本发明涉及一种crispr/cpf1系统介导的以rna转录本为修复模板的同源重组方法。
背景技术：
：crispr/cpf1极大拓展了基因编辑范围，已开始应用于农作物遗传改良研究中。利用crispr/cas9介导的基因组编辑技术进行基因敲除，已经在水稻等农作物中得到应用。但是，由于植物中同源重组频率低，利用crispr/cas9介导的同源重组，在农作物中实现基因定点替换或定点整合却少有报道。目前，利用crispr/cpf1系统介导的目的基因片段替换尚未有报道。有假设提出rna转录本可作为修复模板参与到dna双链断裂(dsbs)导致的dna同源重组修复(hdr)中去，而在酵母和人类细胞中，此假设已被证实。2014年，在一项酵母的研究中，rna为修复模板介导基因组dna的同源重组修复的有效性进一步被证实。然而，在酵母和人类细胞中，这一技术并未被广泛应用，主要由于在酵母和人类细胞中dna修复模板可通过电转化、显微注射或转染等转化方法高效进入细胞，从而介导dna的重组修复。但是在植物细胞中，由于细胞壁的存在，这些转化方法均不适用，尤其对于一些作物品种如：玉米、小麦、水稻等单子叶植物而言。因此在农作物中通过crispr/cas系统实现目的基因的同源重组修复有很大难度，主要因为：1)在植物细胞中，dsbs主要通过非同源末端连接(non-homologousendjoining，nhej)的方式进行修复，同源重组介导的修复(homology-directedrepair，hdr)发生几率极其小；2)将修复模板转入植物细胞中的量十分有限，目前有两种方法可以提高修复模板的量，但效果仍不理想，一种方式为通过基因枪转化法将修复模板片段导入细胞内；另外一种方法是将修复模板连入病毒来源的replicon载体中，将载体转化细胞，从而增加修复模板的量。技术实现要素：本发明的目的是提供一种crispr/cpf1系统介导的以rna转录本为修复模板的同源重组方法。本发明提供了一种用于取代植物基因组中的目标片段的表达盒甲，包括启动子甲和终止子，其特征在于：在启动子甲和终止子之间包括如下三个区段：区段ⅰ、区段ⅱ和区段ⅲ；区段ⅲ为区段ⅲ-1或区段ⅲ-2；区段ⅰ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crrna1的编码序列；区段ⅱ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crrna2的编码序列；区段ⅲ-1中具有两个核酸酶的编码序列和位于它们之间的模板区段；区段ⅲ-2中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段；所述模板区段包括上游同源臂、供体片段序列和下游同源臂；所述目标片段的一个末端为区段ⅰ中crrna1的靶标序列，另一个末端为区段ⅱ中crrna2的靶标序列；供体片段与目标片段具有如下差异：①预期在目标片段中引入的差异核苷酸；②将crrna1的靶标中的tttn突变为非tttn；③将crrna2的靶标中的tttn突变为非tttn。区段ⅰ自5’至3’端依次具有hammerhead型核酸酶的编码序列、crrna1的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列。区段ⅱ自5’至3’端依次具有hammerhead型核酸酶的编码序列、crrna2的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列。区段ⅲ-1中自5’至3’端依次具有hammerhead型核酸酶的编码序列、上游同源臂、供体片段序列、下游同源臂和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列。区段ⅲ-2中自5’至3’端依次具有crrna1的靶标序列、上游同源臂、供体片段序列、下游同源臂和crrna2的靶标序列。所述目标片段中，crrna1的靶标和crrna2的靶标之间具有限制性内切酶的识别序列；所述供体片段与目标片段的区别还包括如下④：将所述限制性内切酶的识别序列突变为非识别序列。所述hammerhead型核酸酶的编码序列如序列表中序列1自5’端第394至436位所示或序列表的序列1自5’端第724至766位所示。所述丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列如序列表中序列1自5’端第481至548位所示。所述crrna1的编码序列如序列表的序列1自5’端第437至480位所示。所述crrna2的编码序列如序列表的序列1自5’端第602至645位所示。所述上游同源臂如序列表的序列1自5’端第767至863位所示。所述下游同源臂如序列表的序列1自5’端第1245至1365位所示。所述供体片段序列如序列表的序列1自5’端第864至1244位所示。所述区段ⅰ如序列表的序列1自5’端第394至548位所示。所述区段ⅱ如序列表的序列1自5’端第559至713位所示。crrna1的靶标序列如序列表的序列2自5’端第709至735位所示。crrna2的靶标序列如序列表的序列2自5’端第1335至1361位所示。所述区段ⅲ-1如序列表的序列1自5’端第724-1433位所示。所述区段ⅲ-2如序列表的序列2自5’端第709-1361位所示。所述启动子甲为osu3启动子。所述osu3启动子如序列表的序列1自5’端第13至393位所示。所述终止子为nos终止子。所述nos终止子的序列如序列表的序列1自5’端第1434至1686位所示。所述表达盒甲如序列表的序列1自5’端第13-1686位所示。所述表达盒甲如序列表的序列2所示。所述目标片段具体可为植物基因组中als基因中序列表的序列6所示的片段。本发明还保护含有以上任一所述表达盒甲的重组载体。所述重组载体还包括表达盒乙；所述表达盒乙中由启动子乙启动lbcpf1核酸酶的编码基因表达。所述启动子乙为ubi启动子。所述ubi启动子的反向互补序列如序列表的序列1自5’端第5912至7897位所示。所述lbcpf1核酸酶的编码基因的反向互补序列如序列表的序列1自5’端第2061至5909位所示。所述表达盒乙还包括终止子。所述所述终止子为nos终止子。所述nos终止子的反向互补序列如序列表的序列1自5’端第1789至2041位所示。所述表达盒乙的反向互补序列如序列表的1自5’端1789至7897位所示。所述重组载体为序列表的序列1所示的环形质粒。所述重组载体为采用序列2所示的双链dna分子替代序列1自5’端第13-1686位得到的环形质粒。本发明还保护以上任一所述表达盒甲，或，以上任一所述的重组载体在实现植物中以rna转录本为模板进行靶基因同源重组中的应用。本发明一种植物中以rna转录本为模板进行靶基因同源重组的方法，包括如下步骤：将以上任一所述的重组载体导入出发植物，实现植物中靶基因同源重组。以上任一所述靶基因为als基因。以上任一所述植物可为1)或2)或3)或4)或5)：1)单子叶植物；2)双子叶植物；3)禾本科植物；4)水稻；5)水稻品种中花11(japonicacv.)。本发明以水稻als基因为研究对象，构建了同源重组载体：pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos和pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos。将rcr1-rcr2-rdr片段进行体外转录，通过rnp方法，以rna转录本作为修复模板，在水稻愈伤中实现了目的基因的同源重组修复。同时，利用基因枪方法将载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos、pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos和pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos-armeddonor(withtargets)分别导入水稻愈伤中，获得了als基因定点修饰的水稻植株，其中pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos-armeddonor(withtargets)为dna修复模板的对照载体。研究结果表明，以rna作为修复模板可成功介导目的基因的同源重组，为农作物育种提供了新思路，因此在农业育种方面具有强大的应用潜力。附图说明图1为三个载体框架图。图2为水稻愈伤组织中目的基因的测序鉴定结果。图3为转基因植株中目的基因的测序鉴定结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的用于水稻转化的水稻材料为中花11(japonicacv.)，由中国农业科学院作物科学研究所提供。质粒pcxun-cas9记载于如下文献中：heetal.，2017和sunetal.，2016；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。质粒prs316-rcr-gfp记载于如下文献中：zhangetal.，2017；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。lbcpf1-osu6载体记载于如下文献中：wangetal.，2017；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。pcxun-cas9-osu3记载于如下文献中：sunetal.，2016；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。下述实施例中所用的内切酶、试剂盒和pcr酶均购自试剂公司。其它试剂均为国产分析纯。下述实施例中的引物、dna合成及测序均由华大公司完成。下述实施例中所用的引物如表1。表1引物序列实施例1、利用crispr/cpf1系统实现以rna转录本作为修复模板介导的als基因的精确修饰一、表达载体的构建1、质粒pcxun-lbcpf1-nos的构建(1)用限制性内切酶bamhi和hindiii双酶切质粒pcxun-cas9，得到约9282bp的载体骨架1。(2)用限制性内切酶bamhi和hindiii双酶切lbcpf1-osu6载体，得到约5846bp的ubi-lbcpf1表达盒。(3)将载体骨架1和ubi-lbcpf1表达盒用t4连接酶连接，得到质粒pcxun-lbcpf1-nos。2、osu3-rcr1-rcr2表达盒的构建(1)以质粒prs316-rcr-gfp为模板，采用引物rcr1f2和引物rcr-common-r组成的引物对进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物。(2)以步骤(1)得到的第一轮pcr扩增产物为模板，采用引物rcrf1和引物rcr-common-r组成的引物对进行第二轮pcr扩增，得到第二轮pcr扩增产物(rcr1)。(3)以质粒prs316-rcr-gfp为模板，采用引物rcr2-f2和引物rcr-common-r组成的引物对进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物。(4)以步骤(3)得到的第一轮pcr扩增产物为模板，采用引物rcr-f1和引物rcr-common-r组成的引物对进行第二轮pcr扩增，得到第二轮pcr扩增产物(rcr2)。(5)以pcxun-cas9-osu3为模板，采用引物osu3f和引物osu3-rcr1r组成的引物对进行pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物(osu3启动子序列)。(6)以步骤(2)得到的第二轮pcr扩增产物(rcr1)为模板，采用引物rcr-common-f和引物rcr1-10random-r组成的引物对进行第二轮pcr扩增，得到第二轮pcr扩增产物。(7)将步骤(5)得到的第一轮pcr扩增产物(osu3启动子序列)和步骤(6)得到的第二轮pcr扩增产物按照摩尔比1:1混合后作为模板，采用引物osu3f和引物rcr1-10random-r组成的引物对进行第三轮pcr扩增，得到第三轮pcr产物(osu3-rcr1表达盒)。(8)以步骤(4)得到的第二轮pcr扩增产物(rcr2)为模板，采用引物rcr2-10random-f和引物saci-rcr2-r组成的引物对进行第四轮pcr扩增，得到第四轮pcr扩增产物。(9)将步骤(7)得到的第三轮pcr产物(osu3-rcr1表达盒)和步骤(8)得到的第四轮pcr扩增产物按照摩尔比1:1混合后作为模板，采用引物saci-osu3-f和引物saci-rcr2-r进行第五轮pcr扩增，得到第五轮pcr扩增产物(osu3-rcr1-rcr2表达盒)。3、rdr片段的合成(1)将引物hhf和引物hhr退火形成hh片段(第一轮产物)。(2)以化学合成定点修饰的als基因片段(序列表的序列4)为模板，采用引物donor-hh-f和引物donor-hh-f组成的引物对进行pcr扩增，得到第二轮产物。(3)以质粒prs316-rgr-gfp为模板，采用引物hdvf和引物hdvr组成的引物对进行pcr扩增，得到第三轮产物。(4)以质粒pcxun-cas9为模板，采用引物nos-hdvf和引物kpn-nosr组成的引物对进行pcr扩增，得到第四轮产物(5)将第一轮产物、第二轮产物、第三轮产物和第四轮产物按照摩尔比1:1:1:1进行混合后，采用引物kpn-hhf和引物kpn-nosr组成的引物对进行pcr扩增，得到rdr片段。4、armeddonor(withtargets)-nos片段的合成(1)以化学合成定点修饰的als基因片段(序列表的序列4)为模板，采用引物kpn-donorf和引物donor-r组成的引物对进行pcr扩增，得到第一轮产物。(2)以pcxun-ubi-lbcpf1-nos质粒为模板，采用引物nos-donorf和引物kpn-nosr组成的引物对进行pcr扩增，得到第二轮产物。(3)将第一轮产物和第二轮产物按照摩尔比1:1混合后作为模板采用引物kpn-donorf和引物kpn-nosr组成的引物对进行pcr扩增，得到armeddonor(withtargets)-nos片段。5、载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos的合成将步骤2制备的osu3-rcr1-rcr2表达盒和步骤1制备的质粒pcxun-lbcpf1-nos利用同源重组酶(全式金,北京,中国)进行连接获得重组载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos，将步骤3得到的rdr片段插入重组载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos的kpni位点中，得到载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos。载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos经测序如序列表的序列1所示。序列表中序列1自5’末端起，第13至713位为osu3-rcr1-rcr2表达盒的核苷酸序列，其中，第13至393位为osu3启动子的核苷酸序列，第394至436位和第559至601位均为hammerhead(hh)型核酸酶的核苷酸序列，第481至548位和第646至713位均为丁型肝炎病毒(hdv)核酸酶的核苷酸序列，第437至480位为crrna1的核苷酸序列，第602至645位为crrna2的核苷酸序列。序列表中序列1自5’末端起，第724至1433位为rdr片段，其中，第724至766位为hammerhead(hh)型核酸酶的核苷酸序列，第1366至1433位为丁型肝炎病毒(hdv)核酸酶的核苷酸序列，第767至1365位为drt序列。序列表中序列1自5’末端起，第1434至1686位为nos终止子的核苷酸序列，第1789至2041位为nos终止子的核苷酸序列的反向互补序列；第2061至5909位为编码lbcpf1的核苷酸序列的反向互补序列，第5912至7897位为ubi启动子的核苷酸序列的反向互补序列。rdr片段中，第767至863位为上游同源臂，第864至1244位为突变区段，第1245至1365位为下游同源臂。6、载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos的合成将步骤2制备的osu3-rcr1-rcr2表达盒和步骤1制备的质粒pcxun-lbcpf1-nos利用同源重组酶(全式金,北京,中国)进行连接获得重组载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos，将步骤4得到的armeddonor(withtargets)-nos片段插入重组载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos的kpni位点中，得到载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos。经测序，载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos与载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos的区别在于：采用序列表的序列2所示的片段替代了序列表的序列1自5’端第13-1686位。序列2所示的片段，自5’端第1至701位为osu3-rcr1-rcr2表达盒的核苷酸序列，其中，第1至381位为osu3启动子的核苷酸序列，第382至424位和第547至589位均为hammerhead(hh)型核酸酶的核苷酸序列，第469至536位和第634至701位为丁型肝炎病毒(hdv)核酸酶的核苷酸序列，第425至468位为crrna1的核苷酸序列，第590至453位为crrna2的核苷酸序列。序列表中序列2自5’末端起，第709至1361位为armeddonor(withtargets)片段，其中，第709至735位为靶点1的核苷酸序列，第1335至1361位为靶点2的核苷酸序列，第736至1334位为drt序列。序列表中序列2自5’末端起，第1362至1614位为nos终止子的核苷酸序列的核苷酸序列。drt序列中，第736至832为上游同源臂，第833至1213位为突变区段，第1214至1334位为下游同源臂。7、载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos-armeddonor(withtargets)的合成以化学合成定点修饰的als基因片段(序列表的序列4)为模板，采用引物pme-donorf和引物pme-donorr组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物(armed-drt)。将步骤2制备的osu3-rcr1-rcr2表达盒和步骤1制备的质粒pcxun-lbcpf1利用同源重组酶(全式金,北京,中国)进行连接获得重组载体pcxun-lbcpf1-osu3-rcr1-rcr2，将armed-drt插入重组载体pcxun-lbcpf1-osu3-rcr1-rcr2的pmei位点中，得到载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos-armeddonor(withtargets)。载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos-armeddonor(withtargets)经测序如序列表的序列3所示。序列表中序列3自5’末端起，第13至713位为osu3-rcr1-rcr2表达盒的核苷酸序列，第13至393位为osu3启动子的核苷酸序列，第394至436位和第559至601位均为hammerhead(hh)型核酸酶的核苷酸序列，第481至548位和第646至713位为丁型肝炎病毒(hdv)核酸酶的核苷酸序列，第437至480位为crrna1的核苷酸序列，第602至645位为crrna2的核苷酸序列，第817至1069位为nos终止子的核苷酸序列的反向互补序列；第1089至4937位为编码lbcpf1的核苷酸序列的反向互补序列，第4940至6925位为ubi启动子的核苷酸序列的反向互补序列，第7217至7886位为dna修复模板armed-drt。dna修复模板armed-drt中，第7225至7251位为crrna1的靶标序列，第7252至7348位为上游同源臂，第7349至7729位为突变区段，第7730至7850位为下游同源臂，第7851-7877位为crrna2的靶标序列。载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos、载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos和载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos-armeddonor(withtargets)(对照载体)部分元件结构示意图见图1。载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos通过osu3启动的基因转录，可获得转录本rcr1-rcr2-rdr片段，其中的hh和hdv核酶对转录本进行自剪切，crrnas和rna修复模板被精确释放。载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos通过osu3启动的基因转录，可获得转录本rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)片段，其中的hh和hdv核酶对转录本进行自剪切，crrnas与armeddonor(withtargets)分开，crrnas被精确释放，lbcpf1蛋白可在rna水平armeddonor(withtargets)片段进行切割，从而获得精确的修复模板。二、水稻愈伤中rna作为修复模板介导的dna重组修复活性检测1、选取饱满的中花11水稻种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀的点入在含有2毫克/升2,4-d的灭菌nb固体培养基中，28℃黑暗培养40-50天以诱导愈伤组织的产生。2、将步骤1得到的愈伤组织在含有0.3m甘露醇和0.3m山梨醇的ms培养基中高渗处理4-6小时。3、以pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos载体为模板，利用引物t7-f和引物t7-nos-r组成的引物对进行pcr扩增，获得体外转录模板rcr1-rcr2-rdr片段，根据hiscribet7quickhighyieldrnasynthesiskit(neb)说明书要求，配制如下体系，37℃孵育6h，进行体外转录，获得转录产物(crrnas与rna修复模板)。反应体系：模板2μl(400ng)ntpbuffermix10μlt7rnapolymerasemix2μlrnase-freeddh2o6μl总体系20μl4、将步骤3得到的转录产物加入2μldnasei和30μlrnase-freeddh2o进行处理，去除dna，并经试剂盒纯化后与lbcpf1蛋白(序列表的序列7所示)进行组装，室温放置15min，形成rnp，组装体系如下：组装体系：lbcpf1蛋白10μg转录产物10μg10×buffer32μlrnaseinhibitior1μlrnase-freeddh2oxμl总体系20μl5、将步骤4得到的rnp通过基因枪转化水稻愈伤，采用0.6μm金粉，轰击压力为900psi进行轰击。6、完成步骤5后，将水稻愈伤28℃暗培养36h后提取基因组dna，以基因组dna为模板，采用引物alstestf和引物t2mr组成的引物对进行pcr扩增，将扩增产物测序检测是否发生als基因同源重组。结果如图2所示。其中，wtals为野生型als基因(序列表的序列6)；donor为修复模板序列(序列表的序列5)；下划线序列分别为靶点1和靶点2序列；斜体的碱基为定点突变的pam位点及ecorv酶切位点，斜体加粗的碱基为目标替换成的碱基。结果显示，得到的愈伤组织中，愈伤rdr35中检测到有完整同源重组，rdr41愈伤有部分同源重组。结果表明，以rna作为修复模板，可成功介导基因组dna的同源重组修复。三、转基因水稻的获得1、选取饱满的中花11水稻种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀的点入在含有2毫克/升2,4-d的灭菌nb固体培养基中，28℃黑暗培养40-50天以诱导愈伤组织的产生。2、将步骤1得到的愈伤组织在含有0.3m甘露醇和0.3m山梨醇的ms培养基中高渗处理4-6小时后，将pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos通过基因枪轰击水稻愈伤，采用0.6μm金粉，轰击压力为900psi进行轰击，轰击后在含有0.3m甘露醇和0.3m山梨醇的ms培养基上28℃暗培养16小时后转移至nb筛选培养基(含有2毫克/升的2,4-d和50毫克/升的潮霉素的nb固体培养基)中，28℃持续暗培养2周。3、完成步骤2后，选取生长良好呈嫩黄色的阳性愈伤组织，用无菌镊子移至nb预分化培养基(含有1毫克/升naa、5毫克/升aba、2毫克/升kinetin和50毫克/升的潮霉素的nb固体培养基)上，28℃持续暗培养2周。4、完成步骤3后，挑选生长旺盛的愈伤组织转入ms分化培养基(含有0.02毫克/升naa、2毫克/升kinetin和0.4μm双草醚钠盐的ms固体培养基)中，28℃持续光照培养。5、完成步骤4后，待分化出来的幼苗长至2至5毫米，转入ms固体培养基中28℃光照培养2到3周，之后移入土中置于温室生长(温度28-30℃，16小时光照/8小时黑暗)，得到t0代转基因植株(转pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos)。6、采用pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos替代pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos，按照步骤1-5进行操作，得到t0代转基因植株(转pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos)。7、采用pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos-armeddonor(withtargets)替代pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos，按照步骤1-5进行操作，得到t0代转基因植株(转pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos-armeddonor(withtargets))。四、转基因水稻的基因型鉴定待测植株：野生型中花11水稻(wt)、t0代转基因植株(转pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos)、t0代转基因植株(转pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos)和t0代转基因植株(转pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos-armeddonor(withtargets))。提取待测植株的基因组dna，以基因组dna为模板，采用引物alstestf和引物alstestr组成的引物对进行pcr扩增，将pcr扩增产物采用ecorv酶切，野生对照可以被ecorv切开并产生481bp和322bp两种类型片段，不能被ecorv完全酶切的植株鉴定为同源重组成功植株。将完全没有或者部分切开pcr产物进行克隆测序。统计结果见表2和图3。表2转基因水稻的基因型鉴定统计结果图3中，图3a为t0代转基因植株(转pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos)的检测结果，图3b为t0代转基因植株(转pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos)的检测结果。其中，wtals为野生型als基因(序列表的序列6)；donor为修复模板序列(序列表的序列5)；下划线序列分别为靶点1和靶点2序列；斜体的碱基为定点突变的pam位点及ecorv酶切位点，斜体加粗的碱基为目标替换成的碱基。对于载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-rdr-nos-ubi-lbcpf1-nos而言，共获得58棵植株。对58棵植株pcr产物用ecorv酶切鉴定后结果表明，288-6一条链为完整同源重组，另一条链为野生型。289-4和293-1一条链为部分同源重组，另一条链为野生型。。对于载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-armeddonor(withtargets)-nos-ubi-lbcpf1-nos而言，共获得87棵植株183-2,185-5和278-4一条链为完整同源重组，另一条链为野生型。198-1一条链为完整同源重组，另一条链为部分同源重组。193一条链为部分同源重组并伴随28bp缺失，另一条链为野生型。载体pcxun-osu3-rcr1-rcr2-ubi-lbcpf1-nos-armeddonor(withtargets)未得到重组植株。五、脱靶分析本实验对8颗植株进行pcr靶点1和靶点2的脱靶进行鉴定，pcr产物克隆并测序结果表明，本实验所设计的crrna1和crrna2并不存在脱靶情况。对8颗植株进行靶标1和靶标2的脱靶情况的鉴定，具体步骤为：提取植株的基因组dna，采用特异引物对进行pcr扩增，然后将pcr扩增产物进行测序。靶标1存在三个可能脱靶的位点，als1-off1、als1-off2和als1-off3。靶标2存在两个可能脱靶的位点，als2-off4和als2-off5。用于各个脱靶位点的引物对见表1。表3脱靶分析统计结果注：pam位点用下划线表示，错配碱基用斜体表示。序列表<110>中国农业科学院作物科学研究所<120>一种crispr/cpf1系统介导的以rna转录本为修复模板的同源重组方法<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>16802<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gaattcgagctcaaggaatctttaaacatacgaacagatcacttaaagttcttctgaagc60aacttaaagttatcaggcatgcatggatcttggaggaatcagatgtgcagtcagggacca120tagcacaagacaggcgtcttctactggtgctaccagcaaatgctggaagccgggaacact180gggtacgttggaaaccacgtgatgtgaagaagtaagataaactgtaggagaaaagcattt240cgtagtgggccatgaagcctttcaggacatgtattgcagtatgggccggcccattacgca300attggacgacaacaaagactagtattagtaccacctcggctatccacatagatcaaagct360gatttaaaagagttgtgcagatgatccgtggcaaaattactgatgagtccgtgaggacga420aacgagtaagctcgtctaatttctactaagtgtagatggtatggtggtgcaatgggagga480ggccggcatggtcccagcctcctcgctggcgccggctgggcaacatgcttcggcatggcg540aatgggacgaatacgaccaaattactgatgagtccgtgaggacgaaacgagtaagctcgt600ctaatttctactaagtgtagatacctgaatgacccataaagagtgggccggcatggtccc660agcctcctcgctggcgccggctgggcaacatgcttcggcatggcgaatgggaccggtacc720acacatcaactgatgagtccgtgaggacgaaacgagtaagctcgtcttgatggggatggt780agcttcctcatgaacattcaggagctggcattgatccgcattgagaacctccctgtgaag840gtgatggtgttgaacaaccaacacctaggcatggtcgtccagttggaggataggttttac900aaggcgaatagggcgcatacatacttgggcaacccggaatgtgagagcgagatatatcca960gattttgtgactattgctaaggggttcaatattcctgcagtccgtgtaacaaagaagagt1020gaagtccgtgccgccatcaagaagatgctcgagactccagggccatacttgttggacatc1080atcgtcccgcaccaggagcatgtgctgcctatgatcccaattgggggcgcattcaaggac1140atgatcctggatggtgatggcaggactgtgtattaatctataatctgtatgttggcaaag1200caccagcccggcctatgtctgacgtgaatgactcataaagagtggtatgcctatgatgtt1260tgtatgtgctctatcaataactaaggtgtcaactatgaaccatatgctcttctgttttac1320ttgtttgatgtgcttggcatggtaatcctaattagcttcctgctgggccggcatggtccc1380agcctcctcgctggcgccggctgggcaacatgcttcggcatggcgaatgggacgatcgtt1440caaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgatta1500tcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgt1560tatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatag1620aaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttac1680tagatcggtacccctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgcc1740agggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcccgatctagtaaca1800tagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagtttgcgcgctatattttgttttctatcg1860cgtattaaatgtataattgcgggactctaatcataaaaacccatctcataaataacgtca1920tgcattacatgttaattattacatgcttaacgtaattcaacagaaattatatgataatca1980tcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaagaaactttattgccaaatgtttgaacgat2040cggggaaattcggatccttactttttcttttttgcctggccggcctttttcgtggccgcc2100ggccttttgtgcttcacgctggtctgggcgtactccagccactccttgttagagatggcg2160atcttcaccttatccagcttctcgtcctcggccttcttgaactggccgatggcccacagc2220acctttctggcgatgttataggcgccattggcgtcggcgttctttggcaggatggcattc2280tcctgggcctcatagttccggctatcgtagaagatgccgtcggagttcttcacagggctg2340atcagaaaatccacgtcggtgcggcctgtgatgctgttccgcatctgcagcatcaggctc2400atcagggccataaagctagagtagaaggccttgtcggactg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