专利名称：一种筛选激活潜伏感染hiv-1化合物的t淋巴细胞及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程和细胞工程领域，涉及一种用于筛选再次激活潜伏感 染HIV-1化合物的人T淋巴细胞系模型及其制备方法。
背景技术：
获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由HIV感染引起的一种严重危害人们生命 健康的传染性疾病。据WHO统计全球艾滋病患者已超过4000万，每年新增患 者500万，而每年死亡约为300万。目前，艾滋病临床治疗方法主要是高效抗逆 传录病毒疗法(Highly active antiretroviral therapy, HA ART)，由于它能有效减少 病毒载量(virus load)和保护免疫功能，从而相应地延长了 HIV感染者的存活 时间。然而，该疗法只能抑制病毒复制，不能彻底清除HIV的感染，大多数病人 在中断HAART后会出现病毒反弹，其主要原因是HIV会整合在静止型记忆细 胞CD4阳性T细胞的基因组中。这些细胞半衰期较长，据估计，机体要清除这 些病毒储存库的细胞需要40-60年。最近，免疫刺激治疗的策略可通过对感染细 胞的再次激活，从而促进细胞死亡以此加速病毒库的清除，因而，该策略为病 毒储存库的控制开辟了新的思路。尽管对病毒储藏库的消除已有几个方案，但在 临床上仍未获得满意的效果，因此，研发新型激活潜伏感染细胞药物已是迫在眉 睫，而建立相应药物筛选模型是一个关键环节。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于筛选再次激活潜伏感染HIV-1化合物的人T 淋巴细胞。
本发明的另一个目的是提供上述细胞的制备方法。 本发明的再一个目的是提供上述细胞的应用。
HIV分为HIV-1和HIV-2两个型。目前广泛流行于全球的毒株是HIV-1型。 HIV-2毒株虽然发现于西非地区，随着时间的推移，该毒株在欧洲、美国和南美、 亚洲一些感染者中也被检测到，尤其亚洲印度的HIV-2感染者数量正在迅速增 加，我国在新疆、上海等地区也已陆续发现。当然不论从全球乃至我国，HIV-1 是当前主要的艾滋病流行毒株。若要获得有效安全的再次激活潜伏感染HIV-l 化合物，就必须大规模在于HIV-l潜伏的细胞模型上进行筛选。由于HIV-l潜 伏的静止型记忆CD4细胞数量较少，且其形态上与正常CD4细胞一样，分离纯 化和鉴定病毒储存库的细胞较难，因而，以患者HIV-l潜伏的感染细胞为药物 筛选模型较困难。为此，本发明将携带EGFP报告基因的HIV-l的慢病毒感染人 淋巴细胞系，模拟HIV-l感染正常人T淋巴细胞的状况，通过细胞分选，获得 不表达的细胞并进行克隆扩增，对这些克隆进行HIV整合检测，然后，获得具 有HIV整合但未表达EGFP的克隆。为了验证该细胞模型的可用性，我们利用 TNF-a进行诱导，最后获得诱导性的EGFP表达克隆，该基因修饰细胞系即为 潜伏感染HIV-1的人T淋巴细胞模型，该模型将为HIV-1潜伏的机制研究，尤 其是为病毒储藏库控制药物的筛选奠定基础。
本发明提供了一种筛选激活潜伏感染HIV-1药物的T淋巴细胞，该细胞是被 携带报告基因的HIV慢病毒感染同时又不表达Jurkat稳定株。
本发明所述Jurkat稳定株已经提交中国典型培养物保藏中心(中国武汉.武 汉大学)保藏，保藏号为CCTCC NO. C200821,名称为Jurkat-LTRGT细胞系， 保藏日期为2008年5月19日。
本发明提供了一种基于HIV-1慢病毒包装载体系统，由FGW质粒、CMV A8.9和包膜质粒VSVG组成(其结构示意图分别如图1、 2和3所示)组成..
本发明的FGW质粒是在FUGW慢病毒载体基础上,经过基因缺失泛素调控 区改建而成。FUGW, CMVA8.9和包膜质粒VSVG来源于美国Carlos Lois博士 惠赠。FUGW来源于文章Lois C, et al. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by ientiviral vectors. Science, 2002,295:868-72。 FGW质粒是由FUGW衍生的、已除去HIV-1有害基因后的HIV长末端重复序 列(LTR)及FLAP作为骨架，表达仅由LTR调控的绿色荧光蛋白基因(EGFP);
pCMV.厶8.9为包装结构质粒，主要起病毒包装功能，表达酶蛋白形成病毒衣壳 结构及整合酶(IN) ; VSVG为包膜质粒。
本发明所述的药物可以是人工合成，也可以是从植物中提取。
另一方面，本发明提供了上述细胞的制备方法，即将携带EGFP报告基因 的HIV-1的慢病毒感染人T淋巴细胞系Jurkat，通过细胞分选和HIV整合检测， 获得具有HIV整合但未表达EGFP的克隆。
本发明中，可以进一步利用TNF-a进行不同浓度的诱导激活，分析荧光强 度和荧光阳性的细胞数目，最后筛选并获得可诱导性的EGFP表达克隆。
本发明还提供了慢病毒的制备方法，该方法包括以下步骤 该制备方法包括以下步骤 (1 ) FUGW载体经Pacl+Bamhl酶切,回收7KB片段并T4连接酶连接而 获得泛素调控区缺失的FGW质粒；
(2) FGW质粒、包膜质粒VSVG和包装结构质粒CMVA8.9质粒混合， 转染人293T细胞，48小时后，收集上清，经超速离心获得FGW病毒，其滴度 应在10E5-10E8， -80度储存。
本发明的制备方法中，(2)中采用混合质量比为5: 4: 3~~4: 3: 2。质粒 FGW， pCMV.A8.9,及VSVG三部分共转染时，三者质量比可以为2: 1.5: 1; 如三质粒共转染100CM培养皿，FGW， pCMV.A8.9及VSVG所需量可以是 10ug,7.5ug和5ug。共转染方法可以通过脂质体，磷酸钙，PEI等。
(3) 将(2)获得FGW病毒感染人T淋巴细胞Jurkat，感染72小时后经 流式细胞仪进行细胞分选，收集未荧光表达的细胞并在96孔板上进行单个细胞 克隆扩增。抽提每个细胞克隆基因组DNA，进行病毒整合检测。
(4) 病毒整合检测所用引物如下:EGFP(4021)-F, 5-TAGCAATACAGCAG CTACCAATGCTGATTG-3;EGFP(4371)-R， 5-GTGTTCTCTCCTTCATTGGCTT CTTCTACC-3. PCR反应条件为,95度1分;95度30秒,58度40秒,72度45秒;30 个循环.延伸10分.PCR产物在1.5凝胶上电泳，目的带应在350BP处的单一条 带.
(5) 将(4)整合阳性的细胞克隆进行扩增，一部分细胞冻存，一部分细胞用 TNF- 进行不同浓度的诱导激活(O ng/mL, 0.3 ng/mL， 0.6 ng/mL， 1.2 ng/mL， 2.4 ng/mL ,4.8 ng/mL9.6 ng/mL,)，分析荧光强度和荧光阳性的细胞数目，最后筛选并 获得可诱导性的EGFP表达克隆为病毒储藏库控制药物进行筛选的细胞模型.
(6) FGW病毒感染耙细胞除人T淋巴细胞Jurkat外，可以是人单核巨嗜细胞, 星型胶质细胞.
本发明还提供了上述细胞的应用，即将化合物加入上述用于筛选再次激活 潜伏感染HIV-1化合物的人T淋巴细胞系模型细胞，能使细胞出现绿色荧光的 化合物即为候选激活潜伏感染HIV-1药物。
本发明将携带EGFP报告基因的HIV-1的慢病毒感染人T淋巴细胞系 Jurkat，模拟HIV-1感染正常人T淋巴细胞的状况，通过细胞分选和HIV整合检 测，获得具有HIV整合但未表达EGFP的克隆。然后，利用TNF-a进行不同浓 度的诱导激活，分析荧光强度和荧光阳性的细胞数目，最后筛选并获得可诱导性 的EGFP表达克隆。本发明的目的是提供一种为HIV-1潜伏机制的研究，尤其是 为病毒储藏库控制药物进行筛选的细胞模型。
图l.FGW载体结构示意图。 图2.VSVG载体结构示意图 图3.pCMV.A8.9结构示意图。
图4. TNF-a诱导激活后荧光显微镜下观察细胞荧光的结果示意图。
图5.TNF-a诱导激活后细胞绿色荧光强度的结果示意图。
图6.不同浓度的TNF- a诱导激活后绿色荧光细胞数的结果示意图。
具体实施例方式
实施例1 慢病毒载体制备方法
慢病毒载体FUGW用Pacl+Bamhl酶切，回收8691BP片段,T4连接酶连接， 转化细菌克隆抽提DNA序列分析,最后获得泛素调控区缺失的FGW质粒。
实施例2 慢病毒载体制备
将FGW载体，与包装结构质粒CMVA8.9和包膜质粒(VSVG)以2 : 1 : 1质量比例混合。利用脂质体LipofectamineTM在293T细胞上进行转染，24~48 h后在荧光显微镜下观察，出现大量荧光后收集病毒上清，收集的病毒上清浓缩 后分装备用或立即使用.重组慢病毒活性测定时，将浓縮后的病毒贮存液作不同 比例稀释，感染细胞48h后在荧光显微镜下进行荧光计数，确定滴度。FGW载 体作为对照。结果显示，位点特异整合性慢病毒滴度为6.8X10—7TU/ML.
实施例3慢病毒系统感染细胞分析
将上述lul慢病毒系统FGW-(被质粒CMVA8.9包装)感染6孔板上Jurkat 细胞系。72h后在荧光显微镜下进行观察，结果显示，Jurkat系细胞可见绿色荧 光；感染效率为82.1%。收集未荧光表达的细胞并在96孔板上进行单个细胞克 隆扩增。
实施例4 FGW慢病毒感染细胞后整合分析
抽提上述被感染细胞基因组DNA，用PCR和序列分析方法鉴定是否病毒基 因 组 整 合 EGFP(4021)-F,
5誦TAGCAATAC AGC AGCTACC AATGCTGATTG-3 ;EGFP(4371 )-R， 5-GTGTTCTCTCCTTCATTGGCTTCTTCTACC-3. PCR反应条件为,95度1分;95 度30秒,58度40秒，72度45秒;30个循环.延伸10分.PCR产物在1.5凝胶上电 泳。结果显示，FGW-慢病毒感染Jurkat细胞，岁未见荧光表达,但能扩增出350bp 的目的条带.
实施例5.不同浓度的TNF- a诱导Jurkat细胞报告基因激活 为了验证整合阳性的细胞克隆是否能被免疫抑制剂激活,细胞在24孔板上 用TNF- a进行不同浓度的诱导激活(O ng/mL， 0.3 ng/mL， 0.6 ng/mL， 1.2 ng/mL,
2.4 ng/mL ,4.8 ng/mL,9.6 ng/mL)， 24小时后，用流式细胞仪分析荧光强度和荧光 阳性的细胞数目，结果显示,随着TNF- a浓度升高，Jurkat细胞表达荧光强度也增 高在2.4ng/mLTNF-a浓度时荧光阳性的细胞数目达最大，以后处于平台期。
实施例6 IL-7诱导Jurkat细胞报告基因激活
为了验证整合阳性的细胞克隆是否能被免疫抑制剂激活,细胞在24孔板上 用IL-7进行不同浓度的诱导激活(O ng/mL, 0.3 ng/mL， 0.6 ng/mL, 1.2 ng/mL, 2.4 ng/mL ,4.8 ng/mL,9.6 ng/mL)， 24小时后，用流式细胞仪分析荧光强度和荧光阳性 的细胞数目，结果显示,随着IL-7浓度升高，Jurkat细胞表达荧光强度也增高,在大 于等于2.ng/mL IL-7浓度时荧光阳性的细胞数目趋于稳定。
序列表
<110〉 复旦大学
〈120〉 一种筛选激活潜伏感染HIV-1化合物的T淋巴细胞及其制备方法
〈130〉 31
<160> 3
<170〉 Patentln version 3.1
<210> 1
〈211〉 30
<212〉 ■
<213> Artificial
<400> 1
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<210〉 2
<211> 30
<212> DNA
<213〉 Artificial
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<212> DNA
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<220>
〈221〉 LTR
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<223〉
<220>
<221> RRE
<222> (1118).. (1895) <223>
<220〉
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<220〉
<221> EGFP
<222〉 (2601). (3434)
<223>
〈220〉
<221> 冊V
〈222〉 (3435), (4002) <223>
<220>
<221〉 LTR
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teiggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgac869权利要求
1.一种筛选激活潜伏感染HIV-1药物的T淋巴细胞，其特征在于，该细胞是被携带报告基因的H工V慢病毒感染同时又不表达该报告基因的Jurkat稳定株。
2. 如权利要求l所述的细胞，其特征在于，该细胞保藏号为 CCTCC NO. C200821的细胞。
3. —种权利要求1所述细胞的制备方法，其特征在于，将携带EGFP 报告基因的HIV-1的慢病毒感染人T淋巴细胞系Jurkat，通过细胞分选和 HIV整合检测，获得具有HIV整合但未表达EGFP的克隆。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，进一步利用TNF-a 进行不同浓度的诱导激活，分析荧光强度和荧光阳性的细胞数目，最后筛选 并获得可诱导性的EGFP表达克隆。
5. —种权利要求1所述细胞的应用，其特征在于，将化合物加入权 利要求1所述细胞，能使细胞出现绿色荧光的化合物即为候选激活潜伏感染 HIV-1药物。
全文摘要
本发明属于基因工程和细胞工程领域，涉及一种用于筛选再次激活潜伏感染HIV-1化合物的人T淋巴细胞系模型及其制备方法。本发明提供了一种筛选激活潜伏感染HIV-1药物的T淋巴细胞，该细胞是被携带报告基因的HIV慢病毒感染同时又不表达Jurkat稳定株。本发明所述细胞的保藏号为CCTCC NO.C200821。本发明提供了上述细胞的制备方法，即将携带EGFP报告基因的HIV-1的慢病毒感染人T淋巴细胞系Jurkat，通过细胞分选和HIV整合检测，获得具有HIV整合但未表达EGFP的克隆。本发明为病毒储藏库控制药物进行筛选的细胞模型。
文档编号C12N5/10GK101372707SQ20081003885
公开日2009年2月25日 申请日期2008年6月12日 优先权日2008年6月12日
发明者龙 余, 刘绍辉, 唐丽莎, 朱焕章, 辛清婷 申请人:复旦大学