一种螺旋藻蛋白的制备工艺及其神经保护用途的制作方法

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种螺旋藻蛋白的制备工艺及其神经保护用途。

背景技术

随着世界人口的老龄化，与衰老密切相关的神经退行性疾病患者越来越多，预计2050年，世界范围内患有此类疾病的患者将达到1亿，因此阐明此类疾病的病因和发病机制，以及寻找有效的防治措施，己成为亟待解决的科研和社会问题。

神经退行性疾病的发病机制十分复杂，但研究人员认为神经退行性疾病虽然起因有所差异，在病患初期有各自的特征，但是不同的疾病之间表现出很多的相似性，尤其是在亚细胞水平上，异常蛋白聚集是神经退行性疾病的常见病理特征。例如，在阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)中，β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,aβ)在神经元外沉积形成老年斑；在帕金森病(parkinson’sdisease,pd)中，神经元内出现α-突触核蛋白(α-synuclein)的聚集；亨廷顿病(huntington’sdisease,hd)则是huntingtin基因突变导致的细胞内亨廷顿蛋白(huntintin)多聚谷氨酰胺(polyq)异常延伸后形成病理性聚集，最终引起神经细胞死亡。以上这些有特征性病理改变，其神经元的细胞体并没有明显减少，而细胞的突起部分却明显变短或消亡，因此，这种处于病态的神经元可长期存活.而逐步丧失其生物功能，这也是绝大多数神经退行性疾病发病慢、病程长的原因。因此，特异性的抑制异常蛋白聚集有望成为针对神经退行性疾病的有效干预策略。

螺旋藻(spirulina)是一种多细胞、微型、不分枝、无异型细胞的螺旋状体低等植物，属于蓝藻门(cyanopha)颤藻科(oscillatoriaceae)。它含有丰富的蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸、维生素以及矿物质等种营养物质，是目前所知营养成分最全面、最均衡的天然食品之一，被联合国粮农组织誉为“人类二十一世纪最理想的保健食品”。

螺旋藻是一种高蛋白藻类，其蛋白含量达到60％～70％，高于其他蛋白食品，并且螺旋藻蛋白水溶性好，消化率高，能够很好的被人体吸收。近年来，科研工作者对螺旋藻蛋白的提取分离以及功能进行了大量的研究。目前，对于螺旋藻蛋白功能的研究主要集中在抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和提高机体免疫力等方面。

中国专利cn107312063a公开了一种钝顶螺旋藻活性蛋白的制备方法，具体为，螺旋藻粉加入磷酸缓冲盐和活性多肽，反复冻融得粗蛋白液；粗蛋白液加硫酸铵盐析；将盐析沉淀物装入透析袋，至磷酸缓冲液中透析；将透析液采用羟基磷灰石吸附层析法制备活性蛋白纯品。所得活性蛋白能够提高淋巴细胞活性和机体免疫功能，增强机体的防病、抗病能力，还能清楚生物体内的自由基及促进动物血细胞的再生，具有显著的抗肿瘤活性。

中国专利cn107298710a公开了一种螺旋藻藻蓝蛋白的提取方法，包括粗细胞破碎、盐析、双水相萃取、超滤等步骤，所述藻蓝蛋白能够提高淋巴细胞活性，通过淋巴系统提高机体免疫功能，全面增强机体的防病、抗病能力还具有有意的抗氧化与辐射、抗炎、抑菌的功能，可用于饲料或饮料领域。

经检索，并未见螺旋藻蛋白在神经退行性疾病领域应用的报道。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种螺旋藻蛋白及其制备工艺，该提取工艺具有周期短，不接触有机溶剂，工艺简单、稳定、高效，所得产品安全无毒等特点，适合工业化生产。

同时本发明对上述螺旋藻蛋白进行了生物活性研究，发现其具备良好的神经保护活性，具有很好的药用和食用价值。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种螺旋藻蛋白，其制备方法包括如下步骤：

s1：取螺旋藻粉，加入tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)配制成20％的悬液，浸泡1～3天，然后在-10～-40℃下冷冻，置4℃下解冻，反复冻融3～5次后，以4000～8000rpm/min的转速离心20～40min，分离上清液，即为蛋白粗提取液；

s2：向步骤s1所述的蛋白粗提取液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，4℃下静置过夜，以4000～8000rpm/min的转速离心20～40min，分离得沉淀；

s3：取步骤s2所述的沉淀，用一级水复溶，在3.5kda的透析袋中透析除盐，先用流动水透析3天，再用去离子水透析2～5次，每12小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液，冻干，得螺旋藻蛋白，置-20℃下保存备用。

优选地，步骤s1中，螺旋藻粉与tris-hcl缓冲液配制成20％悬液后，浸泡1天。

优选地，步骤s1中，所述悬液经浸泡后，在-20℃下冷冻。

优选地，步骤s1中，所述反复冻融的次数为3次。

优选地，步骤s1中，所述悬液经反复冻融后，以5000rpm/min的转速离心30min，得上清液。

优选地，步骤s2为，向步骤s1所述的蛋白粗提取液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，4℃下静置过夜，在5000rpm/min的转速离心30min，分离得沉淀。

优选地，步骤s3中，流动水透析3天后，用去离子水透析3次。

本发明还公开了所述螺旋藻蛋白在制备神经保护作用的药物或保健品中的应用。

所述神经保护作用为，预防和/或治疗神经退行性疾病，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和老年性痴呆。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

在细胞水平上，本发明提供的螺旋藻蛋白具有显著的保护h2o2诱导的pc-12细胞损伤作用；在整体动物水平上，本发明提供的螺旋藻蛋白：能够显著缓解pd模型秀丽线虫(nl5901)体内的α-突触核蛋白的聚集，有轻微抑制hd模型秀丽线虫(am141)体内polyq异常聚集的作用，能够缓解ad模型秀丽线虫(cl2355)体内aβ毒性蛋白导致的神经损伤毒性，具有神经保护作用。

附图说明

图1：螺旋藻蛋白对pc-12细胞增殖的影响；

图2：pc-12细胞的h2o2损伤造模结果；

图3：螺旋藻蛋白对h2o2损伤的pc-12细胞的保护作用；

图4：螺旋藻蛋白对pd模型线虫nl5901体内α-突触核蛋白聚集的影响；

图5：螺旋藻蛋白对hd模型线虫am141体内polyq聚集的影响；

图6：螺旋藻蛋白对ad模型线虫趋化能力影响试验中趋化板示意图；

图7：螺旋藻蛋白对ad模型线虫cl2355趋化能力的影响。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明做进一步的阐述，本领域技术人员应理解，下面描述的实施例是为了更好地理解本发明，本发明的范围并不受限于此。

以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。

以下实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。

以下实施例中，螺旋藻粉由云南庆逸螺旋藻生物开发产业有限公司提供；sbasal溶液和smedium溶液的制备方法如下：

sbasal溶液：称取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于试剂瓶中，加入750ml去离子水，完全溶解后定容至1l，灭菌30min，冷却至40-50℃备用。

smedium溶液：取1l灭菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml的胆固醇乙醇溶液，边加变振摇，使其充分溶解(溶液由无色透明转为微乳白透明，无明显沉淀)，然后依次加入3ml1mol/lcacl2溶液，3ml1mol/lmgso4溶液，10ml1mol/l柠檬酸钾溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常温放置备用。

实施例1螺旋藻蛋白的制备

s1：取螺旋藻粉，加入tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)配制成20％的悬液，浸泡1天，然后在-20℃下冷冻，置4℃下解冻，反复冻融3次后，以5000rpm/min的转速离心30min，分离上清液，即为蛋白粗提取液；

s2：向步骤s1所述的蛋白粗提取液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，4℃下静置过夜，以5000rpm/min的转速离心30min，分离得沉淀；

s3：取步骤s2所述的沉淀，用一级水复溶，在3.5kda的透析袋中透析除盐，先用流动水透析3天，再用去离子水透析3次，每12小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液，冻干，得螺旋藻蛋白，置-20℃下保存备用。

实施例2螺旋藻蛋白的制备

s1：取螺旋藻粉，加入tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)配制成20％的悬液，浸泡2天，然后在-30℃下冷冻，置4℃下解冻，反复冻融4次后，以6000rpm/min的转速离心30min，分离上清液，即为蛋白粗提取液；

s2：向步骤s1所述的蛋白粗提取液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，4℃下静置过夜，以6000rpm/min的转速离心30min，分离得沉淀；

s3：取步骤s2所述的沉淀，用一级水复溶，在3.5kda的透析袋中透析除盐，先用流动水透析3天，再用去离子水透析4次，每12小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液，冻干，得螺旋藻蛋白，置-20℃下保存备用。

实施例3螺旋藻蛋白的制备

s1：取螺旋藻粉，加入tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)配制成20％的悬液，浸泡1天，然后在-40℃下冷冻，置4℃下解冻，反复冻融5次后，以6000rpm/min的转速离心40min，分离上清液，即为蛋白粗提取液；

s2：向步骤s1所述的蛋白粗提取液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，4℃下静置过夜，以6000rpm/min的转速离心40min，分离得沉淀；

s3：取步骤s2所述的沉淀，用一级水复溶，在3.5kda的透析袋中透析除盐，先用流动水透析3天，再用去离子水透析5次，每12小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液，冻干，得螺旋藻蛋白，置-20℃下保存备用。

实施例4螺旋藻蛋白的制备

s1：取螺旋藻粉，加入tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)配制成20％的悬液，浸泡3天，然后在-10℃下冷冻，置4℃下解冻，反复冻融5次后，以8000rpm/min的转速离心40min，分离上清液，即为蛋白粗提取液；

s2：向步骤s1所述的蛋白粗提取液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，4℃下静置过夜，以8000rpm/min的转速离心40min，分离得沉淀；

s3：取步骤s2所述的沉淀，用一级水复溶，在3.5kda的透析袋中透析除盐，先用流动水透析3天，再用去离子水透析5次，每12小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液，冻干，得螺旋藻蛋白，置-20℃下保存备用。

实施例5螺旋藻蛋白的制备

s1：取螺旋藻粉，加入tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)配制成20％的悬液，浸泡2天，然后在-40℃下冷冻，置4℃下解冻，反复冻融3～5次后，以4000rpm/min的转速离心20min，分离上清液，即为蛋白粗提取液；

s2：向步骤s1所述的蛋白粗提取液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，4℃下静置过夜，以4000rpm/min的转速离心20min，分离得沉淀；

s3：取步骤s2所述的沉淀，用一级水复溶，在3.5kda的透析袋中透析除盐，先用流动水透析3天，再用去离子水透析2次，每12小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液，冻干，得螺旋藻蛋白，置-20℃下保存备用。

实施例6螺旋藻蛋白的制备

s1：取螺旋藻粉，加入tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)配制成20％的悬液，浸泡1天，然后在-30℃下冷冻，置4℃下解冻，反复冻融3次后，以5000rpm/min的转速离心30min，分离上清液，即为蛋白粗提取液；

s2：向步骤s1所述的蛋白粗提取液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，4℃下静置过夜，以6000rpm/min的转速离心30min，分离得沉淀；

s3：取步骤s2所述的沉淀，用一级水复溶，在3.5kda的透析袋中透析除盐，先用流动水透析3天，再用去离子水透析3次，每12小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液，冻干，得螺旋藻蛋白，置-20℃下保存备用。

实施例7螺旋藻蛋白的制备

s1：取螺旋藻粉，加入tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)配制成20％的悬液，浸泡1天，然后在20℃下冷冻，置4℃下解冻，反复冻融5次后，以6000rpm/min的转速离心30min，分离上清液，即为蛋白粗提取液；

s2：向步骤s1所述的蛋白粗提取液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，4℃下静置过夜，以7000rpm/min的转速离心30min，分离得沉淀；

s3：取步骤s2所述的沉淀，用一级水复溶，在3.5kda的透析袋中透析除盐，先用流动水透析3天，再用去离子水透析4次，每12小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液，冻干，得螺旋藻蛋白，置-20℃下保存备用。

实施例8螺旋藻蛋白的制备

s1：取螺旋藻粉，加入tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)配制成20％的悬液，浸泡4天，然后在-5℃下冷冻，置4℃下解冻，反复冻融6次后，以10000rpm/min的转速离心50min，分离上清液，即为蛋白粗提取液；

s2：向步骤s1所述的蛋白粗提取液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，4℃下静置过夜，以10000rpm/min的转速离心50min，分离得沉淀；

s3：取步骤s2所述的沉淀，用一级水复溶，在3.5kda的透析袋中透析除盐，先用流动水透析3天，再用去离子水透析6次，每12小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液，冻干，得螺旋藻蛋白，置-20℃下保存备用。

实施例9螺旋藻蛋白对h2o2诱导的pc-12细胞损伤的保护作用

本实验所用的pc-12细胞为广东药科大学生命科学与生物制药学院黄宏靓副教授实验室馈赠。

pc-12细胞来源于褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(一种交感神经系统的肿瘤)，是一个常用的神经细胞株，形态呈多角型细胞，生长特性：贴壁较松，容易成团。pc-12细胞能够合成、贮存并释放适量儿茶酚胺，主要有多巴胺和去甲肾上腺素，拥有典型的神经细胞特点，经常用于神经毒性损害以及神经细胞死亡方式研究。在神经退行性疾病的研究过程中，利用原代培养神经元和动物作为模型进行药物的初步筛选，不仅成本高，而且耗时长。而以pc-12作为初级筛选模型，在此基础上初步筛选出阳性样品，再在神经元上和动物体内进一步研究，可以提高实验效率，降低实验成本。

许多研究发现，异常蛋白聚集导致的氧化应激损伤在神经退行性疾病的病理进展中起重要作用，本实验选取h2o2损伤pc-12细胞作为氧化应激的模型。

实验包括如下步骤：

1.螺旋藻蛋白对pc-12细胞增殖的影响试验

(1)将培养状态良好的pc-12细胞用胰蛋白酶进行消化，将细胞浓度调至1～2×10⁵个/ml后，在96孔板中每孔加入100μl细胞悬浮液，置于37℃细胞培养箱培养24小时。

(2)将螺旋藻蛋白配成浓度为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml，溶剂为含有10％胎牛血清的1640培养基。

(3)步骤(1)中的96孔板培养24小时后，将旧的培养基吸去，加入已配好浓度的螺旋藻蛋白提取物，37℃细胞培养箱培养24小时。

(4)24小时后，用mtt比色法检测细胞活力。

数据使用软件graphpadprism5.0作图分析。结果如图1所示。

图1表明，当螺旋藻蛋白提取物的浓度为0.25mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml时，细胞活性与control组差不多，而当剂量为2mg/ml和4mg/ml时，细胞活力与对照组相比有轻微升高趋势。当螺旋藻蛋白提取物的浓度为8mg/ml时，细胞活力约为对照组的50％，有可能是样品浓度过高，对细胞的生长环境(渗透压、ph值等)改变太强烈从而影响细胞生长。由此分析得出结论，0.25mg/ml～4mg/ml浓度的螺旋藻蛋白提取物对pc12细胞的增殖影响不显著，可选取此浓度范围进行后续实验。

2.h2o2诱导的pc-12细胞损伤模型的建立

(1)将培养状态良好的pc12细胞用胰蛋白酶进行酶解，将细胞浓度调至1～2×10⁵个/ml后，在96孔板上每孔加入100μl细胞悬浮液，在37℃细胞培养箱培养24小时。

(2)将h2o2分别配成浓度为0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l、0.6mmol/l、0.8mmol/l、1.0mmol/l、1.2mmol/l、1.5mmol/l的溶液。将96孔板的培养基吸去，

(3)步骤(1)中的96孔板培养24小时后，将旧的培养基吸去，每孔加入100μlh2o2。

(4)培养4小时后，用mtt比色法检测细胞活力。

数据使用软件graphpadprism5.0作图分析。结果如图2所示。

图2结果表明，随着h2o2浓度的逐渐升高，pc细胞的活力大致呈逐渐下降的趋势。当h2o2浓度为0.8mmol/l时，细胞活力约为control组的50％。由此确定，h2o2对pc12细胞最佳造模浓度为0.8mmol/l。

3.螺旋藻蛋白对h2o2诱导的pc-12细胞损伤的保护作用

(1)将培养状态良好的pc-12细胞用胰蛋白酶进行酶解，将细胞浓度调至1～2×10⁵个/ml后，在96孔板上每孔加入100μl细胞悬浮液，在37℃细胞培养箱培养24小时。

(2)将螺旋藻蛋白配成浓度为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml，溶剂为含有10％胎牛血清的1640培养基。

(3)步骤(1)中的96孔板培养24小时后，将旧的培养基吸去，加入已配好浓度的螺旋藻蛋白，在37℃细胞培养箱培养24小时。

(4)将h2o2配成浓度为0.8mmol/l的溶液。

(5)步骤(3)中的96孔板培养24小时后，将培养基吸去，每孔加入100μlh2o2，培养4小时。

(6)培养4小时后，用mtt比色法检测细胞活力。

数据使用软件graphpadprism5.0作图分析。结果如图3所示。

图3结果表明，随着螺旋藻蛋白浓度的升高，细胞活力都呈一定上升趋势。说明螺旋藻蛋白对h2o2诱导的pc-12细胞损伤的有较好的保护作用。

实施例10螺旋藻蛋白提取物对pd模型线虫nl5901体内α-突触核蛋白的影响

nl5901线虫是α-突触核蛋白与黄色荧光蛋白共表的转基因转虫品系，可以通过观察线虫体内荧光的强度来衡量α-突触核蛋白的表达量。

本实施例中的pd模型线虫nl5901来自于美国明尼苏达大学秀丽线虫遗传信息保藏中心(caenorhabditisgeneticscenter；cgc)。

实验步骤为：

1.nl5901线虫的基本培养和同步化

nl5901线虫培养于22℃恒温培养箱中，在涂有大肠杆菌op50的ngm培养基上生长发育。约3天转板1次，防止nl5901线虫过老或处于饥饿抑制状态，同时要保证nl5901线虫干净。

无菌条件下，选取70～80条正处于产卵期的成虫于1个新的铺有大肠杆菌op50的培养基平板上，产卵2h后将成虫全部挑走。将产卵板置于22℃无菌生化培养箱中培养2天，得到同步化处理于l4时期的nl5901线虫。

2.分组与给药

实验分为给药组和对照组。将步骤1中生长到l4期的nl5901线虫加入到24孔板中，实验组给予实施例1制备的螺旋藻蛋白，按终浓度分别是0.5mg/ml、2mg/ml加入到线虫中；对照组加入等体积的smedium溶液。继续在恒温培养箱中孵育。

3.检测

给药72小时后，收集各组线虫，用荧光显微镜进行拍照后，使用软件imagej对荧光强度进行统计，间接分析线虫体内α突触核蛋白的表达，最后使用软件graphpadprism5.0作图分析。结果如图4所示。

图4结果显示，给药72小时后，0.5mg/ml、2mg/ml的蛋白提取物饲喂的线虫nl5901体内的黄绿色荧光强度都比对照组弱，即α-突触核蛋白的表达有所下降。说明本发明提供的螺旋藻蛋白对帕金森疾病的α-突触核蛋白聚集有缓解的作用。

实施例11螺旋藻蛋白提取物对hd模型线虫am141体内polyq的影响

hd模型线虫am141是在其unc-54基因上转入了融合黄色荧光蛋白(yfp)的40个多聚谷氨酰胺长度的polyq重复片段(polyq)构建而成。由于unc-54是不协调基因,其本身表达在秀丽线虫肌球蛋白重链上，如果polyq在其中表达则会导致polyq在体壁肌肉层聚集,导致因肌肉运动障碍而出现运动能力减退现象。由于是与yfp融合，因而可以在荧光显微镜下观察到表现为黄绿色的荧光点。

本实施例中的hd模型线虫am141来自于美国明尼苏达大学秀丽线虫遗传信息保藏中心(caenorhabditisgeneticscenter；cgc)。

实验步骤为：

1.线虫的基本培养和同步化

am141线虫培养于22℃恒温培养箱中，在涂有大肠杆菌op50的ngm培养基上生长发育。约3天转板1次，防止nl5901线虫过老或处于饥饿抑制状态，同时要保证线虫干净。

无菌条件下，选取70～80条正处于产卵期的成虫于1个新的铺有大肠杆菌op50的培养基平板上，产卵2h后将成虫全部挑走。将产卵板置于22℃无菌生化培养箱中培养1天，得到同步化处理于l1时期的am141线虫。

2.分组与给药

实验分为给药组和对照组。将步骤1中同步化后生长至l1期的线虫加入24孔板中，给药组给予实施例1制备的螺旋藻蛋白，按终浓度分别是0.5mg/ml、2mg/ml加入到线虫中，对照组加入等体积的smedium溶液。置恒温培养箱中继续孵育。

3.检测

每隔24小时收集一次线虫，在荧光显微镜下统计秀丽线虫周身的黄绿色荧光点数，连续统计3天。最后使用软件graphpadprism5.0作图分析。结果如图5所示。

图5结果显示，随着时间的增长，同一给药浓度组线虫am141体内的荧光点数均呈上升趋势。说明在线虫am141的生长周期里，polyq的生成随着时间增长而增多，即亨廷顿疾病的特征愈明显。24h和48h时线虫am141体内的荧光点数与对照组基本相同，到达72h时，线虫进入成虫期，2mg/ml浓度下线虫的荧光点数与对照组相比有一定的下降。说明本发明提供的螺旋藻蛋白对成虫期线虫am141体内polyq的聚集有一定的抑制作用。

实施例12螺旋藻蛋白对ad模型线虫cl2355体内aβ的影响

ad模型线虫cl2355体内的aβ蛋白表达由神经细胞中突触小泡蛋白启动子snb-1调控，aβ特异的在线虫神经细胞中表达，属于组成型表达，但是这种表达在较高温度(23℃-25℃)的诱导下会加速，造成神经元的死亡(36h左右)，使线虫丧失对部分化合物的敏感性。

本实施例中的ad模型线虫cl2355来自于美国明尼苏达大学秀丽线虫遗传信息保藏中心(caenorhabditisgeneticscenter；cgc)。

实验步骤为：

1.培养板的准备：

趋化实验用板——10cm塑料板。

准备时间：趋化实验前48h铺板，每板10ml琼脂溶液，待其凝固后，倒置储存备用。

2.ad模型线虫cl2355同步化处理后得到的卵加至锥形瓶中于15℃培养箱中培养，培养30h后上24孔板。接着取实施例1制备所得到的螺旋藻蛋白，按终浓度分别是0.5mg/ml、2mg/ml加入到线虫中。对照组加入等体积的smedium溶液。上板完成后，先16℃培养36h再23℃诱导培养36h，收虫，分别收集各个孔的线虫于ep管中，用smedium清洗3-5遍，将大肠杆菌全部弃去。进行趋化实验。

3.准备趋化板

趋化实验前两天准备趋化板(即线虫同步化处理一天后)；

趋化板配方为琼脂、钙盐、镁盐、磷酸盐；

趋化板每板倒入10ml琼脂液，待其凝固后，倒置放置。

趋化实验前(即23℃培养箱中收线虫前)按图7所示画好趋化板。将线虫加至中线上，注意密度不宜过大；上板顺序依次为：线虫---对照(无水乙醇)---引诱剂(苯甲醛)，最后加入引诱剂。

4.将趋化板放置于23℃培养箱1h，待线虫自由爬散后，将板子放于55℃烘箱15min，待线虫被烘死后统计结果。统计结果后，计算ic值。公式为：

注：anumberofworm、bnumberofworm分别为趋化板中a、b区域中的线虫条数；ttotalnumberofworms为接种线虫的总条数。

5.使用软件graphpadprism5.0作图分析。分析结果如图7所示。

图7结果显示，随着螺旋藻蛋白提取物浓度的增高，线虫cl2355对化合物苯甲醛的趋化指数呈明显升高趋势。说明螺旋藻蛋白提取物对线虫cl2355体内aβ聚集导致的毒性有一定的抑制作用，神经元损伤受到缓解。证明螺旋藻蛋白可以缓解阿尔茨海默症的aβ蛋白聚集毒性。