一种基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物及其制备方法

一种基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物及其制备方法。由具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到；药物为蛋白质药物、多肽药物或者小分子药物；具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡由聚合物自组装后交联得到；聚合物的分子链包括依次连接的亲水链段、疏水链段以及PEI分子；疏水链段包括聚碳酸酯链段和/或聚酯链段。PEI通过静电相互作用复合和装载药物；膜为可逆交联的生物可降解且生物相容性好的聚酯/聚碳酸酯，侧链的二硫戊环类似人体天然抗氧化剂硫辛酸，外壳为以PEG为背景、可靶向癌细胞，其有望成为集简易、稳定、多功能等优点于一身的纳米药物系统。
【专利说明】
一种基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物及其 制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物载体技术，具体涉及一种基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿 瘤纳米药物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 癌症是威胁人类健康的主要杀手，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。蛋白质 和多肽药物在抗癌方面具有高效、特异性强、毒副作用小、不受耐药性的影响等优点。但是， 诱导凋亡的很多蛋白质药物需要进入细胞内才能发挥作用，而蛋白质尺寸大进入细胞能力 差，同时易被体液中的蛋白酶降解，大大影响了其发挥抗癌作用。另外，一些水溶性小分子 抗癌药物尤其是在生理环境下带负电荷的药物如培美曲塞二钠、甲氨蝶呤二钠由于细胞本 身的负电荷难以高效进入细胞，导致药物的生物利用率低下，抗癌效果不高。由双亲性聚合 物自组装形成的聚合物囊泡具有独特的结构，其性能可调度大，能同时装载亲水性药物和 疏水性药物，在生物医学领域尤其是药物控制释放领域有应用潜力。可是，现有囊泡技术对 带负电的小分子抗癌药以及高效低毒的蛋白药物的装载效率较低，或是蛋白质和多肽在晚 期内涵体/溶酶体中存留过久导致(部分)变性；同时还存在囊泡体内循环不稳定、肿瘤细胞 摄取低、细胞内药物浓度低等问题，导致纳米药物的药效不高，还存在毒副作用，这些都极 大地限制了囊泡作为这类药物的载体的应用。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的是公开一种基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物及 其制备方法。
[0004] 为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案： 一种基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物，由具有不对称膜结构的可逆 交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到;所述药物为蛋白质和多肽药物或者小分子抗癌 药物;所述具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡由聚合物自组装后交联得 到;所述聚合物的分子链包括依次连接的亲水链段、疏水链段以及聚乙烯亚胺分子;所述疏 水链段包括聚碳酸酯链段和/或聚酯链段;所述亲水链段的分子量为3000-8000Da;疏水链 段的分子量为未水链段分子量的2.3-8.4倍;PEI分子的分子量为未水链段分子量的10%-50% 〇
[0005] 优选的，本发明的聚合物化学结构式如下： 其中，办选自以下基团中的一种：

r2选自以下基团中的一种：
?.......;> PEI的化学结构式如下：
本发明的聚乙烯亚胺(PEI)为支化和线性两种，得到聚合物的化学结构式为以下结构 式中的一种：
所述聚合物中，PEG的分子量为3000-8000Da; PTMC或PLA的总分子量为PEG分子量的2-6 倍；PDTC的总分子量为PTMC或PLA总分子量的15%-40%;PEI分子的分子量为TOG分子量的 10%-50%〇
[0006] 本发明的聚合物中，限定PEI的结构与分子量，作为载体时毒性小，结合PEG链段与 疏水链段，可以形成良好的药物包载效果，即使当药物含量高达30 ri.%，该囊泡仍可以完 全、紧实包裹药物；同时本发明的聚合物避免了现有PEI通过物理缠绕的方式结合药物带来 的不稳定、带正电易与细胞结合而迀移力差、释放效率差的缺陷；通过静电作用力结合药 物，再被交联的囊泡膜和外界分隔，避免在输送过程被细胞黏附而造成损失和毒副作用，能 够高效迀移至病灶处，并在体内高浓度盐和还原剂GSH的作用下，快速释放药物，解决疾病 问题。
[0007] 本发明设计的具有不对称膜结构、还原敏感可逆交联、细胞内可解交联的生物可 降解聚合物囊泡，其囊泡膜的外表面由具有不粘附性的聚乙二醇(PEG)组成，囊泡膜的内表 面由较低分子量的PEI(300-4000Da)组成，用于高效装载蛋白质包括颗粒酶B、细胞色素 C或 者凋亡素、多肽和生理环境带负电荷的小分子药物如培美曲塞二钠、甲氨蝶呤二钠等;交联 的囊泡膜可保护药物不被降解、不泄漏，并可在体内长循环，囊泡的纳米尺寸以及表面的肿 瘤特异性靶向分子使得囊泡可定向输送药物进入肿瘤细胞；由于PEI的高质子海绵效应而 更蛋白质易于逃离内涵体预防了蛋白质变性，在细胞内的还原环境下，囊泡解交联，药物被 释放进入细胞质发挥其作用。
[0008] 本发明中，聚合物囊泡为具有不对称膜结构的还原敏感可逆交联、细胞内可解交 联的生物可降解聚合物囊泡;所述聚合物为PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI， 即聚合物由PEG亲水链段、疏水链段以及PEI分子组成，其中疏水链段的结构为： a.-?
当R2)
?，为PTMC链段；当R2:
时，为PLA链段，即疏水 链段由 P (TM(J-c〇-L)l(J)坱有八 LA-co-DTC)组成。
[0009] 优选方案为:PEG分子量为4000-7500Da; PTMC或PLA总分子量为PEG分子量的2.5-5 倍;PDTC总分子量为PTMC或PLA总分子量的18%-38%;PEI的分子量为PEG单元分子量的15%- 40% 〇
[0010] 上述三嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI，其中中间嵌段 的TMC或者LA与DTC呈无规排列;PEI分子量小于PEG分子量，在自组装、交联后得到具有不对 称膜结构的交联的聚合物囊泡，囊泡膜的内壳为PEI用于复合药物如蛋白质、多肽和小分子 药物，并能通过质子海绵效应逃逸内涵体;囊泡膜为可逆交联的生物可降解且生物相容性 好的PTMC或者PLA，侧链的二硫戊环类似人体天然的抗氧化剂硫辛酸，可提供还原敏感的可 逆交联，不但支持生物药物在血液中的长循环，还可保证在细胞内快速解交联，释放药物到 靶细胞细胞内。
[0011] 本发明还公开了上述基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物的制备 方法，包括以下步骤： (1) 将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)的端羟基用羟基活化剂比如氯甲酸对硝基 苯酯（NPC)活化，再与PEI反应制得PEG-P (TMC-DTC) -PEI或者PEG-P (LA-DTC) -PEI; (2) 在PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI的PEG端偶联肿瘤特异性靶向分 子，得到靶向 PEG-P (TMC-DTC) -PEI或者靶向 PEG-P (LA-DTC) -PEI; (3) 以PEG-P(TMC-DTC)-PEI与药物为原料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药物；或者以 PEG-P(LA-DTC)-PEI与药物为原料，通过溶剂置换法制备具有抗肿瘤药物；或者以PEG-P (TMC-DTC)-PEI、靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI与药物为原料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药 物;或者以PEG-P(LA-DTC)-PEI、靶向PEG-P(LA-DTC)-PEI与药物为原料，通过溶剂置换法制 备抗肿瘤药物;或者以PEG-P (TMC-DTC) -PEI、靶向PEG-P (TMC-DTC)与药物为原料，通过溶 剂置换法制备抗肿瘤药物；或者以PEG-P(LA-DTC)-PEI、靶向PEG-P(TMC-DTC)与药物为原 料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药物。
[0012] 优选以 PEG-P (TMC-DTC) -PE I 和靶向 PEG-P (TMC-DTC )、药物为原料，或者以 PEG-P (LA-DTC) -PEI和靶向PEG-P (LA-DTC)、药物为原料，共混自组装、装载药物、交联得到肿瘤主 动靶向具有不对称膜结构的药物囊泡，外壳为以PEG为背景、靶向分子对癌细胞可高特异性 结合，增加载体的靶向性。靶向分子可以为多肽CC9、cNGQ、cRGD、叶酸FA或半乳糖Gal。比如 通过PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI和偶联了肿瘤主动靶向分子的二嵌段聚 合物如cNGQ-PEG-P(TMC-DTC)混合，共自组装、装载药物、交联后得到肿瘤主动靶向、具有不 对称膜结构的抗肿瘤药物;所述cNGQ-PEG-P(TMC-DTC)的化学结构式为：
[0013] 上述制备方法，具体包括以下步骤： 步骤（1)为将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)、羟基活化剂氯甲酸对硝基苯酯NPC 溶于干燥的溶剂中反应，然后沉淀、过滤、真空干燥得到活化的PEG-P (TMC-DTC) -NPC或者 PEG-P (LA-DTC) -NPC;将 PEG-P (TMC-DTC) -NPC 或者 PEG-P (LA-DTC) -NPC 溶液滴加到 PE I 溶液 中反应后，透析、沉淀、抽滤、真空干燥得到PEG-P (TMC-DTC)-PEI或者PEG-P (LA-DTC)-PEI; 步骤(2 )为将得到聚合物溶于带有靶向分子的有机溶剂如DMS0或DMF中；步骤(3 )为将原料 溶液加入非离子缓冲溶液中如HEPES，室温放置少许后在相同缓冲溶液中透析，室温孵育交 联，得到基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物。本发明可以在加或不加还原 剂如二硫代苏糖醇(DTT)和谷胱甘肽(GSH)下室温交联得到具有不对称膜结构的可逆交联 生物可降解聚合物囊泡，从而得到基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物。
[0014] 比如： 将PEG-P(TMC-DTC)的末端羟基用羟基活化剂氯甲酸对硝基苯酯NPC活化，再与PEI的端 基伯胺反应制得PEG-P(TMC-DTC)-PEI，具体为，PEG-P(TMC-DTC)和NPC溶于干燥的二氯甲烷 (DCM)中冰水浴下反应12-24小时，然后在冰乙醚中沉淀、过滤、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-NPC;然后将 PEG-P(TMC-DTC)-NPC 溶于干燥 DCM，滴加到 PEI 的 DCM 中 30-40°C 下反应 12-24小时后，在DCM和甲醇(体积比为1:1)的介质中透析24-48小时，接着沉淀、抽滤、真空干燥 得到产物PEG-P(TMC-DTC)-PEI; 以PEG-P (TMC-DTC) -PE I和靶向PEG-P (TMC-DTC )、细胞色素 C (CC )为原料，通过溶剂置换 法制备抗肿瘤药物;具体为把PEG-P (TMC-DTC) -PEI和靶向PEG-P (TMC-DTC)的DMD0溶液混合 CC的缓冲液后加入HEPES缓冲液中，室温下放置过夜、透析、加或不加还原剂如二硫代苏糖 醇(DTT)和谷胱甘肽(GSH)孵育4 h，得到抗肿瘤药物。
[0015] 本发明还公开了具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡作为蛋白 质药物、多肽药物和生理环境带负电的小分子药物载体的应用;所述具有不对称膜结构的 可逆交联生物可降解聚合物囊泡由聚合物自组装后交联得到;所述聚合物的化学结构式如 下：
其中，办选自以下基团中的一种：
r2选自以下基团中的
一种： PEI的化学结构式如下：
所述聚合物中，PEG的分子量为3000-8000Da; PTMC或PLA的总分子量为PEG分子量的2-6 倍；PDTC的总分子量为PTMC或PLA总分子量的15%-40%;PEI分子的分子量为TOG分子量的 10%-50%〇
[0016]本发明进一步公开了具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡在制 备蛋白质抗肿瘤药物、多肽抗肿瘤药物或者小分子抗肿瘤药物中的应用;所述具有不对称 膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡由聚合物自组装后交联得到;所述聚合物的化学 结构式如下：
其中，办选自以下基团中的一种：
R2选自以下基团中的一种：
PEI的化学结构式如下：
所述聚合物中，PEG的分于量为3000-8000Da; PTMC或PLA的总分于量为PEG分子量的2-6 倍；PDTC的总分子量为PTMC或PLA总分子量的15%-40%;PEI分子的分子量为TOG分子量的 10%-50%〇
[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下优点： 1.本发明公开的抗肿瘤纳米药物中具有不对称膜结构的交联聚合物囊泡用于体内传 递;首先合成了三嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-PEI，PEI分子量为PEG分子量的10%-50%，在 聚合物自组装、交联后得到具有不对称膜结构的交联的聚合物囊泡，囊泡膜的内壳为PEI用 于复合蛋白质、多肽和生理环境带负电荷的小分子药物;囊泡膜为可逆交联的生物可降解 且生物相容性好的PTMC，侧链的二硫戊环类似人体天然抗氧化剂硫辛酸，可提供还原敏感 的可逆交联，不但支持纳米药物在血液中长循环，还可保证在细胞内快速解交联，释放药物 到靶细胞细胞内；外壳以PEG为背景同时具有靶向分子，对癌细胞可高特异性结合。
[0018] 2.本发明公开的抗肿瘤药物通过对具有不对称膜结构的交联聚合物囊泡来装载 治疗性蛋白质、多肽和生理环境带负电荷的小分子药物，其体内外抗肿瘤效果、体内血液循 环及生物分布、治疗荷原位肺癌小鼠的情况和毒副作用研究，表明该囊泡装载药物拥有多 种独特优点，包括制备的简易操控性、杰出的生物相容性、对药物极好的控制释放性(生理 条件泄漏量低/肿瘤细胞内快速释放）、超强的体内循环稳定性、对癌细胞的优越靶向性、显 著的特异性基因沉默能、卓越的抑制肿瘤生长和转移的能力；因此，本发明的囊泡体系有望 成为集便捷、稳定、多功能等优点于一身的纳米系统平台，用于高效、主动靶向输送蛋白质 等药物至肿瘤包括原位肿瘤。
[0019] 3.本发明公开的抗肿瘤药物中具有不对称膜结构的、还原敏感可逆交联、细胞内 可解交联的生物可降解聚合物囊泡的囊泡膜的内表面由低分子量的PEI(300-4000Da)组 成，用于高效装载蛋白质、多肽和生理环境带负电荷的小分子药物等，交联的囊泡膜可保护 药物不被降解，并可在体内长循环，囊泡的纳米尺寸以及肿瘤特异性靶向使得囊泡可输送 药物高效进入肿瘤细胞，在细胞内的还原环境下，囊泡解交联，药物解离释放进入细胞质； 这里限定的低分子量PEI作为载体时毒性小，在结合PEG链段与疏水链段后却可以形成良好 的药物包载效果；同时本发明的聚合物避免了现有PEI通过静电相互作用结合蛋白质等形 成的复合物带来的不稳定、带正电易与细胞结合而迀移力差、释放效率差的缺陷。
[0020] 4.本发明公开的抗肿瘤药物的具有不对称膜结构的聚合物囊泡为交联囊泡，PEI 配合亲水链段以及疏水链段，从而具有稳定的结构，在体内循环良好，能够即使当药物含量 高达35 ri.%，该囊泡仍可以完全、紧实包裹药物，证明本发明的抗肿瘤药物稳定性优异，当 它在10 mM GSH存在下孵育20 h后发现，由于交联囊泡的解交联及溶胀大部分药物释放出 来;是一种良好的蛋白质或者小分子药物控释载体，用于肿瘤治疗。
【附图说明】
[0021]图 1 是实施例一中PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEIl. 8k的核磁图； 图2为实施例五中PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI 1.8k囊泡粒径分布及TEM图； 图3是实施例七中装载甲氨蝶呤钠盐的MTX-CPP33-RCCPS体外释放图； 图4是实施例十二中靶向交联囊泡CPP33-RCCPS对A549肺癌细胞的毒性图； 图5是实施例十三中靶向CPP-MTX-RCCPs对A549细胞的毒性图； 图6是实施例十四中靶向囊泡CC9-PEM-RCCPs对H460细胞的毒性图； 图7是实施例十五中靶向囊泡CPP-GrB-RCCPs对A549细胞的毒性图； 图8是实施例十七中靶向交联囊泡CC9-RCCPs-Cy5在小鼠血液中循环图； 图9是实施例十八中靶向交联囊泡CPP-MTX-RCCPs对荷皮下A549肺癌小鼠生物分布图； 图10是实施例十九中靶向交联囊泡CC9-PEM-RCCPs对荷皮下H460肺癌小鼠生物分布 图； 图11是实施例二十中载MTX· 2Na靶向交联囊泡CPP-RCCPs在皮下荷A549肺癌小鼠的多 剂量治疗图； 图12是实施例二^^一中载PEM靶向交联囊泡CC9-RCCPs在荷皮下H460肺癌小鼠的多剂 量治疗图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述： 实施例一 PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI 1.8k嵌段共聚物的合成 PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI 1.8k的合成分为两步，首先是开环聚合制备PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)二嵌段共聚物，具体操作如下，在氮气手套箱内，依次称取MeO-PEG-OH =5.0 kg/mol，0.50 g，100 μπιο?)，TMC (2.0 g，19.2 mmol)和DTC (0.50 g， 2.60 mmol)并溶解在二氯甲烷(DCM，7.0 mL)中，快速加入开环聚合催化剂如双(双三甲基 硅基)胺锌(29 mg，75 μπιο?)。密闭反应器密封好放置40 °C油浴中磁力搅拌下反应2天。冰 醋酸终止反应后在冰乙醚中沉淀两次、抽滤、常温真空干燥后得到PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)〇
[0023] 接着，PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)的末端羟基氯甲酸对硝基苯酯NPC活化，再与 支化PEI(bPEI)的伯胺反应制得。具体的，PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k) (0.4 g，羟基 0.013 mmol)和NPC(40 mg，0.07 mmol)溶于干燥的DCM中在0°C下反应24小时，然后在冰乙 醚中沉淀、过滤、真空干燥得到PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-NPC。然后将产物溶于3 mL DCM后滴加到3 mL溶有bPEI (#n =1.8 kg/mol) (180 mg, 0.10 mmol)的DCM中，30°C下反 应24小时后，在DCM和甲醇(体积比为1:1)中透析(MW⑶7000) 48小时，接着在冰乙醚中沉 淀两次、抽滤并室温真空干燥得到产物PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI 1.8k。产率： 91.6%。咕匪R (400 MHz, DTC13):PEG: δ 3.38， 3.65; TMC: δ 4.24， 2.05; DTC: δ 4.32，3.02，PEI: δ 2.56-2.98:? NMR表征显示除了PEG及P(DTC-TMC)峰外，还有PEI的 特征峰在d 2 · 59-2 · 79，附图 1为PEG5k-P(DTC4 · 4k-TMC19 · 8k)-bPEI 1 · 8k的核磁图谱，其1Η NMR表征显示除了PEG及P(DTC-TMC)峰外，还有PEI的特征峰在d 2.59-2.79，通过积分可知， 聚合物的分子量为5.0_(4.4-19.8)-1.8 kg/mol。
[0024] 实施例二合成共聚物 Mal-PEG6k-P(DTC3.2k-TMC15.4k)-bPEI1.8k 其合成与实施例一类似，也是分为两步，只是将其中的第一步中的引发剂Me〇-PEG-〇H 换为马来酰亚胺官能化的Mal-PEG6k-OH，开环聚合TMC和DTC得到Mal-PEG6k- P(DTC3.2k-TMC15.4k)，然后其末端羟基用NPC活化，再与bPEI1.8k的伯胺反应制得。具体操作与实施例 一类似。产率：90.29^? M1R (400 MHz, DTC13):PEG: δ 3.38，3.65; TMC: δ 4.24， 2.05; DTC: δ 4.32，3.02,ΡΕΙ: δ 2.56-2.98,以及Mai的特征峰。聚合物数均分子量通过 特征峰面积积分比值计算为6.0-(3.2-15.4)-1.8 kg/mol。
[0025] 实施例三合成聚合物 Azide-PEG6.5k-P(DTC4.0k-LA15.3)-lPEI0.7k 其合成与实施例一类似，也是分为两步，只是将第一步的MeO-PEG-OH换为叠氮官能化 的Azide-PEG6 · 5k-OH，开环聚合LA和DTC得到Azide-PEG6 · 5k-P(DTC4 · 0k-LA15 · 3)，然后其 末端羟基用NPC活化，再与线性PEI(1PEI0.7k)的伯胺反应制得。产率:90.2%。1H NMR (400 MHz, DTC13):PEG: δ 3.38，3.65; TMC: δ 4.24，2.05; DTC: δ 4.32，3.02,以及PEI的 特征峰。聚合物数均分子量通过特征峰面积积分比值计算为6.5-(4.0-15.3)-0.7 kg/mol。
[0026] 实施例四合成靶向二嵌段共聚物〇??^^66.51^-?(01^3.01^〇-了]\05.01〇 CPP-PEG6.5k-P(DTC3. Ok-co -TMC15. Ok)的合成与实施例一类似，也是分为两步，将第 一步中的引发剂Me〇-PEG-〇H换为丙烯酸酯官能化的AA-PEG-OH，开环聚合TMC和DTC得到八八-PEG6 · 5k-P(DTC3 · Ok-co -TMC15 · Ok);其次，具有自由巯基的多肽CPP33-SH与AA-PEG6 · 5k-P (DTC3. Ok-co -TMC15. Ok)通过迈克尔反应而键合。简要的说44^^66.51^-?(01^3.01^〇-TMC15.0k) (0.017 mmol)与CPP33-SH (0.033 mmol)相继溶解在5 mL DMF中，加少许 AIBN反应2天后，蒸馏水中透析两天（MWC0 3500)，冷冻干燥得产物CPP-PEG6.5k-P (DTC3 · 0k-co -TMC15 · 0k)。产率:85 · 29LBCA蛋白试剂盒(Thermo scientific)测得CPP33的 接枝率为91.7%。通过调整原料比例可以得到不同分子量的聚合物，见表1。
[0027] 表1各个聚合物制备条件和产物的核磁表征结果
实施例五制备交联聚合物囊泡PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI 1.8k 溶剂置换法制备。室温下向950μL的HEPES(5mM，pH6.8)缓冲液中加入50μL浓度为5 mg/ml的PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k的DMS0溶液，室温静置lh，缓慢转动混 合液，使之分散均匀后，加入相当于DTC摩尔量10%-30%的DTT溶液(最终0.1 mM)后在37°C摇 床中震荡12h充分交联。然后透析(MWCO: 3500)12h除去有机溶剂和游离蛋白，期间换5次 介质，由此得到可逆核交联的囊泡，简称为RCCPs。图2为得到的囊泡粒径分布图及TEM图。在 制备该囊泡时也可以不加入DTT，在制备过程中囊泡内部可以自交联，形成稳定的交联囊 泡，避免交联剂的干扰。
[0028] 实施例六靶向聚合物的合成和靶向聚合物囊泡的制备 靶向聚合物的合成有多种方式。炔功能化的Alkynyl-PEG5k-OH引发DTC与LA开环聚合、 端羟基活化、与线性1PEI 1.2k反应得到末端为活性炔基的聚合物Alkynyl-PEG5k-P (DTC5.8k-LA23k)-lPEI 1.2k;最后，与叠氮功能化的靶向分子，如多肽CNGQ-N3或半乳糖 Gal-N3,通过叠氮-炔基的点击化学反应得到靶向聚合物Gal-PEGSk-POTCS.Sk-IJ^SlO-iPEIUk。 随后靶向囊泡的制备方法即 是：首先混合 Gal-TOG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-1PEI1.2k和PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-lPEI 1.2k的DMS0溶液，打入HEPES溶液中，同实施例 五的方法制备得到囊泡，称为Ga 1 -RCCPs。
[0029] 叠氮功能化的Azide-PEG3k-OH引发DTC与TMC开环聚合、端羟基活化、与支化 bPEI0.6k反应得到末端为活性叠氮基的聚合物Azide-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0.6k， 最后与炔基功能化的靶向分子如alk-CC9或是cRGD-alk，通过叠氮-炔基的点击化学得到靶 向聚合物CC9-PEG3k-P (DTC4k-TMC 12k) -bPE 10.6k。随后靶向囊泡的制备方法即是：把CC9-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0·6k和PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)_ bPEIO·6k的DMS0溶液混 合，打入HEPES溶液中，同实施例五的方法制备得到囊泡，称为CC9-RCCPs。
[0030]当叠氮或炔基功能化的聚合物为无末端PEI的二嵌段聚合物的情况，即Alkynyl-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)和 Azide-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)，其键合 cNGQ 等多肽的方式和 制备靶向囊泡(和无靶向的三嵌段聚合物混合)的方式与上述例子类似。
[0031] 马来酰亚胺Mai功能化的Mal-PEG6k-OH或者丙烯酸酯功能化的AA-PEG6.5k-OH引 发DTC与TMC开环聚合、端羟基活化、与支化bl .8k PEI反应得到聚合物Mal-PEG6k-P (DTC4 · 8k-TMC19 · 2k)-bPEI 1 · 8k或AA-PEG6 · 5k-P(DTC4 · 6k-TMC18 · 6k)-bPEI 1 · 8k。然后，他 们和相应的无活性端的聚合物PEG5k-P (DTC4.6k-TMC 18.6k) -bPE 11.8k混合溶于DMSO中后， 打入HEPES溶液中，同实施例五制备得到交联囊泡。最后，在囊泡溶液中加入含有自由巯基 的靶向分子如多肽cNGQ-SH或叶酸FA-SH或CPP33-SH，通过迈克尔加成反应和表面有活性 Mai或AA的囊泡键合，得到靶向聚合物囊泡CPP33-RCCPs、FA-RCCP等。
[0032]马来酰亚胺Mai功能化的和丙烯酸酯功能化的嵌段聚合物为无末端PEI的二嵌段 聚合物的情况，即Mal-PEG6k-P(DTC3 · 2k-TMC15 · 4k)和AA-PEG5k-P(DTC4 · 5k-TMC19 · 3k)，其 和含有PEI的三嵌段聚合物混合制备囊泡、键合cNGQ等多肽的方式和制备靶向囊泡的方式 与上述例子类似。
[0033]实施例七装载甲氨蝶呤钠盐的交联囊泡MTX-CPP33-RCCPS及体外释放 室温向950 μL含不同浓度甲氨蝶呤钠盐(MTX·2Na)的HEPES缓冲溶液(5mM，pH5.5)中 加入50 yL的PEG5·0k-P(DTC3·Ok-co -TMC15·0k)-PEI 1 ·8k和CPP-PEG6·5k-P(DTC3·Ok-co -TMC15.0k)(质量比4:1)的DMSO溶液（10 mg/mL)，室温静置2 h，缓慢转动混合液，使之逐渐 均匀分散后，氮气下，加入相当于DTC摩尔量10%-30%的DTT溶液(最终0.1 mM)，37°C摇床中 震荡（200 rpm)12 h，使之充分交联。然后转入透析袋(MW⑶：3500)透析24h除去有机溶剂 和游离的药物，透析介质为HEPES缓冲溶液(5 mM，pH 5.5)，期间至少换5次介质。载不同比 例的MTX'2Na(10%-30wt%)的交联囊泡的粒径在60-120 nm，粒径分布0.12-0.19。紫外光谱 仪测定MTX'2Na的包裹效率为60%-85%。得到的载药可逆核交联囊泡称为MTX-CPP33-RCCPS， 表示载的药物为MTX· 2Na，靶向分子为CPP33，其他命名以此类推。
[0034] 研究不同聚合物囊泡装载MTX的情况:PEG5k-P(DTC4.4k- TMC19.8k) -bPE11.8k和 Mal-PEG6k-P(DTC4 · 8k-TMC19 · 2)-bPEI 1 · 8k 包载不同量 MTX· 2Na( 10-30wt%)后形成囊泡，并 和cRGD-SH反应得到载药靶向交联囊泡MTX-cRGD-RCCPs，粒径80-120nm，粒径分布0.08-0.17，药物包裹效率为70%-85% ;由聚合物I3EG7k-P(DTC4k-LA18)-lPEI3.5k包载不同量 MTX· 2Na( 10%-30wt%)后形成囊泡的粒径90-150nm，粒径分布0.12-0.19，MTX· 2Na的包裹效率 为70%-85%。
[0035] MTX'2Na的体外释放实验在37 °C恒温摇床中震荡（200 rpm)进行，每组各有三个 平行样。第一组，载MTX'2Na的交联囊泡在加入10 mM GSH模拟细胞内还原环境HEPES (10 mM，pH 7.4)中；第二组，载MTX'2Na的交联囊泡在HEPES (10 mM，pH 7.4)中；载药交联囊 泡的浓度为100 mg/L，取0.5 mL放入透析袋(丽C0: 12,000)中，每个试管中加入相应的透 析溶剂25 mL，预定时间间隔取5.0 mL透析袋外介质用HPLC测定溶液中药物浓度，同时向试 管中补加5.0 mL相应介质。图3为MX2Na累积释放量与时间的关系，可看出，加入模拟细 胞内GSH后，药释明显快于没加 GSH的样本，说明载药交联囊泡在10 mM的GSH的存在下能有 效释放药物。
[0036] 实施例八载PEM'Na的靶向交联囊泡PEM-CC9_RCCPs及体外释放 室温下向950 yL含不同浓度培美曲塞钠盐(PEM'Na)的HEPES缓冲溶液（5 mM，pH 5.5) 中加入50 yL的PEG5·0k-P(DTC3·Ok-co -TMC15·0k)-PEI 1 ·8k和CC9-PEG6·5k-P(DTC3·Ok-C〇-TMC15.0k)(质量9:1)的DMSO溶液（10mg/mL)，室温静置2 h，缓慢转动混合液，使之逐 渐分散均匀后，氮气下，加入相当于DTC摩尔量的10%-30%的DTT溶液(最终0.1 mM)，同实施 例七的制备方法制备PEM-CC9-RCCPs。载不同比例的PEM· Na (10%-30wt%)的交联囊泡的粒径 在55-120 nm，粒径分布0.12-0.18。紫外光谱仪测定PEM'Na的包裹效率为的 体外释放实验同实施例七。PEM'Na累积释放量与时间的关系可看出，加入模拟细胞内GSH 后，药释明显快于没加 GSH的样本，说明载药交联囊泡在10 mM的GSH的存在下能有效释放药 物。
[0037] 研究多种不同聚合物囊泡的装载PEM'Na的情况。实施例六中的由PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0 · 6k和CC9-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0 · 6k包载不同PEM.Na( 10%-30wt%)，后交联得到载药靶向交联囊泡TOM-CC9-RCCPs，粒径50-100nm，粒径分布0.14_ 0.18，MTX· 2Na 的包裹效率为 55%-75%。
[0038]实施例九载细胞色素 C的交联靶向囊泡CC-cRGD-RCCPs及体外释放 按质量比4:1把PEG5k-P(DTC4 · 4k-TMC19 · 8k)-bPEI 1 · 8k 和cRGD-PEG6k-P(DTC4·8k-TMC19.2k)-bPEI 1.8k混合溶于DMS0( lOmg/mL)，加入950 yL含不同浓度蛋白质FITC-CC的 HEPES(5 mM，pH 6.8)缓冲溶液中，同实施例七制备？11'00>〇1^〇-1?0^8。载不同比例0： (l%-5wt%)的交联囊泡粒径在90-120 nm，粒径分布0.13-0.19。荧光光谱仪测定FITC-CC的 包裹效率为95%-100%。
[0039] 按照上述类似的方法，实施例六中由Gal-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-lPEI1.2k和 PEG5k-P(DTC5 · 8k-LA23k)-lPEI 1 · 2制备的Gal-RCCPs在包载不同量凋亡蛋白（apoptin)(1-5wt%)得到载药靶向交联囊泡的粒径90-130nm，粒径分布0.14-0.17，蛋白质包裹效率接近 100%。由 PEG8k-P (DTC8k-LA30) -bPE 11 · 2k 和 Ga 1 -PEG8k-P (DTC8k-LA30) -bPE 11 · 2k 包载不同 量Caspase3( l-5wt%)得到的载药囊泡粒径110-150nm，粒径分布0.14-0.17，包裹效率接近 lOOQ/hPEGdk-PmTCS · 7k-LA18 · 8k)-PEI2 · Ok 和 cNGQ-PEG5k-P(DTC5 · 7k-LA18 · 8k)包载不同 量胰岛素（l_5wt%)，得到载药交联囊泡粒径100-120nm，粒径分布0.15-0.18，包裹效率接近 100%〇
[0040] FITC-CC的体外释放实验同实施例七，只是透析袋MWC0为300kDa，使用荧光仪测定 溶液中药物浓度。结果表明，加入10 mM DTT后，FITC-CC累积释放量释放明显要快于没加 DTT的样本，说明载药交联囊泡在10 mM的DTT的存在下，能有效释放药物。
[0041 ] 实施例十装载颗粒酶B(GrB)的交联靶向囊泡GrB-CPP-RCCPs的制备 PEG5·0k-P(DTC3·Ok-co -TMC15·0k)-PEI1·8k和CPP-PEG6·5k-P(DTC3·Ok-co -TMC15.0k)按质量比4:1混合于DMS0溶液中，同实施例八制备载GrB交联靶向囊泡GrB-CPP-RCCPs。载不同比例GrB(l%-5 wt%)的交联囊泡粒径在90-120 nm，粒径分布在0.12-0.17,囊 泡包裹效率接近100%。更换聚合物以及药物，可得到不同的载药聚合物囊泡的载药量、包封 率，结果见表2。
[0042]表2载药聚合物囊泡的载药量、包封率
实施例十一 MTT法测试聚合物囊泡的细胞毒性 MTT法使用人肺癌细胞(H460)，以5 X 103个/mL将细胞种于96孔板，每孔100 yL，24小时 后培养至细胞贴壁70%左右。然后，实验组各孔中分别加入含有不同浓度(0.1-0.5 mg/mL) 的CC9-RCCPS和RCCPs囊泡样品（实施例五、实施例六），另设细胞空白对照孔和培养基空白 孔(复4孔）。培养48小时后，每孔加入MTT(5.0 mg/mL)10 yL，继续培养4小时后每孔加入150 yL DMSO溶解生成的结晶子，用酶标仪于570 nm处测吸光度值(A)，以培养基空白孔调零，计 算细胞存活率。结果显示，当交联囊泡的浓度从〇. 1增到〇. 5 mg/mL时，H460的存活率仍高于 90%，说明本发明的交联囊泡具有良好的生物相容性。其他聚合物囊泡的细胞毒性的测定于 此类似，毒性均很小，具有良好的生物相容性。
[0043] 实施例十二MTT法测试聚合物囊泡的细胞毒性 MTT法使用人肺癌细胞(A549)，以5 X 103个/mL将细胞种于96孔板，每孔100 yL，24小时 后培养至细胞贴壁70%左右。然后，实验组各孔中分别加入含有不同浓度(0.1-0.5 mg/mL) 的CPP33-RCCPs和RCCPs囊泡样品（实施例五、实施例六）。培养48小时后，每孔加入MTT(5.0 mg/mL) 10 yL，继续培养4小时后每孔加入150 yL DMS0溶解生成的结晶子，用酶标仪于570 nm处测吸光度值(A)，以培养基空白孔调零，计算细胞存活率。由图4结果显示，当交联囊泡 的浓度从0.1增到0.5 mg/mL时，H460的存活率仍高于90%，说明该交联囊泡RCCPs和靶向的 CPP33-RCCPS均有良好的生物相容性。其他囊泡的细胞毒性的测定于此类似，毒性均很小， 具有良好的生物相容性。
[0044] 实施例十三MTT法测载药聚合物囊泡对A549肺癌细胞的毒性 测试对象为实施例七MTX-CPP33-RCCPS，用自由药、无靶向和20%靶向的载药囊泡做对 八549细胞的毒性实验，]\^('2恥浓度范围为0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10、20和40以8/11^，无 靶向载药交联聚合物囊泡及游离fflX2Na组作为对照组。细胞的培养和实施例^^一相同，共 同培养4小时后，吸出样品换上新鲜培养基继续孵育44 h后，而后的MTT加入、处理和测定吸 光度同实施例十一。由图5结果可知，载MTX· 2Na的含20% CPP33靶向交联聚合物囊泡对A549 细胞的半致死浓度(IC5Q)为2.8 yg/mL，无靶向囊泡的半致死浓度约为9.8 yg/mL，比自由药 小20和5倍，说明本发明的囊泡能很好的将药物传送到细胞内，并有效的释放，最终杀死癌 细胞，而靶向纳米粒的效果要更好。
[0045] 实施例十四MTT法测载药聚合物囊泡对H460肺癌细胞的毒性 测试对象为实施例八PEM-CC9-RCCPs，用自由药、无靶向和10%靶向的载药囊泡做对 H460细胞的毒性实验，PEM浓度范围为0.001、0.01、0.1、0.5、l、5、10和20μg/mL，无靶向载 药交联聚合物囊泡及游离PEM组作为对照组。细胞的培养和实施例十一相同，共同培养4小 时后，吸出样品换上新鲜培养基继续孵育44 h后，而后的MTT加入、处理和测定吸光度同实 施例十一。由图6结果可知，载PEM的含20% CC9的靶向交联囊泡对A549细胞的半致死浓度 (IC5Q)为3.6 yg/mL，无革巴向囊泡的半致死浓度为9.2yg/mL，自由药为4.5yg/mL，说明本发明 的靶向囊泡能很好的将药物传送到细胞内，并有效的释放，最终杀死癌细胞，而靶向纳米粒 的效果要更好，结果见表3。
[0046] 实施例十五MTT法测载药聚合物囊泡对A549肺癌细胞的毒性 测试对象为实施例十GrB-CPP-RCCPs，用自由药、无靶向和20%靶向的载药囊泡做对 八549细胞的毒性实验，6池浓度范围为0.0001、0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.2 4 g/mL，无靶向载药交联聚合物囊泡及游离GrB组作为对照组。细胞的培养和实施例十一相 同，共同培养4小时后，吸出样品换上新鲜培养基继续孵育68 h后，而后的MTT加入、处理和 测定吸光度同实施例十一。由图7结果可知，载GrB的含20% CPP靶向交联聚合物囊泡对A549 细胞的半致死浓度(IC5Q)为0.32 yg/mL，远低于自由药，比无靶向囊泡的半致死浓度小3倍， 说明本发明的囊泡能很好的将药物传送到细胞内，并有效的释放，最终杀死癌细胞，而靶向 纳米粒的效果要更好。
[0047]实施例十六靶向载药囊泡的内吞和细胞内释放实验 靶向载药囊泡的内吞和细胞内释放实验以载FITC标记的MTX的囊泡FITC-MTX-CPP-RCCPs为例、采用激光共聚焦显微镜(CLSM)跟踪测定。将400UL的A549细胞的1640培养基(含 10%牛血清、100IU/ml青霉素及lOOug/ml链霉素）悬浮液铺于24孔培养板(每孔5X104个细 胞）中，37°C、5% 二氧化碳条件下培养 24h。将 100yL 的 FITC-MTX-RCCPs 和 FITC-MTX-CPP-RCCPs的roS溶液加入孔中（FITC终浓度为lSμg/ml)，继续孵育4 h后，移去培养基，再补加 500UL培养基，继续孵育4 h，移去培养基并用roS洗三次、用4%的多聚甲醛溶液200UL固定 15min、PBS洗3次。最后用CLSM(TCS SP5)观察拍照。结果表明FITC-MTX-CPP-RCCPs相对于无 靶向FITC-MTX-RCCPs可以通过介导作用更有效内吞进入A549细胞且FITC-MTX在细胞内可 以快速释放，引起有效细胞凋亡。
[0048] 同样地，CLSM跟踪靶向载药囊泡CC9-RCCPs-Cy5在H460细胞的内吞实验结果表明， CC9-RCCPs-Cy5相对于无靶向RCCPs-Cy5可以通过介导作用更有效内吞进入H460细胞。再 如，靶向载药囊泡FITC-CC-Gal-RCCPs的肝癌细胞HepG2的内吞实验结果表明，FITC-CC-Gal-RCCPs相对于无靶向FITC-CC-RCCPs可以通过介导作用更有效内吞进入HepG2细胞，且 FITC-CC在细胞内可以快速释放，引起有效细胞凋亡。
[0049] 实施例十七RCCPs_Cy5和CC9-RCCPs_Cy5交联囊泡的血液循环 所有动物实验操作符合苏州大学动物实验中心规定。实验选用体重为18~20克左右，4 ~6周龄的Balb/C裸鼠。首先用Cy5-NHS和PEG5 · 0k-P(DTC3 · 0k-co -TMC15 · 0k)-PEIl · 8k通过 酰胺化反应制备Cy5标记的聚合物PEG5·0k-P(DTC3·Ok-co -TMC15·0k)-PEI 1 ·8k-Cy5( 1 个 Cy5/分子链）。囊泡CC9-RCCPs-Cy5由PEG5 · 0k-P(DTC3 · Ok-co -TMC15 · 0k)-PEI 1 · 8k-Cy5、 PEG5.0k- P(DTC 3.0k-co -TMC15.0k)-PEI1.8k和CC9-PEG6·5k-P(DTC3·0k-co-T M C15.0 k)按1: 3 :1混合而成，形成的聚合物囊泡粒径为10 0纳米，粒径分布为0.14。将 RCCPs-Cy5交联囊泡、和CC9-RCCPs-Cy5靶向交联囊泡通过尾静脉注射小鼠体内（Cy5浓度为 4 41〇，在0、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时定点取血约10以1^，通过差量法准确计算血液 重量，再加100 yL浓度为1%的曲拉通和500 yL二甲亚砜萃取(其中含有20 mM的DTT);然后 离心(20000转/分钟，20分钟)后，取上层清液，通过荧光光谱仪测得每个时间点Cy5的量。由 图8可知，靶向交联聚合物囊泡、非靶向交联聚合物囊泡在小鼠体内的消除半衰期分别为 7.46、7.5小时，所以本发明的交联聚合物囊泡在小鼠体内稳定，有较长循环时间。
[0050] 按照上述方法，由PEG8·0k-P(DTC9·0k-LA32·0k)-PEI3·2k-Cy5和Gal-PEG8·5k-P(DTC9.2k-LA32.0k)形成的囊泡有较长的循环时间，靶向交联聚合物囊泡、非靶向交联聚 合物囊泡在小鼠体内的消除半衰期分别为8.16和8.5小时；*PEG4.0k-P(DTC2.4k-TMC8·0k)-PEI0·6k-Cy5和CC9-PEG5·0k-P(DTC2·6k-TMC8·2k)形成的囊泡有相对长的循 环时间，靶向交联聚合物囊泡、非靶向交联聚合物囊泡在小鼠体内的消除半衰期分别为 6.16和6.5小时。
[0051 ] 实施例十八MTX-CPP33-RCCPS和MTX-RCCPs载药交联聚合物囊泡在荷A549肺癌小 鼠的体内生物分布 动物同实施例十七。在皮下注射1 x 1〇7个A549人肺癌细胞，3~4周后肿瘤为100~200 mm3时开始实验。靶向交联囊泡ΜΤΧ· 2Na-CPP-RCCPs 由PEG5 · Ok-P (DTC3 · Ok-TMCl 5 · Ok)-bPEIl·8k和CPP-PEG6·5k-P(DTC3·0k-TMC15·0k)制备。将MTX-CPP33-RCCPs、非靶向MTX-RCCPs和自由MTX'2Na尾静脉注射小鼠体内（MTX'2Na:15 mg equiv./kg)，8小时后处死老 鼠，将肿瘤及心，肝，脾，肺和肾组织取出，清洗称重后加入500 yL 1%的曲拉通通过匀浆机 磨碎，再加入900 yL二甲亚砜萃取（其中含有20 mM的DTT)。离心（20000转/分钟，20分钟） 后，取上层清液，通过HPLC测每个时间点MTX· 2Na的量。图9可知MTX-CPP33-RCCPs、MTX-RCCPs和MTX· 2Na注射8小时在肿瘤积累的MTX· 2Na量分别为5.4、1.6和0.7 ID%/g，MTX-CPP33-RCCPs 是 MTX-RCCPs和 MTX· 2Na的 3 · 4和 7 · 7倍，说明MTX-CPP33-RCCPs 通过主动靶向在 肿瘤积累较多。
[0052] 实施例十九PEM-CC9-RCCPs和PEM-RCCPs载药交联聚合物囊泡在荷H460肺癌小鼠 的体内生物分布 动物同实施例十七。在皮下注射1 X 1〇7个H460人肺癌细胞，3~4周后肿瘤为100~200 mm3 时开始实验。由 PEG5 · 0k-P(DTC3 · 0k-TMC15 · 0k)-bPEI 1 · 8k 和 CC9-PEG6 · 5k-P(DTC3 · Ok-TMC15.0k)制备载PHM的靶向交联囊泡PEM-CC9-RCCPs。将PEM-CC9-RCCPs、非靶向交联聚合物 囊泡PEM-RCCPs和自由PEM通过尾静脉注射小鼠体内（PEM:12.5 mg equiv./kg)，8小时后 处死老鼠，将肿瘤及心，肝，脾，肺和肾组织取出，清洗称重后加入500 yL 1%的曲拉通通过 匀浆机磨碎，再加入900 yL二甲亚砜萃取(其中含有20 mM的DTT)。离心（20000转/分钟，20 分钟）后，取上层清液，通过高效液相色谱测得每个时间点PEM的量。图10结果可知，PEM-CC 9-RCCPs、PEM-RCCPs和PEM注射8小时在肿瘤积累的PEM量分别为6.8、2.1和0.8 ID%/g， PEM-CC9-RCCPs是PEM-RCCPs和PEM的3.2和8.5倍，说明PEM-CC9-RCCPs通过主动靶向在肿瘤 积累较多，结果见表3。
[0053]实施例二十靶向交联囊泡MTX-CPP33-RCCPS在荷A549皮下肺癌的小鼠中的抑瘤 效果、体重变化和存活率 实验选用体重为18~20克左右，4~6周龄的Balb/C裸鼠，在皮下注射1 X 107个A549人肺 癌细胞，大约3~4周后，肿瘤大小为100~200 mm3时开始实验。接着，如实施例十七的方式将 药MTX-CPP33-RCCPs、MTX-RCCPs、Trexal 1以及PBS在0、4、8和12天通过尾静脉注射小鼠体内 (MTX·2Na: 15 mg/kg)。在0~18天，每两天称量小鼠的体重，游标卡尺测量肿瘤体积，肿瘤体 积计算方法为:V=(L X WX H)/2，（其中L、W和Η分别为肿瘤的长度、宽度、厚度）。持续观察小 鼠的生存到70天。由图11可知，其中Α为肿瘤生长曲线，Β为小鼠治疗后肿瘤图片，C为体重变 化，D为生存曲线，MTX-CPP33-RCCPS组治疗18天内，肿瘤得到明显抑制，而MTX-RCCPs组肿瘤 有一定的增长。两组的小鼠体重几乎没有改变，说明载药交联囊泡对小鼠没有毒副作用。 MTX-CPP33-RCCPS治疗组在70天后全部存活，Trexal 1组在48天时全死亡，PBS组在40天时也 全部死亡。因此，本发明的靶向交联囊泡载药后可有效抑制肿瘤的增长，对小鼠没有毒副作 用，还可以延长荷瘤老鼠的生存时间。
[0054]实施例二^^一载药靶向交联囊泡PEM-CC9-RCCPs在荷H460皮下肺癌的小鼠中的 抑瘤效果、体重变化和存活率 实验选用体重为18~20克左右，4~6周龄的Balb/C裸鼠，在皮下注射1 X 107个H460人肺 癌细胞，大约3~4周后，肿瘤大小为100~200 mm3时开始实验。接着，药剂PEM-CC9-RCCPs、PEM- RCCPs、A1 imta以及PBS在Ο、4、8和12天通过尾静脉注射小鼠体内（PEM: 12 · 5 mg/kg; A1 imta: 25 mg/kg)。在0~18天，每两天称量小鼠的体重，游标卡尺测量肿瘤体积，肿瘤体积计算方法 为:V=(LXWXH)/2,（其中L为肿瘤的长度，W为肿瘤的宽度，Η为肿瘤的厚度）。持续观察小鼠 的生存到60天。由图12中可知，其中Α为肿瘤生长曲线，Β为小鼠治疗后肿瘤图片，C为体重变 化曲线，PEM-CC 9-RCCPs治疗组20天时，肿瘤得到明显抑制，而载药PEM-RCCPs组肿瘤有一定 的增长。相比之下，PEM-CPP-RCCPs和PEM-RCCPs组的小鼠体重几乎没有改变，说明载药交联 囊泡对小鼠没有毒副作用。PEM-CC 9-RCCPs治疗组在60天后全部存活，PEM-RCCPs组在42天 时已全部死亡，Alimta组在38天时也全部死亡PBS组在30天时也全部死亡。因此，本发明的 靶向交联囊泡载药后可有效抑制肿瘤的增长，对小鼠没有毒副作用，还可以延长荷瘤老鼠 的生存时间。
[0055] 因此，本发明的聚合物制备的药物载体载药后可有效抑制肺癌肿瘤增长，对小鼠 没有毒副作用，还可以延长荷瘤老鼠的生存时间。
[0056] 表3载药交联囊泡对肺癌的体内外抗肿瘤结果
【主权项】
1. 一种基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物，由具有不对称膜结构的可 逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到;所述药物为蛋白质药物、多肽药物或者小分 子抗癌药物;所述具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡由聚合物自组装后 交联得到;所述聚合物的分子链包括依次连接的亲水链段、疏水链段以及聚乙烯亚胺分子； 所述疏水链段包括聚碳酸酯链段和/或聚酯链段;所述亲水链段的分子量为3000-8000Da; 疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.3-8.4倍;PEI的分子量为亲水链段分子量的10%-50% 〇2. 根据权利要求1所述基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物，其特征在 于:所述聚合物的化学结构式如下：所述聚合物中，PEG的分子量为3000-8000Da;PTMC或PLA总分子量为I3EG分子量的2-6 倍;PDTC总分子量为PTMC或PLA总分子量的15%-40%; PEI的分子量为PEG分子量的10%-50%。3. 根据权利要求2所述基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物，其特征在 于:PEG的分子量为4000-7500Da; PTMC或PLA的总分子量为PEG分子量的2.5-5倍;PDTC总分 子量为PTMC或PLA总分子量的18%-38%; PEI的分子量为PEG分子量的15%-40%。4. 根据权利要求1所述基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物，其特征在 于:所述蛋白质药物包括颗粒酶B (GrB)、细胞色素 C (CC)或者凋亡素(Apoptin);所述多肽 药物包括卡非佐米、肿瘤凋亡肽;所述小分子抗癌药物为生理环境带负电荷的小分子抗癌 药。5. 权利要求1-4所述任意一项基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物的制 备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)的端羟基通过羟基活化剂活化，再与PEI反 应制得PEG-P (TMC-DTC) -PEI 或者PEG-P (LA-DTC) -PEI; (2) 在PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PeG-P(LA-DTC)-PEI的PEG端偶联肿瘤特异性靶向分 子，得到靶向 PEG-P (TMC-DTC) -PEI或者靶向 PEG-P (LA-DTC) -PEI; (3) 以PEG-P(TMC-DTC)-PEI与药物为原料，通过溶剂置换法制备基于交联生物可降解 聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物;或者以PeG-P(LA-DTC)-PEI与药物为原料，通过溶剂置换法 制备基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物;或者以Peg-P(TMC-DTC)-PEI、靶 向PEG-P(TMC-DTC)-PEI与药物为原料，通过溶剂置换法制备基于交联生物可降解聚合物囊 泡的抗肿瘤纳米药物;或者以PeG-P(LA-DTC)-PEI、靶向PeG-P(LA-DTC)-PEI与药物为原料， 通过溶剂置换法制备基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物；或者以PEG-P (TMC-DTC)-PEI、靶向PEG-P(TMC-DTC)与药物为原料，通过溶剂置换法制备基于交联生物 可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物;或者以PeG-P(LA-DTC)-PEI、靶向PEG-P(TMC-DTC) 与药物为原料，通过溶剂置换法制备基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物。6. 根据权利要求5所述基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物的制备方 法，其特征在于，步骤（1)为将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)、羟基活化剂在干燥的溶 剂中反应，然后沉淀、过滤、真空干燥得到端羟基活化的PEG-P (TMC-DTC)或者PEG-P (LA-DTC);将端羟基活化的PEG-P (TMC-DTC)或者PEG-P (LA-DTC)的溶液滴加到PEI溶液中反应， 然后透析、沉淀、抽滤、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI;步骤 (2)为将步骤（1)得到聚合物和溶于有机溶剂的靶向分子反应得到靶向peg-p(tmc-dtc)-PEI或者靶向PEG-P(LA-DTC) -PEI;步骤(3 )为将原料溶液加入非离子缓冲溶液中，室温放置 后透析、交联，得到基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物。7. 根据权利要求5所述基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物的制备方 法，其特征在于：步骤（2)中，肿瘤特异性靶向分子为叶酸(FA)、半乳糖(Gal)或多肽CC9、 cNGQ、cRGD;步骤(3)中，非离子缓冲溶液为HEPES。8. 权利要求5所述基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物的制备方法，其 特征在于:所述药物占原料的质量比为1%-35%。9. 具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡作为蛋白质药物、多肽药物或 者小分子药物载体的应用;所述具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡由聚 合物自组装后交联得到;所述聚合物的化学结构式如下：其中，办选自以下基团中的一种：所述聚合物中，PEG的分子量为3000-8000Da; PTMC或PLA的总分子量为PEG分子量的2-6 倍；PDTC的总分子量为PTMC或PLA总分子量的15%-40%; PEI分子的分子量为I3EG分子量的 10%-50%〇10.具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡在制备抗肿瘤纳米药物中的 应用;所述抗肿瘤纳米药物的活性成分为蛋白质药物、多肽药物或者生理环境带负电荷的 小分子抗癌药;所述具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡由聚合物自组装 后交联得到;所述聚合物的化学结构式如下：PEI的化学结构式如下：所述聚合物中，PEG的分子量为3000-8000Da; PTMC或PLA的总分子量为PEG分子量的2-6 倍；PDTC的总分子量为PTMC或PLA总分子量的15%-40%; PEI分子的分子量为I3EG分子量的 10%-50%〇
【文档编号】A61K9/127GK105997880SQ201610559279
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】孟凤华, 杨炜静, 方媛, 邹艳, 钟志远
【申请人】苏州大学