基因工程细胞及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种基因工程细胞及其应用，所述工程细胞的基因组中编码糖链修饰相关酶α?1，6?岩藻糖基转移酶的所有等位基因被敲除，所述工程细胞用于表达无岩藻糖的抗体。本发明工程细胞所表达的抗体比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的ADCC活性，其所表达的CD20抗体具有更高的抗肿瘤活性。
【专利说明】
基因工程细胞及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基因工程细胞及其应用，具体涉及一种基因组突变的工程细胞及 其应用。
【背景技术】
[0002] 近年来利用单克隆抗体（mAbs)治疗癌症取得了相当大的成功。抗体药物偶联抗 癌药成为了淋巴瘤和实体瘤强有力的新治疗选择，免疫调节抗体近来也取得了显著的临床 成效。
[0003] 抗体导致肿瘤细胞杀伤的机制主要可概括为如下两种：①抗体直接作用于靶点， 阻断受体介导的信号转导从而诱导细胞凋亡；②抗体通过免疫介导的细胞杀伤机制，包括 例如抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和 补体依赖性细胞毒性反应（complement-dependent cytotoxicity，Q)C);③调节T细胞的 抗肿瘤免疫功能；④抗体对肿瘤血管和基质的特异性效应。主要通过终止肿瘤细胞信号转 导而发挥抗肿瘤作用的抗体有西妥昔单抗（cetuximab)和曲妥珠单抗（trastuzumab)等， 主要通过ADCC而发挥抗肿瘤作用的抗体有利妥昔单抗（rituximab);调节T细胞免疫功能 的抗肿瘤抗体有易普利姆玛单抗（ipilimumab)等，以上是最成功的策略，利用这些机制发 挥作用的抗体均获得了批准。
[0004] ADCC是指表达抗体Fc受体（如Fc y RIIIa/CD16)的自然杀伤细胞（natrual killer，NK)、巨噬细胞或中性粒细胞等，通过Fc受体与已结合在病毒感染细胞或肿瘤细胞 等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，从而与靶细胞发生多重交联，进而活化并杀伤这些 靶细胞的作用。IgG抗体可介导这些细胞发挥ADCC作用，其中NK细胞是能发挥ADCC作用 的主要细胞。在抗体介导的ADCC作用的发生过程中，抗体只能与靶细胞上的相应抗原表位 特异性结合，而NK细胞等效应细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，故抗体与靶细胞上 的抗原结合是特异性的，NK细胞等对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。ADCC是利用抗体介 导药物杀伤靶癌细胞的理想机制。活化的NK细胞能释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质直接 杀伤靶细胞，也能够通过Fas与FasL作用途径诱导细胞凋亡，还可以分泌一些细胞因子如 TNF-a或IFN-y等诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖并发挥免疫调控作用。
[0005] 糖基化是最重要的一种翻译后修饰，指的是将糖基部分连接到蛋白质上。翻译 后修饰对抗体的分泌表达是非常重要的，而糖基化修饰又是其中最重要的一环，单克隆抗 体的糖基化修饰影响其在体内的功能和稳定性，而抗体的糖基化修饰直接受到表达宿主细 胞和抗体分子本身性质的影响。糖基化模式的改变对免疫原性和整体生物活性有很大影 响。抗体分子Fc段特定Asn上的寡糖链参与Fc与其受体的相互作用，进一步研究还发现 寡糖链的类型对于Fc与其受体的亲合力有重要影响。近些年来，很多研究报告表明，去除 或降低岩藻糖基化的治疗性抗体在体外表现出更高的效能（Biotechnol Bioeng. 2006Jul 5 ;94(4) :680-8.)。这主要是由于去除或降低岩藻糖基化的治疗性抗体相对于岩藻糖基化 的抗体，可以在更低浓度下通过与Fey Rllla的高亲和力而表现出较强的ADCC作用（Mol Immunol. 2007May ;44(12) :3122-31.)。因此，去除或降低岩藻糖基化抗体的应用有望成为 提高下一代治疗性抗体效能的有效手段。因此，研究出能生产无岩藻糖基化抗体的工程细 胞株是本领域的技术人员急待解决的问题。
[0006] 抗体分子Fc段N-糖苷连接糖链的合成如下所述：糖蛋白在内质网（以后称为 "ER"）腔中用糖链进行修饰。在N-糖苷连接糖链的生物合成步骤中，相对大的糖链被转移 至在ER腔中延伸的多肽链上。在转变过程中，糖链首先连续加入到由大约20个a -异戊二 烯单位组成的长链脂质载体的磷酸基团上，称为磷酸多萜醇（此后有时称为"P-Dol")。即， N-乙酰氨基葡萄糖被转移至磷酸多萜醇形成GlcNAc-P-P-Dol，然后转移又一个GlcNAc，从 而形成GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol。下一步，5个甘露糖（此后有时甘露糖被称为"Man"）被 转移，因此形成（Man)5-(GlcNAc)2-P-P-D 〇l，然后四个Man和三个葡萄糖（此后葡萄糖有时 被称为"Glc"）被转移。因此，形成了糖链前体，（Gl C)3-(Man)9-(GlcNAC)2-P-P-D〇M：a^ 形成了核心寡糖。含有14个糖的糖链前体被作为一个团体转移至内质网腔中含有天冬酰 胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸序列的多肽上。在反应中，结合至核心寡糖上的磷酸多 萜醇（P-P-Dol)被释放，但通过焦磷酸酶的水解作用再次成为磷酸多萜醇，并再进行循环。 在糖链与多肽结合后立即开始糖链的加工。即，三个Glc和一个或两个Man在内质网上被 删除，已知a-1，2-葡萄糖苷酶I，a-1，3-葡萄糖苷酶II和a-1，2-甘露糖苷酶与删除作 用有关。在内质网上被加工的糖蛋白被转移至尚尔基体上，被进彳丁不同的修饰。在尚尔基 体腔cis部分，存在有关添加甘露糖磷酸的N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶，N-乙酰氨基葡 萄糖1-磷酸二酯a -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和a -甘露糖苷酶I，并将Man残基还原至5。 在高尔基体的中间部分，存在涉及在复合物型N-糖苷连接糖链的外侧第一个GlcNAc的添 加的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I (GnTI)，涉及删除两个Man的a -甘露糖苷酶II，涉及从 外侧添加第二个GlcNAc的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II (GnTII)和涉及岩藻糖添加至还 原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上的a-1，6-岩藻糖基转移酶（编码基因为FUT8)。在高尔基 体的trans部分，存在与半乳糖的添加有关的半乳糖转移酶和与唾液酸如N-乙酰神经氨酸 的添加有关的唾液酸转移酶或类似物。已知N-糖苷连接糖链是通过这些不同酶的作用形 成的。
[0007] TALENs技术已被广泛地用于基因组定点修饰。但是目前为止，无论是ZNFs还 是TALENs的筛选以及组装过程都存在着较高的技术难度，并且筛选的工作量很大。此 外，TALENs潜在的细胞毒性问题仍有待人们进行深入的研究。Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR associated(Cas)系统 是继锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZNFs)及转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator like effector nucleases，TALENs)技术之后一种新的对基因 组进行高效定点修饰的技术。这种系统是细菌以及古细菌在进化过程中形成的可以降解外 来病毒或核酸的具有免疫以及调节功能的系统（Science 327, 167(2010))。CRISPR/Cas系 统中的Cas蛋白可以在gRNA(guide RNA)的引导下对DNA进行定点切割（Science. 2013Feb 15 ;339 (6121) :823-6 和 Science. 2013Feb 15 ;339 (6121) :819-23)。CRISPR/Cas 系统的发 现为开发更为简易的高效基因定点修饰技术提供了崭新的平台。在此，我们利用CRISPR/ Cas系统定点敲除了 CH0细胞中负责蛋白岩藻糖化修饰的FUT8基因（fucosyltransferase 8/alpha 1，6fucosyltransferase)，并用这种基因敲除的工程细胞株生产出了无岩藻糖化 的单抗。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于，利用CRISPR/Cas系统对目的基因组进行定点修饰，获得不表 达a -1，6_岩藻糖基转移酶的突变基因组，并用含有所述突变基因组的细胞生产无岩藻糖 化的抗体，所述细胞产生的抗体组合物比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的ADCC 活性。
[0009] 本发明的第一方面，提供了一种基因工程细胞，所述细胞的基因组中编码糖链修 饰相关酶a -1，6_岩藻糖基转移酶的所有等位基因被敲除；所述糖链中岩藻糖的1位与 N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过a-键连接。较佳的， 所述细胞的基因组中还含有spCas9基因；更佳的，所述细胞的基因组中还含有靶向FUT8基 因的gRNA基因，所述gRNA的基因序列为：SEQ ID NO. 1靶向FUT8基因的上游、SEQ ID N0. 2 靶向FUT8基因的中游、以及SEQ ID NO. 3靶向FUT8基因的下游。
[0010] 进一步的，所述细胞对以下至少一种凝集素具有抗性：小扁豆凝集素、豌豆凝集 素、蚕豆凝集素和陈皮木耳凝集素。
[0011] 进一步的，所述细胞为：来源于中国仓鼠卵巢组织的CH0细胞、大鼠骨髓瘤细 胞系、YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20细胞、小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞、小鼠骨髓瘤细胞系 SP2/0-Agl4细胞、来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞或/和产生抗体的杂交瘤细胞；优 选所述细胞为CH0细胞。
[0012] 进一步的，所述细胞含有编码抗体分子的基因。较佳的，所述抗体分子为：人抗体、 人源化抗体、含有人抗体或人源化抗体Fc区的抗体片段或/和含由人抗体或人源化抗体Fc 的融合蛋白。较佳的，所述的抗体分子属于IgG型。
[0013] 进一步的，所述细胞产生的抗体组合物比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高 的ADCC活性。所述细胞产生的抗体组合物的糖链中，岩藻糖的1位不与N-糖苷连接的糖 链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过a -键连接。
[0014] 本发明的第二方面，提供了一种无岩藻糖化的抗体，所述抗体由本发明第一方面 所述的细胞表达。
[0015] 本发明的第三方面，提供了本发明第一方面所述细胞的用途，其用于制备无岩藻 糖化的抗体。
[0016] 本发明公开的上述基因工程细胞株是通过以下方法得到的：CRISPR/Cas基因打 革巴系统中的Cas蛋白可以在gRNA的引导下对DNA进行定点切割，我们设计了革巴向中国仓鼠 FUT8基因的gRNA的序列，这些序列由苏州金唯智技术服务有限公司合成，然后我们用此特 异的打靶系统将CH0细胞中的FUT8基因敲除，然后用相应的凝集素筛选基因敲除成功的细 胞克隆，最后我们将得到的抗性细胞用有限稀释法单克隆化，得到了我们所公布的细胞株。
[0017] 本发明的
【申请人】对上述基因工程细胞株所产生的抗体进行了亲和力检测、ADCC测 试、药物代谢动力学、体内抑制肿瘤生长等实验。实验结果表明，本发明公开的基因工程CH0 细胞株所产生的CD20抗体与母本细胞产生的相应抗体相比，可以与Fc y RIIIa/CD16以更 高的亲和力结合，并且具有更强的ADCC效应。此外，本发明公开的基因工程CH0细胞株所 产生的CD20抗体与母本细胞产生的相应抗体在药物代谢动力学方面没有明显差异。最后 实验表明，在相等剂量下，本发明公开的基因工程细胞株所产生的CD20抗体具有更好的抗 肿瘤效果。以上结果均达到了本发明的目的。
【附图说明】
[0018] 图1是抗⑶20抗体的岩藻糖化检测；
[0019] 图2是抗CD20抗体与Fc y RIIIa/CD16的亲和力；
[0020] 图3是抗CD20抗体的ADCC效应；
[0021] 图4是抗⑶20抗体的药代动力学；
[0022] 图5是抗⑶20抗体的体内抗肿瘤活性。
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例、实验例是对本发明的进一步说明，不应理解为对本发明的限制。实 施例不包括对常规方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基 因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对本领域 中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如：Sambr 〇〇k， J. , Fritsch, E.F. and Maniais, T. (1989)Molecular Cloning ：A Laboratory Manual,2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0024] 实施例1 :FUT8基因敲除载体的构建
[0025] CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白可以在gRNA(guide RNA)的引导下对DNA进行定 点切割。在此我们获得了经过优化了的CRISPR/Cas基因打靶载体pX335-U6-Chimeri C_ BB-CBh-hSpCas9n(D10A)(购买自 Addgene，货号 Plasmid 42335 ;Science. 2013Feb 15 ; 339(6121) : 819-23)，此载体表达密码子经过优化因而适合在哺乳动物细胞中表达的Cas9 基因，另外此载体还可以将设计好的靶向RNA序列插入U6启动子下游从而实现嵌合gRNA 的表达，从而实现CRISPR/Cas系统完整的基因打靶功能。靶向FUT8基因的gRNA的序 列设计和选择参照美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)所公布的中国仓鼠FUT8的全长基因序列（XM_003501735. 1)。 我们设计了三段gRNA分别靶向FUT8基因的上中下游：TGCGGGCATGGACTGGTTCC， AAACAAGCTAGGAATGATCT，AGATGGAGCAGGTGAGTGGC。这些片段由苏州金唯智技术服务有限公 司合成，合成后的片段插入到U6启动子下游的限制性内切酶Bbsl (New England Biolabs) 识别的位点。测序验证后确认获得了正确的克隆。上述质粒转染DH_5a感受态细胞，挑取 单克隆后摇瓶内培养，用商业化的中抽试剂盒（上海生工产品）获得转染中国仓鼠细胞CH0 所用的质粒。
[0026] 实施例2 :CRISPR/Cas/FUT8基因敲除载体转染CH0细胞
[0027] 于125ml细胞培养摇瓶中接种30ml密度5X105个/ml的CH0-S(Life technologies公司产品）细胞，第二天细胞密度增至1 X 106个/ml且细胞活率高于 95 %时进行转染：将50 y 1浓度为1 y g/ y 1的CRISPR/Cas/FUT8基因敲除载体稀释 到 1. 45ml0ptiPR0?SFM(Life technologies 产品）中，轻轻混匀；将 50 y 1 转染试剂 FreeStyle?MAX (Life technologies 产品）稀释到 1.45ml0ptiPR0?SFM 中，轻轻混勾；立即 将稀释后的FreeStyle?MAX溶液慢慢加入到稀释后的DNA溶液中，加入时枪头浸于液面之 下并慢慢排出液体；立即上下颠倒数次使溶液混匀，室温下孵育10分钟左右以使DNA-脂质 体复合物形成；将3mlDNA-FreeStyle?MAX复合物逐滴加入到上述培养细胞的摇瓶中，边加 边轻摇培养瓶；转染后的细胞培养物置于37°C、8% C02、转速130rpm的细胞培养摇床上培 养。
[0028] 如果FUT8基因被成功敲除或灭活，FUT8在细胞内的活性会降低，那么细胞膜蛋 白的岩藻糖化会降低，因而这类细胞对能识别岩藻糖（1位通过a键结合于N-乙酰葡糖 胺6位的糖链）的凝集素是有抗性的。转染48小时后，离心收集细胞。将培养液换成含有 800 y g/ml小扁豆凝集素LCA(来源于Lens culinaris的扁豆凝集素，能识别岩藻糖；Sigma 产品）的选择培养基筛选稳定的抗性克隆；大约两周之后，待细胞活率和密度恢复时，离心 收集细胞，有限稀释法将细胞接种到圆底96孔板中（Corning产品）使细胞单克隆化。生 长达到一定程度的细胞进一步接种到12孔或6孔甚至转移至培养瓶中，随后继续在含有植 物凝集素的培养基中培养。
[0029] 建立的单克隆细胞株用商业化试剂盒（上海生工产品）抽提总RNA并逆转录成 cDNA后，用PCR法检测其中FUT8基因的突变情况，PCR正向引物序列为：5' -TATGGATCCAT GCGGGCATGGACTGGITCCTGG-3'，反向引物序列为：5' -ATAGCGGCCGCAITITTCAGCTTCAGGATATGT AGG-3'。PCR 均米用高保真 DNA 聚合酶（Takara 公司的丨 YimeSTAR1、HS DNA Polymerase)。 扩增FUT8基因的反应条件按照DNA聚合酶生产商说明书合理设置：95°C 20秒；55°C 10 秒，72°C 1分/kb ;30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后再经限制性内切酶 BamH I和Not I酶切，然后克隆到克隆型载体pBluescript(+)中，克隆后的载体用来测序。 筛选出基因阅读框发生移码突变的单克隆细胞株，记作CH0-S-FUT8-/-，做下一步的分析和 验证。
[0030] 实施例3 :抗⑶20抗体在CH0-S-FUT8 /中的表达和纯化
[0031] 于125ml细胞培养摇瓶中接种30ml密度5X 105的的CH0-S或CH0-S-FUT8 /细胞， 第二天细胞密度增至1 x 106且细胞活率高于95 %时进行转染，具体转染方法如实施例2中 所述。转染48小时后，离心收集细胞，将培养液换成含有20 y g/ml嘌呤霉素（Puromycin) 和200nM甲氨喋呤（MTX)的选择培养基筛选稳定转染的抗性克隆；大约两周之后，待细胞 活率和密度恢复时，离心收集细胞，将培养液换成含有50μg/ml嘌呤霉素（Puromycin)和 1000nM甲氨喋呤（MTX)的选择培养基；大约一周之后，待细胞活率和密度恢复时，离心收集 细胞，将培养液换成不含抗生素的培养基，置于37°C、8% C02、转速130rpm的摇床上悬浮培 养10天，期间在第3、5、7、9天以4g/L的终浓度补加葡萄糖；10天后，细胞培养物经低速离 心300gX 5min去除大部分细胞以及细胞残片后，再经高速离心10000gX lOmin除去仍然悬 浮的固形物，然后抽滤（滤膜孔径〇. 45 y m)，最后用Protein A亲和层析柱（GE公司产品） 从获得的澄清液体中分离纯化抗CD20抗体。纯化产物经PBS进行透析，最后以人免疫球蛋 白为标准品用BCA(Bicinchoninic acid)法进行定量。
[0032] 实施例4 :抗CD20抗体的岩藻糖化检测
[0033] 糖链分析采用ELISA法：小扁豆凝集素LCA用0. 05mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9. 6) 稀释成2 y g/ml，96孔酶标板每孔添加100 y 1上述稀释后的蛋白溶液，4°C于湿盒内过夜； 次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液（含有0. 05% Tween-20的磷酸盐缓冲液）洗3次，每 次3分钟；将不同稀释度的对照抗⑶20抗体、在CH0-S-FUT8-/-中表达的抗⑶20抗体，以 及经N-糖苷酶F(Takara公司产品）消化以消除糖链的对照抗⑶20抗体加于上述已包被 的反应孔中，置37°C孵育1小时；然后用洗涤缓冲液洗涤，加辣根过氧化物酶标记的羊抗 人IgGl抗体（Fab特异，Sigma公司产品）于各反应孔中，37°C孵育1小时，洗涤；于各反应 孔中加入临时配制的TMB底物溶液0. lml显色，37°C放置10~30分钟；于各反应孔中加 入 2mol/L 硫酸 0.05ml 终止反应；置酶标仪上（SpectraMax i3Multi_Mode Platform，美国 BI0-TEK公司）测定450nm波长处测定吸光值。
[0034] 实验结果表明：如图1所示，所述修饰使CH0-S-FUT8-/-表达的抗⑶20抗体不存 在岩藻糖化修饰。
[0035] 实施例5 :无岩藻糖化抗CD20抗体与Fc y RIIIa/CD16的亲和力检测实验（ELISA 法）
[0036] 实验步骤：V158和F158两种变体的重组蛋白Fc y Rllla (R&D公司产品）用 0. 05mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9. 6)分别稀释成2 y g/ml，96孔酶标板每孔添加100 y 1上 述稀释后的蛋白溶液，4°C于湿盒内过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液（含有0.05% Tween-20的磷酸盐缓冲液）洗3次，每次3分钟；将不同稀释度的抗⑶20抗体100 y 1加 于上述已包被的反应孔中，置37°C孵育1小时；然后用洗涤缓冲液洗涤，加辣根过氧化物 酶标记的羊抗人IgGl抗体（Fab特异，Sigma公司产品）于各反应孔中，37°C孵育1小时， 洗涤；于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0. lml显色，37°C放置10~30分钟；于 各反应孔中加入2mol/L硫酸0. 05ml终止反应；置酶标仪上（SpectraMax i3 Multi-Mode Platform，美国BI0-TEK公司）测定450nm波长处测定吸光值。
[0037] 实验结果表明：如图2所示，与对照抗体相比，无岩藻糖化抗CD20抗体对 Fc yRIIIa的两个变体均具有更高的亲和力。
[0038] 实施例6 :无岩藻糖化抗CD20抗体的ADCC效应测试
[0039] 实验步骤：人Burkitt' s淋巴瘤细胞系Daudi和Raji细胞购自美国典型培养物保 藏中心（American type culture collection，ATCC)，作为ADCC测试中的革巴细胞。效应细 胞外周血单个核细胞通过Ficoll密度梯度离心分离自新鲜人外周血，并以3X10 5/孔的浓 度加入至实验孔，最终使效应细胞与靶细胞的比例为50 :1。37°C孵育4小时后通过乳酸脱 氢酶LDH法（Sigma公司产品）检测杀伤情况。
[0040] 结果表明：如图3所示，无岩藻糖化抗CD20抗体比岩藻糖化抗体具有更高的ADCC 效能。
[0041] 实施例7 :无岩藻糖化抗CD20抗体的药代动力学实验
[0042] 实验步骤：10周龄、无特定病原体（Specific-pathogen free，SPF)的成年雄 性Wistar大鼠，体重350-400g，随机分为八组，每组四只，通过皮下注射（Subcutaneous， S.C.)或静脉注射（Intravenous，I.V.)分别给予药物溶剂、对照抗⑶20抗体以及无岩藻 糖化抗CD20抗体，抗体的剂量设为4mg/kg。所有大鼠于注射后0. 5h，lh，2h，6h，12h，24h， 4811，5(1，10(1，15(1，20(1，25(1，30(1后取血（内眦静脉取血），每只大鼠取血约100^1，加0.1% 的肝素混勾，4000rpm离心20min，取上清，弃沉淀。检测血衆中抗体的浓度采用ELISA法： 重组蛋白⑶20(R&D公司产品）用0. 05mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9. 6)稀释成2μg/ml，96孔 酶标板每孔添加l〇〇yl上述稀释后的蛋白溶液，4°C于湿盒内过夜；次日，弃去孔内溶液， 用洗涤缓冲液（含有〇. 05% Tween-20的磷酸盐缓冲液）洗3次，每次3分钟；将不同稀释 度的大鼠血浆加于上述已包被的反应孔中，置37°C孵育1小时；然后用洗涤缓冲液洗涤， 加辣根过氧化物酶标记的大鼠抗人IgGl抗体（Fc特异，Sigma公司产品）于各反应孔中， 37°C孵育1小时，洗涤；于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0. lml显色，37°C放置 10~30分钟；于各反应孔中加入2mol/L硫酸0. 05ml终止反应；置酶标仪上（SpectraMax i3Multi_Mode Platform，美国BIO-TEK公司）测定450nm波长处测定吸光值。
[0043] 结果表明：如图4所示，对照抗CD20抗体以及无岩藻糖化抗CD20抗体在体内的代 谢没有显著差异。
[0044] 实施例8 :抗CD20抗体的体内抑制肿瘤生长实验
[0045] 为检测抗⑶20抗体的体内抗肿瘤活性，此处采用以Balb/c-nu/nu为宿主的人 肿瘤移植模型。首先将人Burkitt' s淋巴瘤细胞系Daudi细胞通过尾静脉注射接种于 到 5-6周龄的雄性无胸腺裸鼠Balb/c-nu/nu(上海斯莱克实验动物有限公司）体内， 每只接种IX 106个肿瘤细胞；接种第二天小鼠随机分组，每组8只，分别通过腹腔注射 (Intraperitoneal，I. P.)给予对照抗⑶20抗体以及无岩藻糖化抗⑶20抗体，以及无关对 照蛋白人IgGl和药物溶剂PBS，对照抗⑶20抗体剂量设置为4mg/kg，无岩藻糖化抗⑶20 抗体设置低中高三个剂量组：1，2,4mg/kg ;此后每周给药两次，对接种Daudi细胞的小鼠， 每天统计各组小鼠的死亡情况，最终数据用Kaplan-Meier生存曲线分析。
[0046] 结果表明：如图5所示，无关对照蛋白人IgGl和药物溶剂PBS组间小鼠生存率基 本一致；与对照抗CD20抗体相比，无岩藻糖化抗CD20抗体能更加显著延长小鼠的生存率， 说明后者对肿瘤细胞生长的抑制作用更强。
【主权项】
1. 一种基因工程细胞，其特征在于：所述细胞的基因组中编码糖链修饰相关酶α -1， 6-岩藻糖基转移酶的所有等位基因被敲除；所述糖链中岩藻糖的1位与Ν-糖苷连接的糖 链复合体中还原端的Ν-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接。2. 如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞对以下至少一种凝集素具有抗性：小扁豆 凝集素、豌豆凝集素、蚕豆凝集素和陈皮木耳凝集素。3. 如权利要求2所述的细胞，其中，所述细胞含有spCas9基因。4. 如权利要求3所述的细胞，其中，所述细胞的基因组中含有靶向FUT8基因的gRNA基 因，所述gRNA的基因序列为：SEQ ID NO. 1靶向FUT8基因的上游、SEQ ID NO. 2靶向FUT8 基因的中游、以及SEQ ID NO. 3靶向FUT8基因的下游。5. 如权利要求4所述的细胞，其中，所述细胞为：来源于中国仓鼠卵巢组织的CH0细 胞、大鼠骨髓瘤细胞系、YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20细胞、小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞、小鼠 骨髓瘤细胞系SP2/0-Agl4细胞、来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞或/和产生抗体的杂 交瘤细胞。6. -种无岩藻糖化的抗体，其特征在于，所述抗体由权利要求1-5任一项所述的细胞 表达。7. 权利要求1-5任一项所述的细胞在制备无岩藻糖化的抗体中的应用。
【文档编号】C12N5/10GK105821003SQ201410854016
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年12月31日
【发明人】赵杰, 张成海, 朱玲巧
【申请人】三生国健药业（上海）股份有限公司