一种低温厌氧发酵菌剂的制备方法及用途与流程

文档序号：15626412发布日期：2018-10-09 23:05阅读：237来源：国知局

本发明属于固废资源化领域，具体涉及一种低温厌氧发酵菌剂的制备方法及用途。

背景技术：

随着环境的日益恶化，资源的逐渐枯竭，可再生能源的开发与利用越来越受到国际社会的广泛重视。在可持续发展的理念下，我国政府把节能减排作为主攻方向，其中，固体废弃物发酵沼气工程作为一种新形势下的技术手段，已随着我国经济发展，人民生活水平的提高，工业、农业、养殖业的发展，成为我国可再生能源利用和环境保护的切实有效的方法。通过对沼气、沼液、沼渣的综合开发利用，提高沼气生产的生态、经济与社会效益。

作为固体废弃物重要组成部分的城市生活垃圾，用厌氧发酵法处理生活垃圾有机质产生沼气已经被普遍应用。厌氧发酵消化过程是多菌群相互交替作用的复杂过程，参与代谢的微生物菌群也相当复杂，有水解性细菌、还原乙酸细菌、产甲烷菌等等。在水解细菌所产生的各种水解酶作用下，大分子的蛋白质、脂肪、纤维素、淀粉水解为水溶性的酸、醇、糖等小分子化合物以及少量h2和co2，然后进一步发酵形成乙酸盐等，为甲烷菌提供充足的营养物质，甲烷菌完成正常代谢后产出甲烷气体。

在我国北方寒冷地区，由于冬天温度较低且持续时间较长，生活垃圾有机质厌氧发酵前期启动时间过长，急需要相关技术解决这一难题。目前的专利技术多采用增温保温等设备，存在设备耗能巨大，污染严重的不足之处，如专利申请号200910072015.8的北方沼气厌氧发酵联合加热系统，包括由太阳能集热器、换热器等组成的沼气发酵太阳能加热系统和由风力发电机、蓄电池、逆变器等组成的沼气发酵风力发电电加热系统，其工艺较复杂，使用了太阳能和风能技术，若发酵全程使用设备运行成本较高；专利申请号200520055857.x的恒温厌氧发酵装置，利用保温层阻止发酵池内的热量通过池壁释放，利用加热装置给发酵池增温，利用温控器控制发酵池内的温度，这些装置耗费较多的不可再生能源；专利申请号200820028152.2的加热保温厌氧发酵罐，罐体内壁及罐底设置的供热管组和罐体内的温度探测仪，虽然可以达到加热及测温目的，但供热管组和探测仪的使用耗能较大，且热能较易散失。

因此，需要优选出低温发酵细菌，在低温下分解生活垃圾中的有机质，缩短厌氧发酵前期启动时间，使沼气发酵中难分解的有机质得到更彻底的分解利用，从而提高沼气产量。

技术实现要素：

为了解决北方冬季生活垃圾有机质厌氧发酵前期启动时间过长、能耗较高的难题，本发明提供一种低温厌氧发酵菌剂，利用耐低温菌群在温度较低时无需加热而分解生活垃圾有机质，缩短厌氧发酵前期启动时间，减少能耗，节约成本。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种低温厌氧发酵菌剂的制备方法，其特征在于，包括制备菌剂a，所述菌剂a由包含缺陷短波单胞菌(brevundimonasdiminuta)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)和铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)的菌种混合而成。

优选地，所述菌剂a中，所述缺陷短波单胞菌的质量百分含量为30％～35％，所述嗜麦芽糖寡养单胞菌的质量百分含量为30％～35％，所述铜绿假单胞菌的质量百分含量为30％～35％。

优选地，还包括制备菌剂b，所述菌剂b由草木灰与枯草芽胞杆菌枯草亚种(bacillussubtilissubsp.subtilis)的菌粉混合而成。

优选地，所述菌剂b中，所述草木灰和枯草芽胞杆菌枯草亚种的菌粉的质量比为5-9：2-7。

优选地，所述草木灰为秸秆与锯末完全焚烧后得到的混合物，其中秸秆与锯末的质量比为6-9：2-5。

优选地，所述缺陷短波单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌枯草亚种按照包括如下步骤的方法制得：

(a)菌种活化：将斜面菌种置于10℃～15℃条件下静止培养后，接种于液体发酵培养基中，于10℃～15℃振荡培养45-50小时；

(b)一级液体培养：将菌种活化得到的菌液接种于新的液体发酵培养基中，于10℃～15℃振荡培养45-50小时；

(c)二级液体培养：将一级液体培养得到的菌液接种于新的液体发酵培养基中，于10℃～15℃振荡培养45-50小时；

(d)三级液体培养：将二级液体培养得到的菌液接种于新的液体发酵培养基中，于10℃～15℃振荡培养45-50小时；

(e)发酵罐发酵：将三级液体培养得到的菌液接种于新的液体发酵培养基中，于10℃～15℃振荡培养45-50小时，得到发酵液；

(f)菌粉制备：将缺陷短波单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、铜绿假单胞菌的发酵液分别离心，去上清，对收集的菌体进行真空冷冻干燥，粉碎后得菌粉；对枯草芽胞杆菌枯草亚种的发酵液进行喷雾干燥后得菌粉。

优选地，所述步骤(b)～(e)中，菌液的接种量为液体发酵培养基体积的5～10％，振荡培养条件为150r·min^-1～200r·min^-1；所述步骤(f)中，所得菌粉的含水量为2％～5％。

任一所述的制备方法制备得到的低温厌氧发酵菌剂。

优选地，将菌剂a与有机废弃物混匀后在10～30℃的温度下进行厌氧发酵，产生沼气；所述菌剂a的用量为有机废弃物质量的10％～20％。

优选地，在进行厌氧发酵前，使用菌剂b调节有机废弃物的总固体含量为15％～28％，w(c)/w(n)为20～30：1，w(c)/w(p)为40～60：1，ph为6.8～7.4，然后在20～25℃的温度下静置发酵5-10小时。

本发明研究发现，由缺陷短波单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌和铜绿假单胞菌组成的耐低温菌群，能够在温度较低时水解生活垃圾中的有机质，可不用加热设备对发酵物料进行加热，不仅缩短了厌氧发酵前期启动时间，还降低了发酵所需能耗。所述缺陷短波单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌和铜绿假单胞菌相互之间不存在抑制拮抗作用，三种菌在厌氧发酵过程中相辅相成，提高了蛋白质、纤维素、脂肪等有机物的降解效率，使厌氧发酵前期的水解阶段从4～5天缩短至2～3天，从而解决我国北方地区冬季厌氧发酵前期启动时间长的问题。

本发明的低温厌氧发酵菌剂，包含菌剂a，其制备工艺十分简单，只需分别培养缺陷短波单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌和铜绿假单胞菌，将三种菌的发酵液制成菌粉后按比例混合而成。菌种可以通过大型发酵罐进行规模生产，其产品为发酵液或发酵液的制成品。

本发明的低温厌氧发酵菌剂，可以进一步包含菌剂b，在低温厌氧发酵之前对有机废弃物进行预发酵。菌剂b中的枯草芽胞杆菌枯草亚种能够迅速消耗环境中的游离氧，造成低氧，促进有益厌氧菌生长；产生的枯草菌素、短杆菌肽等活性物质对致病菌有明显的抑制作用，产生的有机酸类能够降低环境ph，抑制其它致病菌的生长；生长过程中合成的α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类可初步水解有机废弃物。菌剂b中的草木灰用于调节物料的总固体含量、w(c)/w(n)、w(c)/w(p)和ph，提高发酵效率。

所述缺陷短波单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、铜绿假单胞菌和枯草芽胞杆菌枯草亚种的制备方法包括：菌种活化、一级液体培养、二级液体培养、三级液体培养、发酵罐发酵、菌粉制备。

所述一级液体培养、二级液体培养、三级液体培养和发酵罐发酵的培养条件优选为：10℃～15℃，摇床转速150r·min^-1～200r·min^-1，培养45-50小时。

所述液体发酵培养基的配方优选为：以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2％～0.4％、蛋白胨1％～2％、酵母浸膏0.1％～0.5％、蔗糖1％～2％、余下为蒸馏水，ph为7～9。更优选为：以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.3％、蛋白胨1％、酵母浸膏0.1％、蔗糖2％、余下为蒸馏水，ph为7。

本发明为了提高有机废弃物的降解率和产气率，在使用菌剂a进行厌氧发酵前，优选使用菌剂b调节有机废弃物的总固体含量、w(c)/w(n)(碳氮质量比)、w(c)/w(p)(碳磷质量比)、ph，并在20～25℃的温度下静置发酵5-10小时。

采用本发明的低温厌氧发酵菌剂对有机废弃物进行处理，具有以下优点：

1.通过枯草芽胞杆菌枯草亚种对有机废弃物进行预发酵，为随后的厌氧发酵提供低氧环境并抑制有害菌生长，从而提高厌氧发酵效率。

2.能够将反应前期水解阶段时间从4～5d缩短至2～3d，使有机生活垃圾在厌氧消化反应器的停留时间由15～20d缩短至13～18d，提高了发酵效率。

3.发酵前期无需加热，减少了北方冬季生活垃圾资源化处理过程中的热能消耗，降低了运营成本。

4.有机废弃物中的蛋白质、纤维素、脂肪等物质得到充分降解，提高了沼气产量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的保护范围。

生物材料：

缺陷短波单胞菌(brevundimonasdiminuta)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号：cicc10816；

嗜麦芽糖寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号：cicc22935；

铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号：cicc10204；

枯草芽胞杆菌枯草亚种(bacillussubtilissubsp.subtilis)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号：cicc21171。

中国工业微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，邮编：100015，电话：010-53218311，传真：010-53218307，邮箱：sales@china-cicc.org。

上述菌种本实验室亦有保存，申请人声明：自申请日起二十年内可向公众免费发放用于必要的验证实验。应该理解的是，本发明的实现并不依赖于上述菌株编号所代表的具体菌株，每个菌株可以采用同一菌种中的其它菌株进行替代。因此，在此提供的菌株不用于限制本发明的保护范围。

主要试剂：

牛肉浸膏，购自北京奥博星生物技术有限责任公司，产品货号01-009-2；

蛋白胨，购自北京奥博星生物技术有限责任公司，产品货号01-001-1；

酵母浸膏，购自北京奥博星生物技术有限责任公司，产品货号01-014-2；

琼脂粉，购自北京奥博星生物技术有限责任公司，产品货号01-024；

下述实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可；未特别说明的实验方法和条件可参考本领域常规实验方法和条件或产品说明书记载的实验方法和条件。

实施例1.低温厌氧发酵菌剂的制备

1.斜面菌种活化

将缺陷短波单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、铜绿假单胞菌和枯草芽胞杆菌枯草亚种的斜面菌种置于10℃～15℃条件下静止培养48h。从斜面菌种中挑取2环接种到100ml液体发酵培养基(预先装入250ml三角瓶)中，在10℃～15℃，摇床转速150r·min^-1～200r·min^-1的条件下培养45-50小时(优选48h)。

斜面保存所使用的培养基为牛肉膏蛋白胨(na)培养基，制备方法为：将牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母浸膏1g，蔗糖10g，琼脂粉20g，溶于蒸馏水中，定容至1000ml。配制好的斜面培养基在121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温后使用。

液体发酵培养基的配方为：以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2％～0.4％、蛋白胨1％～2％、酵母浸膏0.1％～0.5％、蔗糖1％～2％、余下为蒸馏水，ph为7～9。配制好的液体发酵培养基在121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温后使用。

2.一级液体培养

分别对缺陷短波单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、铜绿假单胞菌和枯草芽胞杆菌枯草亚种进行一级液体培养，步骤如下：将斜面菌种活化得到的菌液接种于新的液体发酵培养基中，接种量为5～10％(v/v)，在10℃～15℃，摇床转速150r·min^-1～200r·min^-1条件下培养45-50小时(优选48h)，进行一级液体培养。

3.二级液体培养

将一级液体培养得到的菌液接种于新的液体发酵培养基中，接种量为5～10％(v/v)，在10℃～15℃，摇床转速150r·min^-1～200r·min^-1的条件下培养45-50小时(优选48h)，进行二级液体培养。

4.三级液体培养

将二级液体培养得到的菌液接种于新的液体发酵培养基中，接种量为5～10％(v/v)，在10℃～15℃下，摇床转速150r·min^-1～200r·min^-1的条件下培养45-50小时(优选48h)，进行三级液体培养。

5.发酵罐发酵

将三级液体培养得到的菌液接种于新的液体发酵培养基中，接种量为5～10％(v/v)，在10℃～15℃，摇床转速150r·min^-1～200r·min^-1的条件下发酵45-50小时(优选48h)，进行液体发酵，得到发酵液。

6.菌粉制备

(1)缺陷短波单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、铜绿假单胞菌的菌粉制备方法：将发酵液在8000r/min的条件下离心5分钟，去上清，对收集的菌体进行真空冷冻干燥，使最终含水量为2％～5％，然后进行粉碎，得到菌粉。

(2)枯草芽胞杆菌枯草亚种的菌粉制备方法：将发酵液物料泵送至喷雾干燥塔顶部，由离心式雾化器在15000-18000rpm下进行雾化，用进口温度为140-155℃的热空气进行并流干燥，干燥物料经旋风分离器引出后从接料桶中回收，即得菌粉。

7.混合：将缺陷短波单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、铜绿假单胞菌的菌粉按照30～35：30～35：30～35的质量比混匀，得到菌剂a。将草木灰与枯草芽胞杆菌枯草亚种的菌粉按照5-9：2-7的质量比混匀，得到菌剂b。草木灰：秸秆与锯末完全焚烧后得到的混合物，其中秸秆与锯末的质量比为6-9：2-5。

实施例2.北方冬季有机质生活垃圾发酵

取某小区生活垃圾中的有机废弃物，将菌剂a与有机废弃物混匀后在10～30℃的温度下进行厌氧发酵，每3-4天搅拌一次物料，每次搅拌3-4小时，厌氧发酵反应13～18天。所述菌剂a的用量为有机废弃物质量的10％～20％。

为提高沼气产率，在使用菌剂a进行上述厌氧发酵之前，先用菌剂b对有机废弃物进行预发酵。具体地，用菌剂b调节有机废弃物的总固体含量为15％～28％，w(c)/w(n)为20～30：1，w(c)/w(p)为40～60：1，ph为6.8～7.4，然后在20～25℃的温度下静置发酵5-10小时。

实验例1