霉素的释放过程可以通过调节环境的氧化还原环境，PH值和超声条件加以控制，在超声、谷胱甘肽浓度和较低pH值条件下展现出较快的释放速度，而在中性的pH值和谷胱甘肽浓度条件下释放量较小；(6)加入的全氟己烷在超声条件下可以产生良好的超声信号。说明所制备的聚合物纳米微囊具有良好的生物降解性，是一种较好的药物载体 和超声造影剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1.制备的不同交联度的PMAA纳米微囊的透射电镜照片:A、交联度10% ;B、交联度20% ;C、交联度30% ;D、交联度40%。
[0021]图2.实施例5是负载阿霉素的PMAA微囊在不同条件下的释药曲线。其中:㈧在pH=7.4条件下的释药曲线，(B)在pH=7.4条件下的释药曲线。
[0022]图3.实施例6填充全氟己烷(PFH)的PMAA微囊在不同模式下的体外超声成像图片。其中:图(A)-图(C)为在传统B模式下的体外超声图像，图(D)-图(F)为在能量多普勒模式下的体外超声图像。
【具体实施方式】
[0023]下面将通过实例对于本发明做进一步的详细说明。
[0024]实施例1:壳层厚度为25 nm,交联度为40%的PMAA微囊的制备
(I)未交联PMAA纳米微球的合成:MAA 2 g, AIBN 0.04 g, 80 mL乙腈，加入到100 mL单口瓶中，加热到100 °C，回流反应2 h。离心除去溶剂和未反应单体，用乙腈洗涤3次，真空烘箱干燥24 h。
[0025](2)核壳结构的PMAA纳米微球的合成:取PMAA纳米微球100 mg，MAA单体200 mg,BACy交联剂80 mg, 10 mg AIBN引发剂，40 mL乙腈,加热到100 °C,回流反应2 h。离心除去未反应单体，用乙腈洗涤3次，真空烘箱干燥24 h。
[0026](3)将制备的核壳结构的PMAA纳米微球溶于50 mL乙醇溶液中，加热到50 °G，刻蚀3 h。离心分离，用乙醇和水洗涤3次，冷冻干燥，将得到的样品取I mg分散在10 ml去离子水中，进行透射电镜和动态光散射测试，得粒径为340 nm，壳层厚度为25 nm，交联度为40%的核壳式PMAA微囊。
[0027]实施例2:壳层厚度为15 nm,交联度为30%的PAA微囊的制备
(1)未交联PAA纳米微球的合成:AA I g, AMBN 0.02 g, 80 mL乙腈，加入到100 mL单口瓶中，加热到100 °C，回流反应2 h。离心除去溶剂和未反应单体，用乙腈洗涤3次，真空烘箱干燥24 h。
[0028](2)核壳结构的PAA纳米微球的合成:取PAA纳米微球50 mg, AA单体200 mg,BACy交联剂60 mg, 10 mg AMBN引发剂，40 mL乙腈,加热到120 °C,回流反应I h。离心除去未反应单体，用乙腈洗涤3次，真空烘箱干燥24 h。
[0029](3)将制备的核壳结构的PAA纳米微球溶于50 mL水中，加热到50 °G，刻蚀3 h。离心分离，用乙醇和水洗涤3次，冷冻干燥，将得到的样品取I mg分散在10 ml去离子水中，进行透射电镜和动态光散射测试，得粒径为300 nm，壳层厚度为15 nm，交联度为30%的核壳式PAA微囊。 [0030]实施例3:壳层厚度为10 nm,交联度为20%的PHEMA微囊的制备
(1)未交联PHEMA纳米微球的合成:HEMA 0.5 g, AMBN 0.02 g, 50 mL乙腈，加入到100 mL单口瓶中，加热到90 °C，回流反应2 h。离心除去溶剂和未反应单体，用乙腈洗涤3次，真空烘箱干燥24 h。
[0031 ] (2)核壳结构的PHEMA纳米微球的合成:取PHEMA纳米微球50 mg, HEMA单体200mg,BACy交联剂40 mg, 10 mg AIBN引发剂，40 mL乙腈,加热到90 °C,回流反应I h。离心除去未反应单体，用乙腈洗涤3次，真空烘箱干燥24 h。
[0032](3)将制备的核壳结构的PHEMA纳米微球溶于50 mL水和乙醇中，加热到50 °G，刻蚀3 h。离心分离，用乙醇和水洗涤3次，冷冻干燥，将得到的样品取I mg分散在10 ml去离子水中，进行透射电镜和动态光散射测试，得粒径为350 nm，壳层厚度为10 nm，交联度为20%的核壳式PHEMA微囊。
[0033]实施例4:壳层厚度为35 nm,交联度为50%的PNIPAM微囊的制备
(1)未交联PNIPAM纳米微球的合成:NIPAM 3 g, AMBN 0.06 g, 50 mL乙腈，加入到100 mL单口瓶中，加热到90 °C，回流反应2 h。离心除去溶剂和未反应单体，用乙腈洗涤3次，真空烘箱干燥24 h。
[0034](2)核壳结构的PNIPAM纳米微球的合成:取PNIPAM纳米微球200 mg，NIPAM单体600 mg, BACy交联剂600 mg, 100 mg AIBN引发剂，100 mL乙腈，加热到110 °C，回流反应4 h。离心除去未反应单体，用乙腈洗涤3次，真空烘箱干燥24 h。
[0035](3)将制备的核壳结构的PNIPAM纳米微球溶于50 mL水和乙醇中，加热到50 oC,刻蚀3 h。离心分离，用乙醇和水洗涤3次，冷冻干燥，将得到的样品取I mg分散在10 ml去离子水中，进行透射电镜和动态光散射测试，得粒径为400 nm，壳层厚度为35 nm，交联度为50%的核壳式PNIPAM微囊。
[0036]实施例5:取实施例1中制得的PMAA微囊50 mg,加入30 mg的阿霉素，配成100mL的溶液，磷酸盐缓冲溶液，常温下搅拌24 h，产物用离心分离，冷冻干燥，制成负载有抗癌阿霉素的PMAA药物载体，载药率的重量比为93.5%，载药量为36%，纳米药物在pH、谷胱甘肽(GSH)及超声条件下可以快速释放(见图2)。
[0037]实施例6:50 mg负载阿霉素的PMAA微囊冻干后，储存于50 ml容量的离心管中，缓慢加入150 μ?的全氟己烷，超声震荡，再缓慢加入25 mL的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)，轻微震荡，即可形成负载有药物和全氟己烷的微囊悬浮液，该微囊的显影效果良好(见图3)。
【权利要求】
1.一种可降解聚合物纳米微囊的制备方法，其特征在于具体步骤如下:(I):在溶剂中加入聚合单体和引发剂，进行回流沉淀反应，其中聚合单体与引发剂重量比为100:1-100:10，控制反应温度为60-160°C，反应时间为0.5_24h ;反应结束后离心除去溶剂和未反应单体，用乙腈反复洗涤3-5次，真空烘箱内45°C干燥24 h,即得到未交联的聚合物纳米微球； (2):将步骤(1)得到的未交联的聚合物纳米微球，加入聚合单体、引发剂和二硫键交联剂，在溶剂中进行回流沉淀反应，其中未交联聚合物微球与聚合单体的重量比为1:.0.1-1:20，聚合单体与引发剂的重量比为100:1-100:10，聚合单体与二硫键交联剂的重量比为100:5-100:150，控制反应温度为60-160°C，反应时间为0.5_24h ;在步骤⑴得到的未交联的聚合物纳米微球外面包覆一层二硫键交联的聚合物壳层；离心除去溶剂和未反应原料，用乙腈反复洗涤3-5次，真空烘箱内45°C干燥24 h,即得到形成核壳结构的聚合物纳米微球； (3):将步骤⑵得到的核壳结构的聚合物纳米微球加入到刻蚀溶剂中，刻蚀去除未交联的聚合物内核，用水反复离心洗涤3-5次，真空冻干，即得到形成纳米级的二硫键交联的可降解的聚合物纳米微囊。
2.根据权利要求1所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法，其特征在于步骤(1)和步骤(2)所用聚合单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、N-2-羟丙基-甲基丙烯酰胺、羟乙基甲基丙烯酸酯、乙烯基吡啶、乙烯基咪唑、N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯己内酰胺或N-异丙基丙烯酰胺中任一种，或为均聚物，或者它们之间以不同组合共聚。
3.根据权利要求1所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法，其特征在于步骤(1)和步骤(2)所用引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异戊腈、偶氮二异庚腈或过氧化二苯甲酰中任一种。
4.根据权利要求1所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法，其特征在于步骤(2)中所用的二硫键交联剂为含二硫键的二烯类单体。
5.根据权利要求1所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法，其特征在于步骤(1)和步骤(2)中回流沉淀所用溶剂为单一溶剂或混合溶剂，所述单一溶剂为乙腈、乙醇、水、四氢呋喃、甲基异丁基酮或甲苯中任一种；所述混合溶剂为不同比例的乙腈一乙醇、乙腈一四氢呋喃、乙腈一水、乙醇一甲苯或甲基异丁基酮一乙腈的组合物中任一种。
6.根据权利要求1所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述刻蚀溶剂为乙醇或水中任一种。
7.根据权利要求1所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法，其特征在于所述含二硫键的二烯类单体浓度为0.01 Wt %-50 wt%。
8.—种如权利要求1所述制备方法得到的聚合物纳米微囊大小为50-1000 nm,聚合反应体系壳层交联度为5%到60%之间。
9.一种如权利要求1所述制备方法制备得到的聚合物纳米微囊在超声造影剂和药物载体方面应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述药物载体为抗癌药物阿霉素。
11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述超声造影剂采用的超声响应物为全氟已烷。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述聚合物纳米微囊作为超声造影剂采用还原剂降解，所述还源剂为二还原型谷胱甘肽或二硫苏糖醇。
【文档编号】A61K49/22GK103830752SQ201310641990
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】杨朋, 汪长春 申请人:复旦大学