本发明涉及分子生物学
技术领域：
，具体涉及mir1-24和her2-shrna双基因表达盒病毒载体、构建方法、病毒、应用。
背景技术：
：乳腺癌是全世界女性最常见的肿瘤，在我国其发生率占全身恶性肿瘤的7％～10％，且发病年龄有年轻化倾向。虽然通过早期筛查和诊断，乳腺癌死亡率正逐年下降，但发病率仍居女性肿瘤发生的首位，严重威胁着女性健康。目前治疗乳腺癌的主要方法有手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗等。化疗是浸润性乳腺癌的主要疗法，但是经过治疗后乳腺癌患者仍有复发转移的危险。迄今为止，复发转移性乳腺癌仍是不能被治愈的疾病，其5年总生存率仍不足25％。随着生物技术的进步，临床靶向治疗有了很大的进展，分子靶向治疗也已成为乳腺癌治疗的有效手段之一。人表皮生长因子受体2(her2)是一种原癌基因，定位于人类染色体17q21-22，编码p185蛋白，是表皮生长因子受体家族(egfr)的第二成员，与egfr家族其他成员及其配体之间相互作用，转导细胞增生信号，调节细胞的生长、生存、分化和增殖。正常情况下处于非激活状态，内外界因素的刺激可使其结构或表达失常，激活转化为癌基因，表现为her2基因扩增或编码受体蛋白的过度表达，her2基因扩增与细胞增殖和迁移、肿瘤的侵袭和转移、血管生成以及细胞的凋亡减少有关。her2在大约22％的早期乳腺癌和35％的局部晚期和转移性乳腺癌患者以及40％的炎性乳腺癌患者中存在着扩增或蛋白的过度表达，与乳腺癌的进展和不良预后密切相关，是乳腺癌靶向治疗的明确靶点。目前也研究开发出一些靶向药物，但是这些靶向药物存在对患者心脏毒性负担重，价格昂贵等缺陷，在临床应用上存在很多局限性。干扰rna技术是一种新兴的转录后基因沉默技术，指在进化过程中高度保守的、由双链rna诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象。它通过21-23nt的dsrna或发夹状rna与特异性mrna结合，导致靶基因的降解，进而下调目的产物的表达，不会产生全身毒性反应等传统治疗方法的局限性。rna干扰技术具有简单迅速、特异、高效、经济等优点，已经被广泛用于探索基因功能和恶性肿瘤的基因治疗的领域。现有技术中为了克服传统her2靶向药的缺陷，研究应用不同种类的sirna沉默乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、非小细胞肺癌等细胞中her2基因，证实可以显著下调her2mrna和her2蛋白的水平，特异性地抑制肿瘤细胞的增殖，而且也进一步为了提高sirna在细胞内的稳定性，研究出了病毒介导的her2-shrna载体，能够成功的转染目标细胞，实现对目标细胞的抑制生长增殖作用。然而目前研究出的her2-shrna病毒载体转染乳腺癌、卵巢癌等her2高表达的细胞后对细胞的抑制增殖效果仍然不能满足实际的需求，需要对该病毒载体做进一步的研究以提高其对目标细胞的抑制增殖作用。技术实现要素：为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一是提供mir-124和her2-shrna双基因表达盒病毒载体，转染效率高，能够高效的将mir-124和her2-shrna整合到目标细胞的基因组中，在目标细胞中同时表达mir-124和her2-shrna，更显著地抑制乳腺癌细胞的增殖并促进其凋亡。本发明的目的之二是提供mir-124和her2-shrna双基因表达盒病毒载体的构建方法。本发明的目的之三是提供由本发明双基因表达盒病毒载体构建得到的病毒。本发明的目的之四是提供一种本发明双基因表达盒病毒载体以及构建的病毒在制备治疗乳腺癌、卵巢癌等her2阳性肿瘤药物方面的应用。为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：mir-124和her2-shrna双基因表达盒病毒载体，包括在病毒表达载体中整合连接mir-124序列和her2-shrna序列构建而成；其中mir-124序列如seqidno.1所示，her2-shrna序列如seqidno.2和seqidno.3所示。可选的，所述病毒表达载体为腺病毒表达载体、慢病毒表达载体或逆转录病毒表达载体。可选的，所述病毒表达载体为慢病毒表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro载体质粒。上述mir-124和her2-shrna双基因表达盒病毒载体的构建方法，包括以下操作步骤：1)人工合成mir-124序列和her2-shrna序列；2)对步骤1)人工合成的mir-124序列和her2-shrna序列分别进行pcr扩增；3)将步骤2)的pcr扩增产物和慢病毒表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro分别进行酶切；4)将步骤3)的酶切产物进行连接，得重组慢病毒载体；5)将步骤4)的重组慢病毒载体进行测序和比对，比对序列和表达行为正确的重组慢病毒载体即为构建成功的mir-124和her2-shrna双基因表达盒病毒载体。可选的，步骤2)中mir-124序列的扩增引物序列为：mir124-f：gaattcctgtgtgattgggggagctg；mir124-r：gcggccgcctctaagcccctgtctgtcac；her2-shrna序列的扩增引物序列为：her2shrna-f：gcggccgcggatccgaattctgcggher2shrna-r：gcggccgcctattaataactaatgc。可选的，步骤5)中对重组慢病毒载体进行测序和比对的具体方法为：将步骤4)获得的重组慢病毒载体转化dh5α感受态细胞，并进行pcr鉴定，对pcr鉴定的阳性克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的mir-124和her2-shrna双基因表达盒病毒载体；其中pcr鉴定过程中使用的引物序列为：cmv-f：cgcaaatgggcggtaggcgtg；ef1-r：cgccaccttctctaggcac。可选的，步骤3)中将pcr扩增产物和慢病毒表达载体分别进行酶切的具体方法为：采用限制性内切酶ecori和noti对mir-124pcr扩增产物进行双酶切，采用限制性内切酶noti对her2-shrna进行单酶切，采用限制性内切酶ecori和noti对慢病毒表达载体进行双酶切，酶切后分别得到mir-124序列片段条带、her2-shrna序列片段条带、线性化的慢病毒载体。可选的，步骤4)中将酶切产物进行连接的具体方法为：采用t4dna连接酶将上述酶切产物进行连接。一种病毒，采用上述mir-124和her2-shrna双基因表达盒病毒载体构建而成。一种慢病毒，采用上述mir-124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒载体构建而成。进一步的，上述慢病毒为采用慢病毒包装质粒prsv-rev、pmdlg-prre和pmd2.g对mir-124和her2-shrna双基因表达盒病毒载体进行包装，通过转染hek293细胞，构建制得mir-124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒。上述病毒在制备预防和治疗her2阳性肿瘤药物方面的应用。可选的，可以采用上述病毒，尤其是上述慢病毒，制备成预防和治疗乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的基因疫苗、基因靶向药物等。本发明mir-124和her2-shrna双基因表达盒病毒载体能够高效的构建得到mir-124和her2-shrna双基因表达盒病毒，对乳腺癌细胞(mcf7，mcf-10a，mda-mb-231)转染率高达80％～90％，在乳腺癌细胞中能够高效稳定地表达mir-124和her2-shrna，发挥协同增效作用，能够显著的抑制乳腺癌细胞的增殖并促进凋亡，可用于乳腺癌、卵巢癌等her2阳性肿瘤的基因治疗。附图说明图1是pcdh-cmv-efl-copgfp-t2a-puro慢病毒表达载体图谱；图2是prsv-rev慢病毒包装质粒谱；图3是pmdlg-prre慢病毒包装质粒图谱；图4是pmd2.g慢病毒包装质粒图谱；图5是不同慢病毒感染mcf-7细胞后对mcf-7细胞的抑制增殖情况；图6是不同慢病毒感染mcf-7细胞后的mir-124基因表达量；图7是不同慢病毒感染mcf-7细胞后的her2-shrna基因表达效果；图8是移植瘤法裸鼠成瘤图片；从左到右为：未感染慢病毒，感染her2-shrna基因表达慢病毒,感染mir-124基因表达慢病毒，感染mir-124和her2-rna双基因表达盒慢病毒；图9是移植瘤法裸鼠肿瘤细胞感染不同慢病毒后的肿瘤重量；图10是移植瘤法裸鼠肿瘤细胞感染不同慢病毒后的肿瘤生长曲线。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。下述实施例中采用的主要试验试剂：大肠杆菌菌株dh5a(invitrogen)；胎牛血清fbs(invitrogen)；膜蛋白酶(invitrogen)；dmem完全培养基(含10％fbs、loou/ml青霉素和looμg/ml链霉素)(invitrogen)；限制性内切酶(neb公司)；t4dna连接酶(neb公司)；质粒dna提取试剂盒(axygen公司)；制备感受态试剂盒(biosciences)；kod401(takara)；逆转录酶mulv(neb)；rnase抑制剂(neb)；sybrgreenqpcrmastermix(2x)(thermoscientific)；pcdh-cmv-efl-copgfp-t2a-puro、prsvrev，pmdlgprre和pmd2.g，均可商购于河南九睿生物技术有限公司。实施例1构建mir-124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒载体，具体操作步骤为：1)人工合成如seqidno.1所示的mir-124序列和如seqidno.2和seqidno.3所示的her2-shrna序列；2)采用kod高保真酶，分别以步骤1)人工合成的mir-124序列和her2-shrna序列为模板，通过如表1所示引物分别进行pcr扩增：表1引物名称引物序列mir124-fgaattcctgtgtgattgggggagctgmir124-rgcggccgcctctaagcccctgtctgtcacher2shrna-fgcggccgcggatccgaattctgcggher2shrna-rgcggccgcctattaataactaatgcpcr扩增的具体试剂用量如下表2所示：表2pcr扩增的程序条件如下表3所示：表33)琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物大小是否与预期一致，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的片段条带，用dna回收试剂盒回收纯化，得相应的pcr扩增mir124序列和pcr扩增her2shrna序列；4)用ecori和noti限制性内切酶对pcr扩增mir124序列进行双酶切，用noti限制性内切酶对pcr扩增her2shrna序列进行单酶切，用ecori和noti限制性内切酶对慢病毒表达载体pcdh-cmv-mcs-efl-copgfp进行双酶切(于37℃酶切3h)，反应体系和反应条件如表4、表5和表6所示:表4试剂剂量mir12410-20μgecor1(neb，r3101或r0101)1μlnot1(neb，r3189或r0189)1μl10×buffer(neb，3.1)5μlddh2oupto50μl表5表6试剂剂量pcdh-cmv-efl-copgfp-t2a-puro10-20μgecor1(neb，r3101或r0101)1μlnot1(neb，r3189或r0189)1μl10×buffer(neb，3.1)5μlddh2oupto50μl5)琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的mir124和her2shrna基因片段条带和线性化的慢病毒载体，用胶回收试剂盒回收，得相应的酶切产物；6)用t4dna连接酶于16℃水浴下，将上述酶切产物进行连接，过夜；反应如表7：表7试剂体积loxt4dna连接酶buffer2μlt4dna连接酶(400u/μl)lμlmir124/her2shrna基因片段loμl线性化的慢病毒表达载体4μlddh203μl总体积20μl7)转化感受态细胞：从80℃冰箱取出1管looμldh5a感受态细胞，放冰上解冻(解冻至无冰状态)后取loμl上述步骤6)中的连接产物加到感受态细胞中混匀，静置30min,42℃水浴热激lmin，冰上静置2min，加lb液体培养基500μl，37℃振荡培养1小时，3000rpm离心5min，留100μl左右上清液混匀细菌后涂到lb平板上，37℃倒置培养过夜；8)挑取数个菌落，做菌落pcr检测转化子，反应体系和条件同步骤2)；9)将菌落pcr鉴定得到的阳性克隆进行测序验证，测序引物如表8：表8引物名称引物序列cmv-fcgcaaatgggcggtaggcgtgef1-rcgccaccttctctaggcac测序验证序列正确的克隆即为mir-124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-mir124-her2shrna-ef1-copgfp-t2a-puro。实施例2构建mir-124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒，具体操作步骤为：1、用膜蛋白酶消化对数生长期的hek293细胞，细胞密度为5×106，重新接种于含有25ml含10％(v/v)fbs的无抗生素dmem培养基直径为15cm的细胞培养皿中，37℃，5％c02培养箱内培养；2、制备慢病毒包装系统中四种质粒dna溶液，制粒图谱如图1～4所示：表9质粒名称质量prsv-rev1oμgpmdlg-prre15μgpmd2g7.5μgpcdh-cmv-mir124-her2shrna-ef1-copgfp-t2a-puro20μg将以上质粒加入无菌水定容至1800μl，再加入cacl2(2.5mol/l)溶液200μl混匀，加入2×pbs缓冲盐溶液2000μl，室温放置20-30min；3、当步骤1培养的细胞密度达约70％时进行转染：将步骤2中制备的dna和氯化钙混合液转移至步骤1得到的含单层细胞的细胞培养皿中，混匀，培养12h后弃去培养液，细胞用15mlpbs溶液冲洗，共洗3次；4、向上述步骤3细胞培养皿中加入含looml/lfbs的dmem细胞培养液15ml，继续培养48h；5、收集转染72h的hek293细胞上清液；6、将收集的上清液于4℃，4000g离心lomin，再次收集上清液：7、将再次收集得到的上清液以0.45μm滤器过滤：8、将滤液于40ml超速离心管中，4℃，35000r/min离心120min，弃上清液；9、然后以冰500ulpbs重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜，得到慢病毒液，即mir124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒。实施例3实施例2构建的mir124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒的细胞转染和筛选：具体步骤为：ⅰ：在6孔细胞培养板中培养mcf-7细胞，待细胞完全贴壁汇合度为30％～40％后即可进行细胞转染：转染前，每孔细胞换成新鲜的dmem完全培养基，并且6孔板每孔加入1μl的polybrene，放置于培养箱孵育lh；ⅱ：在上述6孔细胞培养板的5个孔中，分别加入0.1μl实施例2得到的mir124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒液，充分的摇匀后放入37℃、5％(v/v)c02、95％相对湿度的培养箱中培养1～5天，于每天加入cck8试剂20μl/孔，继续培养3h后，在450nm处测定各孔吸光度od值；ⅲ：按照上述步骤ⅰ和ⅱ同样的方法分别检测细胞感染空载慢病毒液(空载慢病毒液与mir124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒液的唯一区别是不含有mir124和her2-shrna基因，其余制备方法都相同)、mir-124基因表达慢病毒(mir-124基因表达慢病毒与mir124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒液的唯一区别是不含有her2-shrna基因，其余制备方法都相同)、her2-shrna基因表达慢病毒(her2-shrna基因表达慢病毒与mir124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒液的唯一区别是不含有mir124基因，其余制备方法都相同)后的吸光度；上述检测过程中设置空白细胞做对照；检测结果如图5所示：结果表明感染mir124和her2shrna双基因表达盒慢病毒对mcf7细胞的抑制增值作用由于单一的mir124基因表达慢病毒和单一的her2shrna基因表达慢病毒，表明mir124和her2shrna双基因表达盒慢病毒感染细胞后mir124和her2shrna同时表达，相互之间发挥协同作用，提高慢病毒的稳定性的同时，提高慢病毒对目标细胞的抑制增殖作用。实施例4实施例2构建的mir124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒转染细胞后的表达量检测，具体步骤为：一、mcf-7细胞总rna提取：1)在96孔细胞培养板中培养mcf-7细胞，孔板中对应加入10ulmir-124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒、空载慢病毒、mir-124基因表达慢病毒、her2-shrna基因表达慢病毒；2)72h后提取不同慢病毒感染细胞后的总rna，具体检测方法为：将加入不同慢病毒的细胞分别用pbs缓冲液冲洗，1000rpm离心5min，去上清，加入4℃预冷的总rna提取剂(trizol)，反复吹吸，使细胞与试剂充分完全混合，充分裂解，于室温静置10min；混合细胞的trizol液移入无酶ep管后加入0.2ml氯仿，充分混匀后，在15-30℃静置3-5min；4℃低温，12000g离心，15min；将无酶ep管中上层清亮液体转移到新的ep管中，每1mltrizol加入0.5ml异丙醇后充分混匀，15-30℃静置10min，4℃低温，12000g离心，15min；预先配置75％乙醇，置于4℃冰箱备用；可见ep管底部白色沉淀，弃上清，加入1ml预冷75％乙醇，对rna进行清洗，涡旋仪上震荡后置于4℃低温离心机，7500g离心5min；ep管取出后用100μl的无酶枪头吸净上清，所留沉淀物风干5min；用depc水20μl溶解rna，dnasei消化，去除残留的基因组dna；将沉淀充分混匀，置于冰块上待用，得总rna；总rna浓度检测：核酸仪开机预热，后用depc水清洗探头3次，再用depc水进行仪器调零，最后将待检样品上机测定总rna浓度；a260/a280比值范围保持1.8-2.0。二、rna逆转录反应：使用amv第一链合成试剂盒，步骤如下:①在冰浴的试管中加入模板rna3μg，引物oligo(dt)18(0.5μg/μl)1μl,用无酶水定容至12μl；②将其混匀后点动离心，于70℃水浴5min后，冰浴30sec；③点动离心后，试管冰浴，加入5×reactionbuffer4μl、rnaseinhibitor(20u/μl)lμl、dntpmix(10mmol/l)2μl；④混匀后点动离心，37℃水浴5min，加1μlamvreversetranscriptase(20u/μl)1ul，终体积为20ul；⑤反应物37℃水浴60min；⑥在70℃加热10min结束反应，-20℃保存；三、荧光定量pcr反应体系设置将待检测基因和内参基因的cdna样本分别取样在荧光定量pcr仪上进行反应，每个样本设置3个平行试验，pcr反应体系为20μl，反应体系如表10所示：表10待检测基因和对应的内参基因的序列如下表11、表12所示：表11引物名称引物序列gapdh-fcctcaagattgtcagcaatgapdh-rccatccacagtcttctgagther2-ftcctgtgtggacctggatgacher2-rccaaagaccacccccaaga表12引物名称引物序列u6-fctcgcttcggcagcacatatactu6-racgcttcacgaatttgcgtgtcmir124-fgcgtaaggcacgcggtgaatgccmir124-r通用序列荧光定量检测结果如图6和图7所示，由该结果可知，本实施例构建的mir124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒转染细胞后能够在细胞中高效表达mir124和her2-shrna，并且其表达量高于单一的mir124基因表达慢病毒，也高于单一的her2-shrna基因表达慢病毒，由此可见本发明构建的mir124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒能够在感染细胞后同时表达mir124和her2-shrna，并且相互之间产生协同增效作用，提高目的基因在细胞中的表达量。试验例动物试验实验步骤：1实验动物饲养所购买的裸鼠均为3-4周龄(20-25g/只)，雌性(雄性裸鼠易相互撕咬，导致裸鼠死亡率较高；雌雄混养易使雌性受孕，对实验造成较大影响，故选取雌性裸鼠)。在spf级动物实验室进行饲养。动物实验所需物品及饲料等均经高压灭菌后使用(动物中心统一提供)。4.2裸鼠体内荷瘤实验1)正常培养mcf-7细胞，实验前按照moi＝10使用相应慢病毒感染mcf-7细胞。实验分组如下：mcf-7对照组，单基因mir-124慢病毒感染mcf-7组，单基因her2-shrna慢病毒感染mcf-7组，mir-124过表达与her2-shrna双基因慢病毒感染mcf-7组。2)胰酶消化对数生长期的细胞，收集于2个无菌ep管内，加入灭菌的pbs，吹打，800rpm，5min离心；3)用无血清培养液重悬细胞，使得细胞浓度达到1.5×107/ml；4)于裸鼠右前肢腋窝皮下注射200μl细胞悬液，每6只裸鼠为一个试验组；5)待所有裸鼠传代瘤至粟粒大小(约移植两周后)，用游标卡尺每5天测量肿瘤的长度l和宽度w，v＝0.5×l×w2，如图8所示，将数据进行整理并绘制瘤体大小曲线，如图10所示；6)定期观察裸鼠的全身健康状况，并绘制生存曲线，7周后，处死裸鼠，小心地取出瘤体，精确称量瘤体重量，将数据进行整理，如图9所示。试验结果如图8、图9和图10所示，由该试验结果可知，本发明构建的mir124和her2-shrna双基因表达盒慢病毒相比单一的mir124基因表达慢病毒和单一的her2-shrna基因表达慢病毒，能够更显著的抑制肿瘤的生长，并促进肿瘤减小。最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。序列表<110>河南九睿生物技术有限公司<120>mir-124和her2-shrna双基因表达盒病毒载体、构建方法、病毒、应用<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>486<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctgtgtgattgggggagctgcggcggggaggatgctgtggtcccttcctccggcgttccc60cacccccatccctctccccgctgtcagtgcgcacgcacacgcgccgctttttatttcttt120ttcctggttttcttattccatcttctacccacccctcttcctttctttcacctttccttc180cttccttcctcctttccttcctcaggagaaaggcctctctctccgtgttcacagcggacc240ttgatttaaatgtccatacaattaaggcacgcggtgaatgccaagaatggggctggctga300gcaccgtgggtcggcgagggcccgccaaggaaggagcgaccgaccgagccaggcgccctc360cgcagacctccgcgcagcggccgcgggcgcgaggggaggggtctggagctccctccggct420gcctgtcccgcaccggagcccgtggggtggggaggtgtgcagcctgtgacagacaggggc480ttagag486<210>2<211>57<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ccggggaaggacatcttccacaagacgaatcttgtggaagatgtccttccttttttg57<210>3<211>57<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aattcaaaaaaggaaggacatcttccacaagattcgtcttgtggaagatgtccttcc57<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gaattcctgtgtgattgggggagctg26<210>5<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gcggccgcctctaagcccctgtctgtcac29<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gcggccgcggatccgaattctgcgg25<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gcggccgcctattaataactaatgc25<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cgcaaatgggcggtaggcgtg21<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cgccaccttctctaggcac19<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cctcaagattgtcagcaat19<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ccatccacagtcttctgagt20<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tcctgtgtggacctggatgac21<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ccaaagaccacccccaaga19<210>14<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gcgtaaggcacgcggtgaatgcc23<210>15<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ctcgcttcggcagcacatatact23<210>16<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16acgcttcacgaatttgcgtgtc22当前第1页12