本发明涉及微生物保藏技术领域，具体涉及一种桑黄菌的保藏方法。
背景技术
桑黄是珍稀大型药用真菌，属担子菌亚门(basidiomycota)、多孔菌科(polyporaceae)、纤孔菌属(inonotus)。其主要功能有治疗痢疾、盗汗、血崩、血淋、脐腹涩痛、脱肛泻血、带下、闭经、止泻、延年等，因此有“森林黄金”之美称。桑黄是目前国际公认的生物治癌效果最好的药用真菌，已引起国际科研部门、医药界和保健品行业的广泛关注。
桑黄优良菌种是其生产的基础和关键，因此需要对菌种进行有效的保藏以确保菌种优良的生产性能。桑黄目前常用的是斜面传代保藏法，每隔3-6个月需转管1次，增加了操作和人力成本。虽然有人研究过一些桑黄菌培养方法，但普通培养和保藏的要求是不同的。可以说目前没有关于桑黄菌的保藏方法进行过研究和报道。
因此，在桑黄菌保藏技术领域还缺乏成本低，对设备和操作技术要求不高，可长时间保留桑黄菌株的优良遗传性能的保藏方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种桑黄菌的保藏方法，该方法成本低、操作简单、保藏时间长，菌株菌丝生长和栽培特性不受影响。该方法适合于科研机构和生产企业使用。
一种桑黄菌的保藏方法，采用含有油桐树木屑和枫树木屑的培养基进行保藏。
本发明经过大量探索实验发现油桐树木屑和枫树木屑的混合协同对于桑黄菌的保藏起着比较关键的作用，对于保藏之后恢复使用的桑黄菌的生长速率、生长势和生物学转化率几乎无影响，而尝试了很多其他树种的木屑或者混合均没有这两种的协同作用显著。
上述的桑黄菌的保藏方法，优选油桐树木屑粒径长(0.5-1.5mm)×宽(0.1-0.5mm)；枫树木屑粒径长(0.5-1.5mm)×宽(0.1-0.5mm)。
采用的油桐树和枫树木屑粒径粒径过大会影响保藏效果，粒径过小增加操作难度和成本，本发明两种木屑的粒径是经过发明人大量实验验证发现的较适宜的粒径范围。
适宜的碳氮比和微量元素的添加对于桑黄菌的保藏效果也会产生较大的影响，因为它们是桑黄菌对营养的基本需求，在优选种类和配比的情况下，效果更加突出。
上述培养基还含有调节碳氮比的其他碳源和氮源,调节碳氮比的其他碳源和氮源优选包括麦麸和/或玉米芯粉；优选碳氮比50～80：1。
上述培养基还含有微量元素包括：镁、磷、钾、硫和钙源中的一种或多种。
上述镁源来自硫酸镁，磷源和钾源来自磷酸二氢钾，硫源和钙源来自于石膏粉。
经过大量实验摸索之后获得适合于桑黄菌保藏培养基配方为：m1﹕m2﹕水＝1﹕0.01-0.05﹕1.0-1.8，m1：45-55％油桐树木屑+10-25％枫树木屑+20-50％调节碳氮比的其他碳源和氮源；m2为微量元素。其中m1﹕m2﹕水还可以优选＝1﹕0.02-0.04﹕1.2-1.6。
上述培养基配方优选为：m1﹕m2﹕水＝1﹕0.01-0.05﹕1.0-1.8，m1：45-55％油桐树木屑+10-25％枫树木屑+10-25％麦麸+10-25％玉米芯粉；m2：10-20％硫酸镁+30-40％磷酸二氢钾+45-55％石膏粉。其中m1﹕m2﹕水还可以优选＝1﹕0.02-0.04﹕1.2-1.6。
上述培养基配方进一步优选为：m1﹕m2﹕水＝1﹕0.03﹕1.4，m1：50％油桐树木屑+15％枫树木屑+25％麦麸+10％玉米芯粉；m2：16％硫酸镁+34％磷酸二氢钾+50％石膏粉。
上述的桑黄菌的保藏方法，具体包括以下步骤：a.桑黄菌母种接种至平皿培养基(土豆200g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000ml，ph值自然)上，封口，26℃恒温培养，待菌丝长满皿的三分之二；
b.将以上长好的桑黄菌丝接入灭菌后的保藏培养基(试管中培养基占3/5)中，置26℃恒温培养，当菌丝长入木屑中1厘米时将木屑上方菌丝及菌皮清除，再让其26℃恒温培养直至菌丝长至试管的三分之二即可；
c.长好菌的试管用牛皮纸包扎好，放入自封袋中，4℃保藏。
上述的桑黄菌的保藏方法，菌种需要使用时，从4℃拿出置26℃恒温培养1-2天，即接种使用。
本发明培养基优选制备方法为：
(1)、按照比例先将主料里的两种木屑(油桐树木屑和枫树木屑)混合均匀，然后依次加入麦麸和玉米芯粉混合均匀，再加入混合好的微量元素辅料混合均匀后再加水拌匀；
(2)、拌匀后的培养基装入25mm×200mm玻璃试管中，装量占试管长度的五分之三左右，稍压紧，擦净管口，塞上棉塞。
(3)、用牛皮纸把每支试管棉塞连同管口包扎好，4-7支试管一捆再用牛皮纸包扎好，竖着码入高压灭菌锅，上面盖上聚丙烯塑料膜。
(4)、以上培养基124℃，灭菌2小时；24小时后124℃，灭菌2小时；再24小时后124℃，灭菌1.5小时。
本发明所述的桑黄菌保藏方法，优选具体包含以下步骤：
(1)、桑黄菌母种接种至玻璃平皿培养基上，用封口膜封住边缘，置培养箱中26℃恒温培养，菌丝长满皿的三分之二时即可。
(2)、将以上长好的桑黄菌丝接入灭菌后的试管中，置培养箱中26℃恒温培养，菌丝长至试管的三分之二时即可(菌丝长入木屑中1厘米左右将木屑上方菌丝及菌皮清除，再让其恒温培养)。
(3)、从以上长好桑黄菌丝的试管中随机挑取半数以上接种新鲜试管斜面，进接验证试验，接种完后所有木屑管用牛皮纸包扎好，放入自封袋中，冰箱4℃保藏。验证试验确认没有感染杂菌后即得桑黄保藏菌种。
本发明的优势：
1、本发明的一种桑黄菌的保藏方法，填补了桑黄菌保藏技术领域的空白，为桑黄菌的保藏提供了有效途径。
2、本发明的保藏方法中所使用的培养基，不同于一般的桑黄菌培养时所需的培养基，是根据桑黄菌及其保藏需求摸索出来的最适配方。
3、本发明的保藏方法效果优异，保藏种可有效保藏2-5年；活化后菌丝生长速率，生长势和生物学转化率等基本不会受到影响。
4、本发明方法成本低、操作简单、保藏时间长，菌株菌丝生长和栽培特性不受影响。该方法适合于科研机构和生产企业使用，应用前景好、
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
培养基的制备：
(1)木屑的制备：从山上砍下的油桐树和枫树，分别锯成木屑，油桐树木屑粒径长(0.5-1.5mm)×宽(0.1-0.5mm)；枫树木屑粒径长(0.5-1.5mm)×宽(0.1-0.5mm)，晒干(水份10％以下)。
(2)称取干燥后的木屑，按比例将其混合均匀，然后依次加入麦麸和玉米芯粉混合均匀，再加入混合好的微量元素辅料混合均匀后再加水拌匀。具体比例如下：
m1：50％油桐树木屑+15％枫树木屑+25％麦麸+10％玉米芯粉；m2：16％硫酸镁+34％磷酸二氢钾+50％石膏粉，m1﹕m2﹕水＝1﹕0.03﹕1.4。
(3)拌匀后的培养基装入25mm×200mm玻璃试管中，装量占试管长度的五分之三左右，稍压紧，擦净管口，塞上棉塞。
(4)用牛皮纸把每支试管棉塞连同管口包扎好，4-7支试管一捆再用牛皮纸包扎好，竖着码入高压灭菌锅，上面盖上聚丙烯塑料膜。
(5)包扎好的试管124℃，灭菌2小时；24小时后124℃，灭菌2小时；再24小时后124℃，灭菌1.5小时，冷却后即可使用。
实施例2
桑黄保藏菌种的制备及使用：
(1)桑黄菌母种接种至玻璃平皿培养基上，用封口膜封住边缘，置培养箱中26℃恒温培养，菌丝长满皿的三分之二时即可。
(2)将长好的桑黄菌丝接入实施例1灭菌后的试管中，置培养箱中26℃恒温培养，菌丝长至试管的三分之二时即可(菌丝长入木屑中1厘米左右将木屑上方菌丝及菌皮清除，再让其恒温培养)。
(3)从长好桑黄菌丝的试管中随机挑取半数以上接种新鲜试管斜面，进行验证试验，接种完后所有试管用牛皮纸包扎好，放入自封袋中，冰箱4℃保藏。经验证试验确认没有感染杂菌后即得桑黄保藏菌种。
(4)木屑管菌种需要使用时，从冰箱拿出置培养箱中26℃恒温培养1-2天，即可接种使用。
(5)接种注意事项：接种时，需将试管口至长菌丝之间的部分在火焰上烧一遍(若试管壁上有水，需烧干)，再将木屑菌种表面的菌丝块挑下来弃之，接种下面木屑菌丝到新鲜试管斜面。
实施例3
桑黄保藏菌种对菌株菌丝生长和栽培特性的影响
按实施例1、实施例2技术方案制备的桑黄保藏菌种进行菌丝生长特性和人工栽培试验。试验用菌种：桑黄试管种(斜面：对照组)、本发明桑黄保藏种(试验组：保藏期分别为6个月、一年、二年、三年)。
试验方法：分别将保藏之后的桑黄菌块(0.7cm)接入9cm玻璃平皿正中(每个组5个重复)，26℃恒温培养，观察菌丝长势，接种后第8天测量每个平皿的菌落直径，计算各菌株的生长速率；栽培试验采用人工袋料栽培方式，每个组20袋，观察出菇情况，集中采收后，测定子实体产量，计算生物转化率。
试验结果表明：试验组和对照组相比，其菌丝生长速率和生物学转化率均无显著性差异。
表1：桑黄菌株菌丝生长速率和生物学转化率
注：+++表示菌丝生长浓密，++生长密。
本发明研究出了一种桑黄菌的保藏方法，试验结果表明：本方法的桑黄菌保藏种可有效保藏2-5年，其菌株菌丝生长和栽培特性不受影响。
本发明桑黄培养基主料筛选试验
以下筛选时是纯的木屑做保藏培养基，木屑与水的体积比例为1:1.4。
以下是部分配比探索试验结果
本发明桑黄培养基主料配比对比试验
结果：经桑黄培养基主料筛选和培养主料配比对比试验，结果表明，效果较优的培养基主要组分：45-55％油桐树木屑+10-25％枫树木屑+10-25％麦麸+10-25％玉米芯粉。最佳培养基主料质量组份为：50％油桐树木屑+15％枫树木屑+25％麦麸+10％玉米芯粉。
申请人发现上述经过筛选的最佳培养基配方并不一定最适合桑黄菌普通培养，将配方为m1：50％油桐树木屑+15％枫树木屑+25％麦麸+10％玉米芯粉；m2：16％硫酸镁+34％磷酸二氢钾+50％石膏粉，m1﹕m2﹕水＝1﹕0.03﹕1.4培养基用于培养桑黄菌，结果并不理想，桑黄菌生长速率，生长势等都不是最佳的。
而且申请人将适合于普通培养的培养基配方为土豆200g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000ml，ph值自然，该培养基用于桑黄菌普通培养时，效果非常好，但将普通桑黄菌培养的培养基用于保藏桑黄菌，结果不理想，造成的后果是保藏时间不长，而且菌丝生长速率和生物学转化率会因为保藏时间的延长而受到严重影响。
进一步说明保藏条件的要求不同于普通培养，保藏培养基不仅要求能在低温条件下长时间保持桑黄菌较低的代谢生长，还要保证在需要菌种时，活化后菌丝生长速率，生长势和生物学转化率等基本不会受到影响。而普通的培养需要提供充足的营养让桑黄菌在短时间内迅速生长。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进或变换都属于本发明所附权利要求的保护范围。