一种提取银杏中种皮多糖的方法与流程

本发明涉及一种银杏种皮多糖提取技术领域，具体涉及一种提取银杏中种皮多糖的方法。

背景技术：

银杏又名白果树，为银杏科银杏属落叶乔木，是一种经济价值极高的天然植物资源。上世纪60年代中期，德国医药科学家发现银杏叶中含有治疗心脑血管动脉硬化、高血压、糖尿病等疾病的多种药效成分之后，银杏的生产和应用逐渐引起世人的关注。

银杏种实富含多种营养物质和有效成份，具有重要的营养和药用价值。银杏种实的结构主要包括种仁和种皮，种仁位于种皮内部，主要由胚乳组成，为可食用部分，具有敛肺定喘、止带缩尿的功效；种皮由外至内可分为肉质外种皮、骨质化中种皮和膜质化内种皮。银杏外种皮的成分与银杏种仁的基本一致，主要富含淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素等，银杏中种皮是由珠被内区细胞分化而成，其内主要成分为木质素、半纤维素、纤维素、果胶和蛋白质等。对于银杏种实来说，无论是种仁还是种皮中，均能提取出一定含量的多糖，而从银杏中提取出的银杏多糖具有一定的保健功能，可增强细胞免疫功能、抗衰老、抗氧化、抗癌、降血糖等，对体液免疫过程中b淋巴细胞的产生和抗体形成也有重要的作用，是目前人们关于银杏研究的重点，而目前针对银杏多糖的提取主要集中在银杏种仁和银杏外种皮上，如中国专利（公布号：cn106632711a，名称：一种亚微米级银杏外种皮多糖及其制剂的制备方法）公开了一种水煮方法辅助提取银杏外种皮多糖的工艺和中国专利（公布号：cn105175568a，名称：一种提取银杏白果多糖的方法及其产品）公开了一种超声协同酶处理提取银杏种仁多糖的方法，而真正对银杏中种皮中多糖的提取鲜有人研究，银杏中种皮作为一种农业废弃物造成了大量的污染和资源浪费。而对于银杏中种皮多糖的提取采用上述方法多糖得率较低，耗时较长。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多糖得率高的银杏中种皮多糖的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种提取银杏中种皮多糖的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏中种皮干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末；

（2）酶解：按料液比1:13-1:17（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为1%-2%的木质素过氧化物酶，0.1%-0.3%的半纤维素酶和0.4%-0.6%的纤维素酶，在60-80℃下降解65-75min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，离心，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

上述的提取银杏中种皮多糖的方法，其中，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏中种皮干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末；

（2）酶解：按料液比1:15（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为1.5%的木质素过氧化物酶，0.2%的半纤维素酶和0.5%的纤维素酶，在70℃下降解70min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，离心，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

上述的提取银杏中种皮多糖的方法，其中，所述步骤（1）中所述粉末的粒径为10-30目。

上述的提取银杏中种皮多糖的方法，其中，所述步骤（3）中离心时的转速为3500-4500r/min，离心时间为10-20min。

银杏中种皮主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。从结构与化学组成上看，纤维素为葡萄糖分子通过醚键连接形成的线性高聚物；半纤维素的成分则较为多样，主要为木糖和甘露糖；木质素的结构最为复杂，是由羟基或甲氧基取代的苯丙烷单体经无序聚合而成的三维复杂结构，而且木质素通过一定的共价键和氢键与纤维素和半纤维素交联在一起，稳定性较高，自然降解速度较慢，而且对纤维素的降解有一定的阻碍作用，对银杏中种皮中多糖的提取有一定的影响。因此，在提取多糖的过程中，对木质素的降解尤为重要。目前对木质素的降解的方法主要有酸解、碱解、有机溶剂抽提法等。其中，酸解法主要通过降解纤维素得到乙醇来得到木质素，能够将木质素分离出来，降解速度快，但是需要的酸度较高，木质素分离效果差，不利于后续多糖的提取；碱法通常是在高ph下采取大量的氢氧化钠水溶液降解，需后续除碱，且对后续多糖的提取也会造成影响；有机溶剂抽提法会引入有机溶剂，不利于多糖的提取。本发明中采用水酶法提取中种皮多糖，利用木质素过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶辅助提取银杏中种皮多糖；利用木质素过氧化物酶降解木质素，破坏细胞壁结构，进而破坏了木质素与纤维素和半纤维素稳定结构，使纤维素和半纤维素脱离出来，再用纤维素酶和半纤维素酶分别对纤维素和半纤维素降解，具有反应条件温和和选择性高的特点，而酶的专一性可避免对底物外物质的破坏，酶法相对其他提取方法具有众多优点，可以提高有效成分产率，缩短提取时间，降低能耗，降低提取成本，而且酶法提取可以在常温和非有机溶剂条件下进行，所以得到的产物纯度、稳定性及活性都很高，无污染。

本发明中使用的银杏中种皮为在郑州师范学院校园内采集的成熟的银杏果实中获得，木质素过氧化物酶购自上海超研生物科技有限公司、半纤维素酶和纤维素酶购自上海如吉生物科技。

本发明提供的一种提取银杏中种皮多糖的方法，首先加入木质素过氧化物酶，木质素过氧化物酶具有较高的氧化还原潜能，是比其他的过氧化物酶更有力的氧化剂，因此它不仅能氧化通常的过氧化物酶底物苯酚和芳香胺，也能通过适当的离子化作用氧化一系列其他的芳香醚和多环芳香化合物，能够直接作用于聚合的木质素，把银杏中种皮中的木质素降解，从而使木质素-半纤维素-纤维素结构解体，纤维素和半纤维素得以暴露出来，再利用纤维素酶和半纤维素酶分别对纤维素和半纤维素降解，进而加快银杏中种皮多糖提取的速率，且多糖得率高，耗时短，工艺简单，易于控制，节约资源，减少了环境污染。

附图说明

图1是葡萄糖标准曲线图；

图2是提取时间对银杏中种皮多糖提取率影响的曲线图；

图3是料液比对银杏中种皮多糖提取率影响的曲线图；

图4是纤维素酶对银杏中种皮多糖提取率影响的曲线图；

图5是水浴温度对银杏中种皮多糖提取率影响的曲线图。

具体实施方式

实施例1

一种提取银杏中种皮多糖的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏果实脱去外种皮，置于室内低温烘干，再将银杏中种皮剥取下来，在60-70℃下干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末，所述粉末的粒径为10-30目；

（2）酶解：按料液比1:13-1:17（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为1%-2%的木质素过氧化物酶，0.1%-0.3%的半纤维素酶和0.4%-0.6%的纤维素酶，在60-80℃下降解65-75min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，在转速为3500-4500r/min下离心10-20min，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

本发明提供的一种提取银杏中种皮多糖的方法，采用水酶法加快了银杏中种皮多糖提取的速率，且多糖得率高达103.041mg/g，耗时短，工艺简单，易于控制，节约资源，减少了环境污染。

实施例2

一种提取银杏中种皮多糖的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏果实脱去外种皮，置于室内低温烘干，再将银杏中种皮剥取下来，在65℃下干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末，所述粉末的粒径为20目；

（2）酶解：按料液比1：15（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为1.5%的木质素过氧化物酶，0.2%的半纤维素酶和0.5%的纤维素酶，在70℃下降解70min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，在转速为4000r/min下离心15min，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

本发明提供的一种提取银杏中种皮多糖的方法，采用水酶法加快了银杏中种皮多糖提取的速率，且多糖得率为103.041mg/g，耗时短，工艺简单，易于控制，节约资源，减少了环境污染。

实施例3

一种提取银杏中种皮多糖的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏果实脱去外种皮，置于室内低温烘干，再将银杏中种皮剥取下来，在60℃下干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末，所述粉末的粒径为15目；

（2）酶解：按料液比1：13（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为1%的木质素过氧化物酶，0.25%的半纤维素酶和0.4%的纤维素酶，在60℃下降解75min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，在转速为4500r/min下离心10min，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

本发明提供的一种提取银杏中种皮多糖的方法，采用水酶法加快了银杏中种皮多糖提取的速率，且多糖得率为100.781mg/g，耗时短，工艺简单，易于控制，节约资源，减少了环境污染。

实施例4

一种提取银杏中种皮多糖的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏果实脱去外种皮，置于室内低温烘干，再将银杏中种皮剥取下来，在70℃下干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末，所述粉末的粒径为10目；

（2）酶解：按料液比1：14（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为2%的木质素过氧化物酶，0.3%的半纤维素酶和0.6%的纤维素酶，在80℃下降解65min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，在转速为3500r/min下离心20min，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

本发明提供的一种提取银杏中种皮多糖的方法，采用水酶法加快了银杏中种皮多糖提取的速率，且多糖得率为101.152mg/g，耗时短，工艺简单，易于控制，节约资源，减少了环境污染。

实施例5

一种提取银杏中种皮多糖的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏果实脱去外种皮，置于室内低温烘干，再将银杏中种皮剥取下来，在63℃下干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末，所述粉末的粒径为30目；

（2）酶解：按料液比1：16（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为1.8%的木质素过氧化物酶，0.1%的半纤维素酶和0.44%的纤维素酶，在65℃下降解72min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，在转速为3800r/min下离心17min，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

本发明提供的一种提取银杏中种皮多糖的方法，采用水酶法加快了银杏中种皮多糖提取的速率，且多糖得率为102.556mg/g，耗时短，工艺简单，易于控制，节约资源，减少了环境污染。

实施例6

一种提取银杏中种皮多糖的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏果实脱去外种皮，置于室内低温烘干，再将银杏中种皮剥取下来，在68℃下干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末，所述粉末的粒径为30目；

（2）酶解：按料液比1：17（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为1.2%的木质素过氧化物酶，0.15%的半纤维素酶和0.52%的纤维素酶，在75℃下降解68min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，在转速为4200r/min下离心13min，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

本发明提供的一种提取银杏中种皮多糖的方法，采用水酶法加快了银杏中种皮多糖提取的速率，且多糖得率为100.816mg/g，耗时短，工艺简单，易于控制，节约资源，减少了环境污染。

实施例7

一种提取银杏中种皮多糖的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏果实脱去外种皮，置于室内低温烘干，再将银杏中种皮剥取下来，在66℃下干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末，所述粉末的粒径为30目；

（2）酶解：按料液比1：15（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为1.6%的木质素过氧化物酶，0.18%的半纤维素酶和0.56%的纤维素酶，在72℃下降解69min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，在转速为4000r/min下离心15min，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

本发明提供的一种提取银杏中种皮多糖的方法，采用水酶法加快了银杏中种皮多糖提取的速率，且多糖得率为101.014mg/g，耗时短，工艺简单，易于控制，节约资源，减少了环境污染。

对比例1

一种提取银杏中种皮多糖的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏果实脱去外种皮，置于室内低温烘干，再将银杏中种皮剥取下来，在65℃下干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末，所述粉末的粒径为20目；

（2）酶解：按料液比1：15（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为0.2%的半纤维素酶和0.5%的纤维素酶，在70℃下降解70min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，在转速为4000r/min下离心15min，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

本对比例与实施例2相比，除了在步骤（2）酶解中未加入木质素过氧化物酶外，其他步骤和条件均相同，测得的多糖得率为76.298mg/g。

对比例2

一种提取银杏中种皮多糖的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏果实脱去外种皮，置于室内低温烘干，再将银杏中种皮剥取下来，在65℃下干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末，所述粉末的粒径为20目；

（2）酶解：按料液比1：15（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为0.5%的纤维素酶，在70℃下降解70min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，在转速为4000r/min下离心15min，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

本对比例与实施例2相比，除了在步骤（2）酶解中未加入木质素过氧化物酶和半纤维素酶外，其他步骤和条件均相同，测得的多糖得率为73.471mg/g。

对比例3

一种提取银杏中种皮多糖的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将银杏果实脱去外种皮，置于室内低温烘干，再将银杏中种皮剥取下来，在65℃下干燥至含水量小于5%，再将干燥后的银杏中种皮磨成粉末，所述粉末的粒径为20目；

（2）酶解：按料液比1：15（w/v）加入蒸馏水，并加入银杏中种皮粉末重量为1.5%的木质素过氧化物酶和0.5%的纤维素酶，在70℃下降解70min；

（3）过滤：待酶解后的溶液冷却至室温，在转速为4000r/min下离心15min，留上清液，即为银杏中种皮多糖提取液。

本对比例与实施例2相比，除了在步骤（2）酶解中未加入半纤维素酶外，其他步骤和条件均相同，测得的多糖得率为92.345mg/g。

本发明通过以下实验优化获得：

单因素试验

1、水浴时间对银杏中种皮多糖提取率的影响

在料液比为1:20、木质素过氧化物酶为1.5%、半纤维素酶为0.2%、纤维素酶为0.5%、提取温度为50℃的条件下，依次测量提取时间分别为50min、60min、70min、80min、90min、100min时的多糖得率，并详细分析提取时间对银杏中种皮多糖得率的影响。

2、料液比对银杏中种皮多糖提取率的影响

在木质素过氧化物酶为1.5%、半纤维素酶为0.2%、纤维素酶为0.5%、提取温度为50℃、提取时间为60min的条件下，依次测量料液比分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30时的多糖得率。并详细分析料液比这个条件对银杏中种皮多糖得率的影响。

3、纤维素酶对银杏中种皮多糖提取率的影响

在提取温度（50℃）、提取时间（60min）、料液比（1:20）、木质素过氧化物酶为1.5%、半纤维素酶为0.2%时，依次测定在0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%的纤维素酶用量时的多糖得率，并详细分析纤维素酶用量对银杏中种皮多糖得率的影响。

4、水浴温度对银杏中种皮多糖提取率的影响

在提取时间（60min）、料液比（1:20）、木质素过氧化物酶为1.5%、半纤维素酶为0.2%、纤维素酶用量（0.5%）时，依次测量在温度为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃时的中种皮多糖得率，并详细分析水浴温度对银杏中种皮多糖得率的影响。

5、银杏中种皮多糖提取量的测定

取银杏中种皮的多糖提取液1ml放置于50ml容量瓶中，然后用蒸馏水定容到50ml，再采取蒽酮-硫酸比色法测定吸光度，将用分光光度计测得的吸光度值代入葡萄糖的标准曲线中，再利用下面的公式计算多糖提取量的多少。

计算多糖得率的公式如下：

式中c——表示多糖浓度(mg/g)

v——上清液的体积(ml)

n——试验过程中样品稀释倍数

m——银杏中种皮粉末质量(g)

葡萄糖标准曲线

根据浓度不同，溶液吸光度也不同的规则，拟合葡萄糖标准曲线为y＝5.743x+0.0093，r²＝0.9967(式中y是吸光度值，x是葡萄糖溶液浓度)，如图1所示。其中r²的值小数点后两位都是9，说明此葡萄糖标准曲线的标准性比较高。

单因素试验结果与分析

1、提取时间对银杏中种皮多糖提取率的影响

研究结果表明提取时间长短不同对提取的多糖含量有明显影响（见图2），当料液比、木质素过氧化物酶用量、半纤维素酶用量、纤维素酶用量、水浴温度条件保持一致时，随着水浴提取时间的延长，多糖得率呈现先增加后降低的趋势。50-80min的范畴时，水浴时间的加长，中种皮多糖提取量升高，在设置提取时间80min时，多糖提取量到达最大值73.034mg/g。当提取时间持续加长时，多糖提取量降低，造成这种现象的原因可能是由于水浴时间的增长，部分多糖发生分解。根据实验结果，选择70min、80min、90min三个时间，作为正交实验的三个条件设计。

2、料液比对银杏中种皮多糖提取率的影响

研究结果表明料液比不同对提取的多糖含量有明显影响（见图3），当水浴温度、木质素过氧化物酶用量、半纤维素酶用量、纤维素酶用量、提取时间条件一致时，随着料液比增大，多糖得率呈现先增加后降低的趋向。从1:5到1:10，随着料液比的升高，多糖提取量也逐渐升高，在料液比为1:10时，多糖提取量达最大值67.261mg/g。而当料液比继续增大，中种皮多糖提取量呈现逐渐减少的趋向。根据实验操作得出的这个结果，选择1:5、1:10、1:15三个料液比，作为正交实验的三个条件设计。

3、纤维素酶对银杏中种皮多糖提取率的影响

研究结果表明纤维素酶用量不同对提取的多糖含量有明显影响（见图4），当木质素过氧化物酶用量、半纤维素酶用量、料液比、提取温度、提取时间条件一致时，随着纤维素酶用量增多，多糖得率呈现先增加后降低的趋向。从0.3%到0.5%，随着酶用量的升高，多糖提取量也呈现逐渐升高的趋向，在酶用量为0.5%时，多糖提取量达最大值65.341mg/g。而当酶用量继续增大，中种皮多糖提取量呈现逐渐减少的趋向。根据实验操作得出的这个结果，选择0.4%、0.5%、0.6%三个料液比，作为正交实验的三个条件设计。

4、水浴温度对银杏中种皮多糖提取率的影响

研究结果表明水浴温度不同对提取的多糖含量有明显影响（见图5），当料液比、木质素过氧化物酶用量、半纤维素酶用量、纤维素酶用量、水浴时间条件一致时，随着温度的升高，多糖得率呈现先增加后降低的趋向。从50℃到70℃，随着温度逐步的升高，多糖提取量也呈现逐步增多的趋向，在温度升高至70℃时，多糖提取量达最大值94.611mg/g。而当温度继续增大，中种皮多糖提取量呈现出逐渐减少的趋向。推测造成这种情况的理由为当温度过高时纤维素酶丧失活性，影响多糖的提取率。根据实验操作得出的结果，选择65℃、70℃、75℃三个温度，作为正交实验的三个条件设计。

正交实验

正交实验因素与水平

由单因素实验的结果与分析，设置正交实验因素与水平，具体实验方案如下表（表1）。

正交实验结果与分析

正交实验结果如表2所示。通过对表2的分析，可以知道料液比对银杏中种皮多糖的提取影响作用最大，然后依次是水浴温度，提取时间和纤维素酶用量。根据k值得出提取银杏中种皮多糖的最佳工艺配方是a2b3c2d1，也就是当提取温度为70℃、料液比为1:15、纤维素酶用量为0.5%、提取时间为70min时，银杏中种皮多糖提取量将达到理论上的最大值。经实施例2中验证，在此条件下的多糖提取量为103.041mg/g，高于正交实验中的每个组合。