本发明属于分子生物学、基因工程
技术领域：
，具体涉及一种草莓顶端分生组织点相关基因fvmyb17及其应用。
背景技术：
：草莓多年生草本植物，属于蔷薇科草莓属，浆果类果树(林凤起等，1986)。草莓果实为假果，由花托发育而成(雷家军等，2006)。草莓果实色泽红嫩诱人，口感柔软多汁，独具风味，具备很高的营养价值及药用价值，素有“水果皇后”之称，广受大众欢迎(万清林等，1994)。植物中myb转录因子的结构域是高度保守的，其myb结构域可与dna相结合，含有1-4个重复的氨基酸序列-r基序。根据所含r的数量，可将myb家族分为4类，其中r2r3-myb类型的成员最多。在其n末端含有高度保守的myb结合域，c末端有转录激活或抑制结构域(dubosetal.，2010)。myb家族是高等植物中一类大家族，在拟南芥中种的192个myb转录因子有126个r2r3myb转录因子(chenetal.，2006)。水稻中发现230个，其中含有95个r2r3myb(felleretal.，2011)。在种子萌发之后，茎端分生组织(shootapicalmeristem,sam)作为地上器官发育中心。根据其功能不同可以分为三个区域。中央区(centralzone，cz)又称为组织中心(organizingcenter，oc)(mayeretal.,1998)，分布着一群大体积细胞，且分裂较慢。wus(wuschel)作为茎尖分生组织中心标记基因，保持干细胞处于未分化状态。wus基因和干细胞标记基因clv3反馈调节维持中心干细胞的数量从而维持sam稳定的生长。fvmyb17与拟南芥中的atmyb4同源性很高，研究表明拟南芥atmyb4突变体中，atmyb4的靶基因-桂肉酸羟化酶基因c4h(cinnamate-4-hydroxylase)的表达量升高，从而导致叶片中的芥子酯含量明显上升(jinetal.，2000)。玉米中木质素负调控转录因子zmmyb31与fvmyb17是同源基因，zmmyb31与f5h、comt启动子区域顺式作用元件ac-ⅱ(cct/cac/ac)结合，能够降低转基因拟南芥f5h和comt基因表达量(fornalésetal.，2006)。目前在草莓中尚未发现r2r3-myb转录因子调控植株顶端发育。因此，对该基因进行功能研究，阐明其在顶端发育中的机理，对草莓顶端发育研究奠定了理论基础。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种顶端分生组织相关基因-草莓基因fvmyb17及其应用。本发明的技术方案是从二倍体森林草莓‘ruegen’中分离得到fvmyb17基因,构建该基因的植物过表达载体，通过农杆菌介导法，将该基因转化到拟南芥中，以实现fvmyb17基因的功能分析。本发明提供了一种草莓顶端分生组织相关基因fvmyb17，该基因的cdna序列如seqno.1所示；草莓顶端分生组织相关基因fvmyb17编码的蛋白质，所述基因编码的氨基酸序列如seqidno：2所示。本发明提供一种用于扩增草莓顶端分生组织相关基因fvmyb17的引物，包含：fvmyb17-f:5＇－aaaggtaccatgaggaaaccctgctgcga－3＇fvmyb17-r:5＇－aaagaattctctgaagagaggaagcgtgg－3＇其中，引物5＇端的前3个碱基为保护碱基，紧接着的6个碱基是酶切位点，5＇端前9个碱基是构建过表达载体所需，不属于fvmyb17的基因序列；fvmyb17-r引物由于构建gfp融合表达载体需要，去掉了终止密码子。本发明提供一种草莓顶端分生组织相关基因fvmyb17的植物过表达载体，所述载体为pri101-camv35s-fvmyb17-gfp。本发明提供一种草莓顶端分生组织相关基因fvmyb17在增加植物顶端分生组织数量的应用。本发明提供一种表达载体pri101-camv35s-fvmyb17-gfp在增加植物顶端分生组织数量的应用。本发明还提供了一种含有草莓顶端分生组织相关基因fvmyb17的植物表达载体pri101-camv35s-fvmyb17-gfp，将其通过花粉管通道法转入拟南芥。实际上，任何一种将外源基因导入植物体内的表达载体都可以用，本发明优先选用的是的pri101-gfp-camv35s。本发明的有益效果是：利用现有植物基因工程技术，本发明克隆了草莓顶端分生组织相关基因fvmyb17,并通过花粉管通道法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的顶端分生组织点数量明显提高。附图说明图1：fvmyb17基因cdna序列的扩增结果。其中m为dl2000图2：为kpn1和ecor1对pri101-camv35s-fvmyb17-gfp重组载体双酶切验证结果。其中m为dl2000。图3：为正常生长条件下转基因植株和野生型的生长状况。其中wt为未转化的拟南芥，oe-10/oe-11为两个独立的转基因株系。具体实施方式：实施例1、草莓顶端分生组织相关基因fvmyb17的克隆(1)以二倍体森林草莓‘ruegen’为试材。(2)rna提取：采用改良ctab法，提取材料中的总rna之后用反转录试剂盒以rna为模板反转录得到cdna第一链。(3)基因的克隆：以反转录的果实cdna第一链为模板，利用引物fvmyb17-f和fvmyb17-r进行pcr扩增，回收pcr产物，获得765bp的目的片段。fvmyb17-f:5＇－aaaggtaccatgaggaaaccctgctgcga－3＇fvmyb17-r:5＇－aaagaattctctgaagagaggaagcgtgg－3＇其中，引物5＇端的前3个碱基为保护碱基，紧接着的6个碱基是酶切位点，5＇端前9个碱基是构建过表达载体所需，不属于fvmyb17的基因序列。实例2、植物表达载体的构建(1)利用植物表达载体pri101-gfp-camv35s，选用kpn1和ecor1(购自takara公司)分别对pri101-gfp-camv35s和含有目的基因的pmd18-t(购自takara公司)进行双酶切；回收载体大片段和目的基因小片段，用t4dna连接酶连接过夜后转化大肠杆菌感受态dh5a(购自北京全式金生物技术有限公司)，鉴定重组子后即可进行双酶切验证。(2)选取双酶切验证正确的重组质粒，送金唯智生物科技有限公司测序。之后转化农杆菌gv3101感受态细胞，得到的含有重组质粒的农杆菌用于转化拟南芥。实例3、转基因功能验证—拟南芥转化筛选及表型分析3.1拟南芥转化当拟南芥(哥伦比亚野生型)花序形成时，将花序顶端减掉以诱导侧花序的生成，转化前将材料浇透水。挑选含有目的基因fvmyb17的农杆菌gv3101阳性克隆。接种于含有kan(卡那霉素)50mg/l和rif(利福平)25mg/l的yep液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h，取1ml培养好的菌液，加入50ml液体yep液体培养基，放置于28℃，200rpm振荡培养，使od600＝0.8左右。将菌液转入无菌的50ml离心管中，5000rpm，5min离心收集菌种，再用同等体积的ms重悬液(1/2ms+5％sucrose，ph＝5.7)重悬农杆菌，并加入表面活性剂silwet，使其终浓度达到0.03％(300μl/l)。一个月后收获了t0代种子在含有30mg/l的卡纳霉素的培养基上筛选出阳性植株，以便收获t1代种子，用于后期观察表型。3.2拟南芥阳性株系表型鉴定将转基因拟南芥t2代植株(带有pri101-camv35s-fvmyb17-gfp表达载体的转基因拟南芥)和野生型拟南芥在同等条件下(16h光照/8h黑暗)条件下进行培养。7周之后统计wt和转基因植顶端分生组织和莲座叶数量，统计结果如表1所示。表1表型顶端数量(个)叶片数量(片)野生型拟南芥1.00±0.0019.50±2.88转基因株系oe-103.00±0.8952.00±4.56转基因株系oe-112.66±0.8147.16±10.18在相同的条件下培养，培养7周之后统计顶端分生组织和莲座叶数量，每个株系选取6个单株进行统计，数据用spss软件进行单因素方差分析，数据以平均值±标准差显示。由上表可知，转基因拟南芥的顶端分生组织数量分别为3.00±0.89和2.66±0.81个。而野生型拟南芥的顶端分生组织数量仅为1个。同时转基因拟南芥的莲座叶数量也明显增加分别为52.00±4.56和47.16±10.18，野生型拟南芥为19.50±2.88。因此，结果表明，草莓fvmyb17可以促进转基因拟南芥顶端分生组织和叶片数量增加。序列表<110>沈阳农业大学<120>一种草莓顶端分生组织相关基因fvmyb17及其应用<130>2018<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>768<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgaggaaaccctgctgcgacaagcaagacacgaacaaaggagcttggtcgaagcaagaa60gatcagaagctcatcgattacattcgcaaacatggcgagggttgttggcgtacccttcct120caagccgcaggccttcttcgatgcggtaaaagttgcagacttcggtggataaactatcta180cggccggaccttaaaaggggcaagtttgctgaagatgaagaagatctcatcattaagctt240catgcactcctaggcaatcggtggtcgctgattgccggaagattgccgggacgtacagac300aatgaagtgaagaactattggaactctcatttgagacgaaagcttataaccatgggtata360gatccaaacaatcatcgacccaccagcactctcttccctcggcctcataatcatcatcat420caaaacccaccacagacactaaaatctccagctggttctgctatcaataattttaaccat480gagccagtagtgttcgagtccaaaactccgcgtggtgatgatcaaaattgcgagcaggtc540tcggatggcagaagttgcttagaggatgattcttcttgtggtggtcatcacctgcctgat600ttaaaccttgatctcactgtccatctcagggtttctaatgatgatcaccaatatctcagt660aaggagctcaatcatcttcatctcagaattagtgaccctcatgaaatgtcggttgggaca720aagactgatatatttgcctcatctaccacgcttcctctcttcagataa768<210>2<211>256<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2metarglysprocyscysasplysglnaspthrasnlysglyalatrp151015serlysglngluaspglnlysleuileasptyrilearglyshisgly202530gluglycystrpargthrleuproglnalaalaglyleuleuargcys354045glylyssercysargleuargtrpileasntyrleuargproaspleu505560lysargglylysphealagluaspglugluaspleuileilelysleu65707580hisalaleuleuglyasnargtrpserleuilealaglyargleupro859095glyargthraspasngluvallysasntyrtrpasnserhisleuarg100105110arglysleuilethrmetglyileaspproasnasnhisargprothr115120125serthrleupheproargprohisasnhishishisglnasnpropro130135140glnthrleulysserproalaglyseralaileasnasnpheasnhis145150155160gluprovalvalphegluserlysthrproargglyaspaspglnasn165170175cysgluglnvalseraspglyargsercysleugluaspaspserser180185190cysglyglyhishisleuproaspleuasnleuaspleuthrvalhis195200205leuargvalserasnaspasphisglntyrleuserlysgluleuasn210215220hisleuhisleuargileseraspprohisglumetservalglythr225230235240lysthraspilephealaserserthrthrleuproleupheargglx245250255当前第1页12