本发明属于食品微生物、发酵技术领域，具体地说，是涉及一种精氨酸菌种的纯化方法。
背景技术
l-精氨酸(l-arg)是一种半必需碱性氨基酸，是生物体的重要代谢产物，在食品、医药、饲料等行业具有广泛的应用。随着工业生物技术的蓬勃发展，以及对食品和药用氨基酸生产中的“瓶颈”品种——l-精氨酸的新菌种代谢工程及抗产物反馈抑制的分子改造、工艺优化、代谢控制发酵技术等进行了较深入研究，目前微生物发酵法生产l-精氨酸的技术已得到突破，并广泛应用于工业化大生产。
目前，在l-精氨酸发酵工艺优化过程中，精氨酸菌种为经过基因重组技术所得的棒状杆菌，在分纯复壮环节，精氨酸平板培养基中菌落生长缓慢，需培养72小时菌落直径才达适于挑单株的0.8～1.2mm大小。菌落生长缓慢导致精氨酸分纯周期长，这不但不利于工业化大生产的高效运作，同时也给防污染工作带来一定隐患。
技术实现要素：
针对上述菌落生长缓慢导致精氨酸分纯周期长的技术问题，本发明提供一种精氨酸菌种生长快促使精氨酸分纯周期短的精氨酸菌种纯化方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种精氨酸菌种的纯化方法，步骤为：a、配制分纯平板培养基；b、划线分纯：以l-精氨酸甘油种为出发菌株，用接种环挑环种，放在步骤a的分纯平板培养基上用划线法进行单株分纯，并放到恒温培养箱培养，恒温培养箱的温度为32±0.5℃；c、挑单菌株：培养至48±2h，单株菌落直径达到0.8～1.2mm，用接种环挑选单菌落于斜面培养基中，斜面种放恒温培养箱32±0.5℃培养。所述步骤a的培养基配方为：配方为牛肉膏1.0±0.1％、酵母粉1.0±0.1％、蛋白胨0.5±0.05％、氯化钠0.5±0.05％、琼脂2.0±0.2％、葡萄糖1.0±0.1％、尿素0.25±0.02％、组氨酸0.03±0.002％，ph7.0。通过在分纯平板培养基中添加可被菌种快速利用的c源(葡萄糖)、n源(尿素)以及组氨酸，改善原配方中可供菌体生长的速效c源、n源不足问题，有效地提高了分纯平板培养基中菌落生长的速率，同时通过添加组氨酸提高菌种表达能力，确保分纯单株的产酸率不会降低。此发明有效地缩短精氨酸分纯周期24小时，采用本发明所挑新单菌株上摇瓶发酵试验，产酸率的高低波动幅度更小且多集中在高水平段。
进一步：在上述精氨酸菌种的纯化方法中，所述的步骤a是将培养基用纯化水溶解，水浴加热至融化，定容后调ph为7.0，121±1℃灭菌20±2分钟，待培养基冷却至50±2℃，按无菌操作法倒入平板平置，凝固后放32±2℃培养箱预孵24±2小时。所述的按无菌操作法倒入平板平置是指按无菌操作法倒2只平板平置，所述平板培养基装量是15±1ml。所述的步骤b中划线法是指将平板皿作分区标记，在平板皿底划分成a、b、c、d四个面积不等的区域，各区之间的交角应为120±10℃。
即所述的步骤b划线法还包括在每个区域中划连续的平行线。将分纯平板作分区标记，在皿底将整个平板划分成a、b、c、d四个面积不等的区域，各区之间的交角应为120℃左右(平板转动一定角度约60℃)。选用平整、圆滑的接种环。在酒精灯旁，以l-精氨酸甘油种为出发菌株，按无菌操作法挑取一环菌种,将接种环先在a区划3-4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。转动平板，让接种环通过a区(菌源区)将菌带到b区，随即划数条致密的平行线。再从b区作c区的划线。最后经c区作d区的划线，d区的线条应与a区平行，但划d区时切勿重新接触a、b区，以免将该两区中浓密的菌液带到d区，影响单菌落的形成，随即将皿盖盖好。迅速打开第二个平板，将带有d区菌液的接种环按上述方法，在四个分区上进行划线。完成后随即将皿盖盖好，用火将接种环上的残菌灭活。将划好线的分纯平板放到恒温培养箱培养，恒温培养箱的温度为32±0.5℃。
与现有技术相比，本发明通过在分纯平板培养基中添加可被菌种快速利用的c源(葡萄糖)、n源(尿素)以及组氨酸，为了寻找最佳分纯平板培养基配比，进行了大量的培养基优化试验，最终找到有利于快速长菌的c源、n源，以及有效提高菌种表达能力可提高产酸率的组氨酸，并通过用量优化试验确立了最佳优化配比，改善原配方中可供菌体生长的速效c源、n源不足问题，有效地提高了分纯平板培养基中菌落生长的速率，同时通过添加组氨酸提高菌种表达能力，确保分纯单株的产酸率不会降低。本发明有效地缩短精氨酸分纯周期24小时，采用本发明所挑新单菌株上摇瓶发酵试验，产酸率的高低波动幅度更小且多集中在高水平段。本发明采用划线分纯法进行单菌落分离，对比原工艺的稀释分纯法，其优点为步骤更简化、菌种特性保持更稳定。本发明对比原工艺，减少了由甘油种经24h活化斜面培养或17h一级种子培养再到分纯平板分离的过程，而是直接由甘油种到分纯平板分离，步骤简化，时间节省了一天，而且菌种减少了一次活化传代，有利于菌种特性的稳定。与现有工艺相对，本发明分纯平板培养基上单菌落生长速度更快，且对提高发酵产酸水平更有利，能有效改善精氨酸分纯周期长的问题。提高了分纯复壮的工作效率，同时降低了培养周期长带来的污染风险。
具体实施方案
下述实施例更详细地说明了本发明。以下对本发明的优选实例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
对照例
步骤a：配制分纯平板培养基。配方为牛肉膏1.0％、酵母粉1.0％、蛋白胨0.5％、氯化钠0.5％、琼脂2.0％、葡萄糖0.1％、尿素0％、组氨酸0％，ph7.0。步骤b：划线分纯。以l-精氨酸甘油种为出发菌株，用接种环挑一环种，于分纯平板培养基上用划线法进行单株分纯，放恒温培养箱32℃培养。步骤c：挑单菌株。培养至72h，菌落直径达适于挑单株的0.8～1.2mm大小，用接种环挑选单菌落于斜面培养基中，斜面种放恒温培养箱32℃培养。步骤d：筛选优良单菌株。单菌株斜面培养至24h，分别进行摇瓶种子、摇瓶发酵试验，92h放瓶测发酵产酸率，选取种子生长良好、产酸率高、无污染的优良单菌株。
实施例
步骤a：配制改良后分纯平板培养基。配方为牛肉膏1.0％、酵母粉1.0％、蛋白胨0.5％、氯化钠0.5％、琼脂2.0％、葡萄糖1.0％、尿素0.25％、组氨酸0.03％，ph7.0。步骤b：划线分纯。以l-精氨酸甘油种为出发菌株，用接种环挑一环种，于分纯平板培养基上用划线法进行单株分纯，放恒温培养箱32℃培养。步骤c：挑单菌株。培养至48h，菌落直径达适于挑单株的0.8～1.2mm大小，用接种环挑选单菌落于斜面培养基中，斜面种放恒温培养箱32℃培养。步骤d：筛选优良单菌株。单菌株斜面培养至24h，分别进行摇瓶种子、摇瓶发酵试验，92h放瓶测发酵产酸率，选取种子生长良好、产酸率高、无污染的优良单菌株。
对照例与实施例的差异点是改良了分纯平板培养基配比，在原工艺有机氮源、氯化钠、琼脂配比不变的基础上，把葡萄糖由0.1％增加至1.0％，同时添加0.25％尿素、添加0.03％组氨酸。
试验结果：在本发明工艺的分纯平板培养基中上，单菌落生长速度更快，单菌落达适于挑单株的0.8～1.2mm大小时间由对照工艺的72h缩短到48h，有效地缩短精氨酸菌种分纯周期24小时。本发明所挑新单菌株上摇瓶发酵试验，产酸率的高低波动幅度更小且多集中在高水平段。
以下数据以举例来进一步说明本发明，因此不应该构成本发明范围的限制内容，试验数据见下表：
显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。