本发明属于园艺花卉基因工程技术领域，具体涉及一种基于烟草脆裂病毒沉默体系提高石竹转化率的方法，本发明可用于提高石竹转化率并快速鉴定石竹内源基因的功能。
背景技术：
石竹为石竹科石竹属多年生草本植物，原产我国及东亚地区。石竹栽培历史悠久，具有较高的观赏性、园林用途和经济价值，可用于花坛、花境、花台、盆栽，也可作为切花等使用。石竹还能吸收二氧化硫和氯化物，是优良的空气净化材料；石竹也是研究5基数花发育的重要科研模式植物。提高石竹观赏性、抗性、延长花期及药用价值等是科研和生产中亟待解决的问题。因此，研究石竹相关基因功能，可改良石竹自身的优良性状，增加园林植物应用种类，达到节约型美化、绿化的目的。但目前缺乏对控制这些性状基因功能进行快速、高效验证的体系。病毒诱导的基因沉默技术(virus-inducedgenesilence,vigs)已成功应用于多种植物进行基因功能的快速验证，虽然前人对石竹vigs体系已有相关报道，但应用该体系后石竹转化的诱导效率差，仅有20％，且转化效果慢，侵染之后20天左右才出现白化表型。而本发明构建的体系采用新品种和新方法，其诱导效率高达64.7％，同时转化效果快，侵染之后大约7天左右便会出现白化表型，大大提高了转化的效率，节约了时间。这将大大促进园艺花卉植物基因功能验证和分析效率。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供了一种基于烟草脆裂病毒沉默体系提高石竹转化率的方法，本发明可以获得烟草脆裂病毒诱导的基因沉默性状，进而有效应用于石竹基因功能快速和高效鉴定。
为实现上述目的，本发明所采用如下技术方案：
申请人克隆得到一种石竹内源dcpds基因片段，该片段的核苷酸序列如seqidno：1所示。
含有上述dcpds基因片段的核苷酸序列可以作为重组表达载体、转基因细胞系或转基因工程菌的外源基因。
植物表达载体的构建，上述的重组表达载体是基于一种烟草脆裂病毒的病毒诱导基因沉默载体，将含有如序列表seqidno：1所示的dcpds基因片段插入到trv2载体的bamhi和xhoi位点之间，得到植物重组表达载体trv2-dcpds。
可以通过基因工程菌将上述的植物重组表达载体trv2-dcpds转化感受态农杆菌获得转基因植物。
上述dcpds基因片段可在构建烟草脆裂病毒的病毒诱导基因沉默载体中应用。
携带上述dcpds基因片段，重组表达载体和基因工程菌的转化载体可在快速鉴定石竹基因功能中应用。
申请人提供了一种快速鉴定石竹基因功能的方法，主要技术路线包括：将含有内源目的基因片段的trv2病毒沉默表达载体质粒通过机械损伤法瞬时转化石竹，诱导石竹内源目的基因发生沉默，从而可以快速准确鉴定该内源目的基因的功能。
具体地，申请人提供了一种快速鉴定石竹基因功能的方法，所述的方法还包括如下步骤：
(1)构建植物表达载体trv2-dcpds：以石竹的cdna为模板，以正向引物dcpds-f(序列如seqidno：2所示)和反向引物dcpds-r(序列如seqidno：3所示)为引物组合进行pcr扩增反应，扩增出305bp大小的pds基因片段，并将所得片段连接到pmd18-t载体(图6，购自宝生物工程大连有限公司)上，得到重组载体质粒pmd18-t-dcpds(图8)。将连接成功的载体质粒pmd18-t-dcpds热激转化大肠杆菌dh5α感受态，在含有100μg/ml氨苄青霉素(apm)的lb培养皿中培养，通过阳性单菌落检测，测序验证，得到pmd18-t-dcpds的载体质粒(图8)。将pmd18-t-dcpds载体质粒用bamhi和sali双酶切得到pds酶切片段，用t4连接酶与bamhi和xhoi双酶切线性化的表达载体trv2(图7)连接，热激转化大肠杆菌dh5α感受态，在含有100μg/ml卡那霉素(kan)的lb培养皿中培养，阳性单菌落检测，测序验证。将上述构建的植物表达载体trv2-dcpds(图9)电转化农杆菌感受态gv3101，挑取单菌落检测阳性，选取阳性克隆摇菌并保存，用于转化石竹叶片。同时利用trv2空载电转化农杆菌感受态gv3101，作为转化石竹叶片的阴性对照。
(2)制备侵染缓冲液：从添加了卡那霉素(kan)100μg/ml的lb平板上挑取含有植物表达载体trv2-dcpds、trv2空载对照载体、trv1载体的阳性农杆菌gv3101进行单克隆，分别在添加了100μg/ml庆大霉素(gen)和100μg/ml卡那霉素(kan)的液体培养基中过夜培养，然后分别将菌液转入添加了100μg/ml庆大霉素(gen)、100μg/ml卡那霉素(kan)、0.5m/l2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物(mes)和100mm乙酰丁香酮(as)液体培养基中再次过夜培养，然后离心去上清收集各菌体，用侵染缓冲液重悬各菌体并调节od600至2.0，将tvr1分别与trv2-dcpds和trv2空载对照载体悬浮菌液等体积混合，黑暗下静置3h，用于石竹叶片侵染缓冲液。
1m/lmes母液配制：称取mes9.76g，溶于少量超纯水中，并用超纯水定容至50ml，超净工作台中采用0.2μm孔径的无菌滤膜抽滤至无菌离心管密封，4℃保存备用。
100mmas母液配制：称取as196.2mg，通风橱中将as溶于少量dmso(二甲基亚枫)中，超纯水定容至10ml，混匀，超净工作台中采用0.2μm孔径的无菌滤膜抽滤至无菌离心管密封，-20℃保存备用。
2m/lmgcl2母液配制：称取mgcl220.33g或mgcl2·6h2o30.942g，加少量超纯水溶解，并用超纯水定容至50ml；120℃高压蒸汽灭菌20min，超净工作台中分装于无菌离心管中，4℃保存备用。
侵染缓冲液配制(500ml，现配现用)：5ml1m/lmes，10ml100mmas，2.5ml2m/lmgcl2，无菌水定容至500ml。
(3)将步骤(2)制备的侵染缓冲液采用机械损伤法(即，用干净的磨砂纸打磨叶片正面，在伤口处用沾有菌液的棉花敷上1min后取下)转化石竹幼苗叶片。
(4)石竹幼苗转化后培养：将转化后石竹幼苗转入光照培养箱(培养条件：16h光照/8h黑暗；培养温度为26℃/24℃；相对湿度(rh)为65％；光照强度为4500lux)，并用黑色塑料袋覆盖石竹幼苗，24h后掀开，继续置于光照培养箱中培养。
(5)转化石竹植株表型的观察：侵染7～8天后，当观察石竹植株叶片呈白化表型，拍照记录图像。
(6)石竹内源目的基因dcpds的rt-pcr检测：选取trv1/trv2-dcpds侵染的白化叶片，trv1/trv2空载侵染的石竹叶片，以及未侵染的正常植株的石竹叶片，按常规方法提取石竹叶片rna，反转录为cdna，设计扩增dcpds基因片段的rt-pcr引物(正向引物dcpds-rt-f(引物序列见seqidno：4)和反向引物dcpds-rt-r(引物序列见seqidno：5)，以trv1/trv2空载体侵染的石竹叶片及未侵染的正常石竹植株叶片为对照，检测石竹内源目的dcpds基因的表达水平。
本发明的有益效果：
本发明含有内源目的基因的trv2病毒沉默表达载体质粒，借助叶片机械损伤法瞬时转化叶片，使石竹内源目的基因发生沉默。本发明构建得到石竹trv-vigs沉默内源基因的系统，成本低，效率高，效果快，可以获得烟草脆裂病毒诱导的基因沉默性状，进而解决有效验证石竹基因功能的问题。此外，与前人报道相比本发明具有以下突出优点：
(1)侵染植株成活率高，成活率可达到94.12％。
(2)侵染植株检测效率高，侵染效率可达64.7％。
(3)极大缩短转化时间，侵染后7～8天左右便可出现白化表型。
(4)本发明操作方法简便。
附图说明
序列表seqidno:1是石竹pds基因序列。
序列表seqidno:2是正向引物dcpds-f序列。
序列表seqidno:3是反向引物dcpds-r序列。
序列表seqidno:4是正向引物dcpds-rt-f序列。
序列表seqidno:5是反向引物dcpds-rt-r序列。
图1：本发明总体技术流程图。
图2：石竹品种“卫星”猩红系列侵染植株的tvr病毒检测的电泳图谱。附图标记说明：泳道4、5、6、10及11号样品为侵染成功的石竹植株。
图3：侵染植株“卫星”石竹猩红系列vigs干涉整体形态图。附图标记说明：标记trv:pds为pds侵染的植株，trv为空载对照植株，control为阳性对照。
图4：石竹品种“卫星”猩红系列基因沉默体系(vigs)干涉表型。附图标记说明：图片依次为：rv:pds-1、trv:pds-2、trv:pds-3，表示不同的株系，它们的表型为依次增强。其中：trv为空载对照；control为阳性对照。
图5：石竹品种“卫星”猩红系列pds基因干涉后的表达量分析。附图标记说明：trv:pds-1、trv:pds-2、trv:pds-3为干涉后不同的株系，表型为依次增强，trv为空载对照，control为阳性对照。
图6：pmd18-t载体质粒图谱。
图7：ptrv2载体质粒图谱。
图8：pmd18-t-dcpds载体质粒图谱。
图9：ptrv2-dcpds载体质粒图谱。
具体实施方式
在以下实施例中，除非特殊说明，所涉及的载体和实验材料均为本领域技术人员所公知的。
实施例1
(1)dcpds基因片段的克隆
取新鲜石竹叶片0.5g，参照宝生物工程大连有限公司的trizolrna提取试剂盒说明书的操作方法提取叶片总rna，用宝生物工程大连有限公司m-mlv反转录试剂盒进行反转录，获得石竹叶片的cdna，根据石竹文库中该基因的序列信息，运用primer5软件设计了如下所述的特异引物组合扩增dcpds基因片段，引物组合具体序列如下所述；
正向引物dcpds-f：5’-ccattgaaggtggtgtgtgtaga-3’(序列同seqidno：2)
反向引物dcpds-r：5’-ttggggtaagccccaaaga-3’(序列同seqidno：3)
以石竹叶片的cdna为模板，进行pcr反应。20μl反应体系中：0.2ultaq酶，2.0ulbuffer，1.0ulcdna模板，1.0uldcpds-f引物，1.0uldcpds-r引物和14.4ulddh2o。将各试剂混匀后，离心空甩3～5s；反应程序：95℃预变性3min；扩增35个循环，95℃变性40s，59℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保温至10min。
(2)植物表达载体trv2-dcpds的构建
利用dcpds-f、dcpds-r引物扩增的pcr产物用凝胶回收试剂盒(型号axygeen，usa)回收，以pmd18-t载体连接目的基因片段dcpds，建立20ul连接体系：10ulsolution1，1ulvectorpmd-18t，9uldcpds基因片段。混匀，震荡，空甩离心富集3～5s。16℃恒温静置8h，即可获得重组载体pmd18-t-dcpds连接液。将连接成功的载体pmd18-t-dcpds热激转化大肠杆菌dh5α感受态，在含有100μg/ml氨苄青霉素(apm)的lb培养皿中培养，阳性单菌落检测，测序验证，得到pmd18-t-dcpds的载体质粒。将pmd18-t-dcpds载体质粒采用bamhi和sali进行双酶切得到pds酶切片段，用t4连接酶(购自宝生物工程大连有限公司)与bamhi和xhoi双酶切线性化的表达载体trv2连接，热激转化大肠杆菌dh5α感受态，在含有100μg/ml卡那霉素(kan)的lb培养皿中培养，最后是阳性单菌落检测和测序验证。
将上述构建的植物表达载体trv2-dcpds电转化农杆菌感受态gv3101，挑取单菌落检测阳性，选取阳性克隆摇菌并保存，用于转化石竹叶片。同将trv2空载体电转化农杆菌感受态gv3101，作为转化石竹叶片的阴性对照。
(3)农杆菌gv3101介导的trv2-dcpds瞬时转化石竹叶片
从添加了卡那霉素(kan)100μg/ml的lb平板上挑取含有植物表达载体trv2-dcpds、trv2空载对照载体、trv1载体的阳性农杆菌gv3101单克隆，分别在添加了100μg/ml庆大霉素(gen)和100μg/ml卡那霉素(kan)的10ml液体培养基中进行过夜培养12h(28℃，200rpm)，然后分别将菌液转入添加了100μg/ml庆大霉素(gen)、100μg/ml卡那霉素(kan)、0.5m/l2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物(mes)和100mm乙酰丁香酮(as)的50ml液体培养基中再次过夜培养12h(28℃，200rpm)，然后5000rpm，25℃，离心15min，去上清液收集各菌体，采用侵染缓冲液重悬各菌体并调节od600至2.0，将tvr1分别与trv2-dcpds和trv2空载对照载体悬浮菌液等体积混合，黑暗下静置3h，用于石竹叶片侵染液。
(4)侵染缓冲液配制(500ml，现配现用)：5ml1m/lmes，10ml100mmas，2.5ml2m/lmgcl2，无菌水定容至500ml。。
(5)播种后4周的的石竹幼苗，当有6对完全张开的叶片，以最低端1对叶片及中间1对叶片为机械损伤法作为侵染对象。侵染液采用机械损伤法(即用干净的磨砂纸打磨石竹叶片正面，在伤口处用沾有菌液的棉花敷上1min后取下)，通过转化石竹幼苗叶片，得到转化后的石竹幼苗。
(6)植物表达载体trv2-dcpds瞬时转化石竹叶片后的培养及表型观察
将转化后的石竹幼苗转入光照培养箱(培养条件：光照16h/8h；温度26℃/24℃；rh65％；光照强度4500lux)，并用黑色塑料袋覆盖培养物，24h后掀开黑色塑料袋，将继续置于光照培养箱中培养。侵染7～8天后，trv2-dcpds侵染的植株，显示新生叶片出现明显白化表型，而trv2侵染植株无白化表型与正常植株表型相同(见图3、图4)。
5、利用rt-pcr检测dcpds基因的表达量
取trv1/trv2-dcpds侵染的白化叶片、trv1/trv2空载侵染的叶片及未侵染的正常植株叶片，提取叶片总rna，并反转录为cdna，设计dcdcpds基因rt-pcr引物(正向引物dcpds-rt-f，序列见seqidno：4)，反向引物dcpds-rt-r，序列见seqidno：5)，以trv1/trv2空载侵染的叶片及未侵染的正常石竹植株叶片为对照，检测石竹内源目的基因dcpds的表达水平(结果见图5)。如内源基因表达水平低(被沉默后)，叶片出现白化表型。根据表达水平降低与白化叶片表型的关联性来判定dcpds基因的功能(防止叶片光氧化功能)。
本发明详细过程如下：
(1)侵染植株的获得：采用播种后4周的的石竹幼苗，有6对完全张开的叶片，以最低端1对叶片及中间1对叶片用机械损伤法处理叶片，作为农杆菌侵染对象。
(2)构建植物表达载体：以石竹cdna为模板，通过pcr扩增出305bppds基因片段，并将该片段连接到pmd18-t载体上，即可获得重组载体质粒pmd18-t-dcpds。
(3)将pmd18-t-dcpds载体质粒用bamhi和sali进行双酶切得到pds酶切片段后用t4连接酶与bamhi和xhoi双酶切线性化的表达载体trv2连接。
(4)将上述(3)步骤所得的trv2-dcpds重组载体质粒电转化农杆菌感受态gv3101并进行阳性克隆的pcr检测。同时以trv2空载体电转化农杆菌感受态gv3101，作为转化石竹叶片的阴性对照。
(5)室温下将含有trv2-dcpds重组质粒的农杆菌在侵染缓冲液(mes+as+mgcl2)在黑暗下静置3h，用于侵染石竹叶片。
(6)将上述制备的侵染缓冲液用常规机械损伤法(例如用干净的磨砂纸打磨石竹叶片正面，在伤口处用沾有菌液的棉花敷上1min后取下)，得到转化后的石竹幼苗。
(7)石竹幼苗转化后培养：将转化后石竹幼苗转入光照培养箱(培养条件：光照16h/8h；温度26℃/24℃；rh65％；光照强度4500lux)，并用黑色塑料袋覆盖培养物，24h后掀开，继续置于光照培养箱中培养。
(8)转化株表型观察：侵染7～8天观察转化的石竹植株叶片为白化表型，拍照记录图像。
(9)内源目的基因dcpds的rt-pcr检测：选取trv1/trv2-dcpds侵染的白化石竹叶片、trv1/trv2空载侵染的叶片及未侵染的正常石竹植株的叶片，按常规方法提取叶片rna，并反转录为cdna，设计扩增dcpds基因片段的rt-pcr引物(正向引物dcpds-rt-f(seqidno.：4)，反向引物dcpds-rt-r(seqidno：5))，以trv1/trv2空载侵染的叶片及未侵染的正常植株叶片为对照，检测石竹内源目的基因dcpds的表达水平。
综上所述，本发明构建了沉默重组表达载体trv2-dcpds，并通过农杆菌介导的叶片机械损伤法对石竹进行瞬时转化，从而实现石竹内源基因的沉默。
序列表
<110>华中农业大学
<120>基于烟草脆裂病毒沉默体系提高石竹转化率的方法
<141>2018-04-03
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>305
<212>dna
<213>八氢番茄红素脱氢酶(crocussativus)
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<222>(1)..(305)
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