专利名称：一种构建人单克隆抗体片段复合物的方法
技术领域：
本发明涉及生物医学、基因工程和细胞工程及免疫学领域，尤其涉及一种构建人
单克隆抗体片段复合物的方法。
背景技术：
抗体类药物以其安全有效，特异性高的优点，已成为国际药品市场上的一大类新型的诊断和治疗剂。到目前为止，美国FDA已批准了 24个抗体药物上市，全球有超过200家公司正在研发单抗治疗药物，约有360个产品正在研发之中，全球抗体类药物市场销售额在2000年时为17亿美元，2004年达103亿美元，预计到2010年全球市场将达300亿美元。目前国内抗体药物市场尚未形成，年销售额不足亿元。 由于鼠源性抗体不仅受到人体免疫系统的排斥，而且Fc片段不能有效地激活人体效应系统，所以用人抗体取代鼠抗体是克服鼠单抗在临床应用障碍的关键，而杂交瘤技术又不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。随着基因工程技术的发展，为人源化抗体的研制提供了基础，特别是用人抗体恒区置换鼠抗体相应部位的人鼠嵌合抗体。这类抗体分子70%-90%为人源，在抗原特异性和亲和力方面都较好地保留了亲代抗体的特征，在体内的半衰期和效应功能也有所提高，但免疫源性降低了 12%左右。完全人单克隆抗体则是最理想的选择。 目前，生产人抗体的方法主要包括抗体库技术和转基因小鼠技术，但这两类技术均尚处在实验室研发阶段，不够成熟，未见实际成功报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺合理、产品
和抗原特异性结合优良的构建人单克隆抗体片段复合物的方法。 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现 —种构建人单克隆抗体片段复合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤
(1)从人全血中分离B细胞，并从人微量B细胞中用RT-PCR方法扩增人抗体重链和轻链基因片段； (2)从步骤(1)中获得的基因片段，分别克隆进表达载体pCABHCV和pCABLCV ;
(3)用pCABHCV和pCABLCV双转化大肠杆菌JM109或BL21，人抗体重链和轻链片段表达后，同时分泌于培养液上清，并形成复合物，该复合物为人单克隆抗体片段复合物。
所述的步骤(1)具体包括以下分步骤
(1)从人全血中分离B细胞及B细胞的保存
1)人全血预处理 EDTA或柠檬酸进行抗凝处理的人全血加入二倍体积的缓冲液(含有0. 1 % BSA，2mM EDTA的PBS缓冲液)离心后，去上清，在血细胞中加入等体积上述溶液混匀后，用于B细胞的分离；
2)人B细胞的分离 用包被抗CD19抗体的磁珠方法从人全血中分离人B细胞；
3)人B细胞的保存 分离得到的B细胞用冻存液(含10%胎牛血清，10%匿S0的DMEM)冻存于液氮
中，该冻存方法至少在2年内可保持细胞膜及RNA的完整； (2)集群引物来源和设计 1)搜寻y重链及a 、 k轻链的基因序列 应用生物信息学的方法从基因库获得文献已报导的所有的人抗体的y重链及入、k轻链的基因序列； 2)分拣，归类各Y重链及A 、 k轻链的基因序列 将上述搜索到的基因分类为y、 a、 k三组基因序列，在各组序列中进行一系列对比，并将相似的序列进行兼并； 3)人抗体Y重链及A 、 k轻链的集群引物设计 由于是用微量的B细胞扩增人Y重链及A 、 k轻链的基因序列，所得到的模板的量十分稀少，因此设计了nest-PCR:即通过两次PCR的方法来扩增目的y重链及A、k轻链的基因片段，为此设计了两组集群引物 a.第一次PCR引物长21bp， y重链引物为18对，A轻链引物为35对，k轻链引物为33对； b.第二次PCR引物长49bp，在第一次PCR引物的基础上，5'引物加上AscI酶切位点及信号肽序列，3'引物向上游移动了 20bp，形成巢式结构，并引入了 Notl酶切位点，这使PCR效率及稳定性大为提高，减少了 PCR反应的非特异性产物，并使所获得的人抗体的轻、重链功能性片段可直接进行克隆及表达；
(3)人B细胞中抗体相关基因的扩增
1)从10个人B细胞中获取微量mRNA 用裂解缓冲液(Xysis Buffer with Lysis Enhancer, Invitrogen公司)逐级稀释B细胞，准确地取10个B细胞，置于200微升薄壁PCR管中，并配置裂解反应体系，体系中含oligo-d(T) 20 3. 85uM及RNase OUT 3. 08U，轻柔混合后，置PCR仪中75。C保温10分钟，立即插入冰中至完全冷却； 2)用上述微量mRNA为模板进行反转录反应 上述样品离心，置于冰上，配置RT反应体系，反应体系中含5XRT缓冲液，O. 33mMdNTP，1.33U RNase OUT (Invitrogen) ， 6. 67U Super ScriptIII反转录酶(Invitrogen)，3mM DTT，用重蒸水(RNase Free TAKARA)补足体积，混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行反转录反应，条件如下5(TC 50分钟，85t: 10分钟，反应结束后4t:保持；
3)从上述cDNA产物中扩增y重链及A 、 k轻链的可变区基因片段
应用nest-PCR的方法，用两次PCR扩增出Y重链及A 、 k轻链的基因片段
a.第一次PCR反应将反转录产物(15微升)用重蒸水稀释5倍，各取PCR反应终体积(30微升)的1/5分别置于三个200微升PCR管中，用于扩增y重链及入、k轻链的基因片段；PCR反应体系中每管含0.2uM各自的3'引物，10XPCR缓冲液，Q.2mM dNTP (Invitrogen) ， 1. 5mM MgC12，0.04U Platei皿mTaq DNA Polymerase (聚合酶Invitrogen)及0. 4uM各自5，集群引物，用重蒸水补足体积; 反应条件94°C 1分钟，94°C 15秒，55 °C 30秒，72 °C 1分钟，然后共40个循环，反应结束后4°C (冰浴)保存； b.第二次PCR反应将上述产物分别置于三个200微升PCR管中，扩增Y重链及入、k轻链的目的基因序列；每管含模板(30微升反应终体积的l/5)，0.2uM各自的3'引物，IOXPCR缓冲液，O. 2mM dNTP (Invitrogen) ， 1. 5薩gC12， 0. 04U Platein咖Taq DNAPolymerase (聚合酶Invitrogen)及0. 4uM各自5，引物，用重蒸水补足体积；
反应程序94°C 1分钟，然后94°C 15秒，6(TC 30秒，72。C 1分钟共40个循环，反应结束后4t:(冰浴)保存，取部分产物用1%琼脂糖电泳检测。
所述的步骤(2)具体包括以下分步骤
(l)PCR扩增片段的AscI/Notl内切酶双切 1) RT-PCR产物——人IgG Y重链和A或k轻链基因片段中分别加入2倍体积的无水乙醇及1/10倍体积的3M醋酸钠，置于-20°C 2 3小时后，12500rpm离心10分钟，弃上清，用80%酒精洗涤一次，烘干后用25. 5微升的ddH20溶解； 2)上述体系中补3微升10XNEB缓冲液4，0. 3微升100微克/毫升牛血清白蛋白，O. 5微升Ascl及0. 5微升Notl，混匀后37"反应过夜； 3)上述酶切体系中加入2倍体积的无水乙醇及1/10倍体积的3M醋酸钠，置于-20。C 2 3小时后，12500rpm离心10分钟，弃上清，用80%酒精洗涤一次，烘干后用10微升的ddH20溶解； (2)重链载体pCABHCV及轻链载体pCABLCV的AscI/Notl内切酶双切
1)重链质粒pCABHCV载体制备 a. pCABHCV质粒转化DH-10B感受态细胞后涂布于含有30微克/毫升卡那霉素的LB琼脂培养板上，置于37t:过夜； b.挑选单克隆于5毫升含有30微克/毫升卡那霉素的液体LB培养基中，于
300rpm， 37。C摇床培养过夜，次日，收集细菌，用质粒小量快速提取试剂盒抽提质粒； c. E卯管中加入pCABHCV质粒20微升，30微升10XNEB缓冲液4， 3微升100微克
/毫升牛血清白蛋白，3微升NotI ， 3微升Ascl ，补ddH20至300微升，37°C过夜； d.上述酶切体系1X琼脂糖电泳纯化，待条带完全走散后，用手术刀割下5200bp
的片段，胶回收，电泳试剂盒回收； 2)轻链质粒pCABLCV载体制备 a. pCABLCV质粒转化DH-10B感受态细胞后涂布于含有50微克/毫升氯霉素的LB琼脂培养板上，置于37t:过夜； b.挑选单克隆于5毫升含有50微克/毫升氯霉素的液体LB培养基中，于300rpm，
37t:摇床培养过夜，次日，收集细菌，用质粒小量快速提取试剂盒抽提质粒； c. E卯管中加入20微升pCABLCV质粒，30微升10XNEB缓冲液4， 3微升100微克
/毫升牛血清白蛋白，3微升NotI ， 3微升Ascl ，补ddH20至300微升，37°C过夜； d.上述酶切体系1X琼脂糖电泳纯化，待条带完全走散后，用手术刀割下3700bp
的片段，胶回收，电泳试剂盒回收；
(3)连接
1)将人IgG y重链基因片段连接入pCABHCV表达载体E卯管中加入10微升y重链基因AscI/NotI双切片段，5微升AscI/NotI双切的pCABHCV表达载体，2微升10XT4连接酶缓冲液，1微升T4连接酶，补ddH20至20微升，16t:过夜； 2)将人IgG A或k轻链基因片段分别连接入pCABLCV表达载体将10微升A或k轻链基因AscI/Notl双切片段分别加入E卯管中，每管均加入0. 7微升AscI/Notl双切的pCABLCV表达载体，2微升10 X T4连接酶缓冲液，1微升T4连接酶，补ddH20至20微升，16。C过夜。 所述的步骤(3)具体包括以下分步骤
(1)双转化 将上述连接产物合并，在无菌柜中加入100微升JM109或BL21感受态细胞，置于冰上30分钟后于42t:热激30秒，在无菌柜中加入500微升37。C预热的S0C培养液，置于200rpm，37t:摇床上复苏2小时后，3000rpm离心3分钟，在无菌柜中弃去部分上清，余下的细胞轻柔混匀后均匀地涂布于含有30毫克/毫升卡那霉素及50毫克/毫升氯霉素的TB固体培养基上，静置于37t:培养48小时，每次获得数十至数百个克隆；
(2)表达 每个克隆经分别用3毫升TB培养液37t:摇床培育1. 5小时后，分别加入3微升浓度为0. 1M的IPTG， 2小时后人单克隆抗体重链和轻链表达后，同时分泌于培养液上清，并形成复合物。 所述的pCABHCV和pCABLCV载体的构建如下pCABHCV由原始质粒pBK-CMV构建，在该质粒多酶切位点内的Ecoll和Notl先克隆进带有Ascl酶切位点的肿瘤坏死因子基因，再在Notl和Kpnl酶切位点克隆进内酰胺酶基因；pCABLCV质粒由pBK-CMV质粒作为模板，由PCR方法获得带有Xhol和Pstl酶切位点，并含有pCMV和带有Ascl酶切位点的肿瘤坏死因子基因的片段共为2577bp，另以pACYC质粒作为模板，用带有Xhol和Pstl酶切位点的引物扩增含有CatE基因和pl5A片段，共1948bp，再将此两片段连接构成。
所述的3M醋酸钠的pH为5. 2，所述的DH-10B感受态细胞为Invitrogen公司产品，所述的质粒小量快速提取试剂盒包括QIAGEN公司的QIApr印SpinMinipr印Kit，所述的电泳试剂盒包括QIAGEN公司的QIAquick Gel Extraction Kit，所述的Ascl 、Notl和T4连接酶为NEB公司产品。 所述的E卯管中加入的pCABHCV质粒的含量为300纳克/微升，pCABLCV质粒的含量为300纳克/微升，y重链基因AscI/NotI双切片段的含量为30纳克/微升，Ascl/Notl双切的pCABHCV表达载体的含量为15纳克/微升，A或k轻链基因AscI/NotI双切片段的含量为10纳克/微升，AscI/Notl双切的pCABLCV表达载体的含量为83纳克/微升。 所述的JM109或BL21感受态细胞为Invitrogen公司产品。 所述的原始质粒pBK-CMV为Invitrogen公司产品，pACYC质粒为Fermentas公司
A 口 人IgG Y重链基因、A (或k )轻链抗体基因的表达及抗体对抗原——人肺癌细胞A549专一性结合的测定如下 1)包被抗原测定前两天分别将状态良好的抗体结合靶细胞——人肺腺癌细胞A549及作为对照细胞的Hela从细胞培养瓶中转入96孔板中，密度为每孔1 X 104 2 X 104个细胞，每孔中加200微升含10%胎牛血清的DMEM，在5% C02， 37°C的培养条件下培养48小时。 2)测定前一天，人IgG Y重链基因、A (或k )轻链抗体基因的表达在96孔板中加入108微升含有50微克/毫升羧苄青霉素及50微克/毫升氯霉素的TB培养液，挑入上述转化入人IgGY重链基因、A (或k)轻链抗体基因的JM109或BL21单克隆，混匀，37t:静置培养6小时后每孔加入12微升含有1毫摩/升IPTG的TB培养液，混匀后于37t:静置培养过夜。由于pCABHCV和pCABLCV均含有分泌信号肽，因此表达产物在培养过程中分泌于细菌培养液，抗体轻、重链片段形成人IgG单克隆抗体的复合物。 3)人IgGY重链基因、A (或k )轻链基因的表达抗体片段复合物对A549及Hela结合的测定将长有A549及Hela细胞的96孔板中的培液吸尽，用含有0. 1%牛血清白蛋白及0. 901毫摩/升钙离子及0. 493毫摩/升镁离子的磷酸缓冲液洗两次后加入100微升细菌上清培液，静置于37t:中孵育30分钟。而后，用上述磷酸缓冲液洗涤三次，每孔加入100微升含有0. 1%牛血清白蛋白及0. 2微摩CCF2(报告基因内酰胺酶的底物)的磷酸缓冲液，置于荧光读板机上(BIO-TEK Flx800)，测定在波长为409纳米的激发光激发下的发射光，其波长分别为447纳米及520纳米。447纳米为CCF2经内酰胺酶酶解后产物的荧光发射光，520纳米为CCF2底物本身的发射荧光，因此，447纳米和520纳米的读数比值，扣除本底后，并参照阴性对照和对照细胞的读数比值即为结合于肺癌细胞A549的所表达人单克隆抗体的表达量和专一性。 4)本实验中用鼠抗表皮生长因子受体1400bp重链片段和人k轻链300bp片段双转化JM109作为负对照，由于1400bp重链片段表达产物为包涵体无法分泌在培液中，而轻链300bp无起始编码片段，所以也无产物分泌于培液中。 与现有技术相比，本发明构建人单克隆抗体片段复合物的方法工艺先进独特，操作简单，制得的人单克隆抗体片段复合物和抗原特异性结合优良、专一性强，使用安全，有应用于人癌症或传染性疾病的检测和治疗的可能性。
图1为本发明实施例1中部分克隆表达产物在3小时时与A549的结合示意图，横坐标为部分克隆的编号； 图2为本发明实施例1中克隆H1-12和对照对A549的结合测定示意图。
具体实施例方式
下面对照附图及具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 —种构建人单克隆抗体片段复合物的方法，该方法包括以下步骤
—、从人全血中分离B细胞计某，男，62岁，肺腺癌早期，手术切除肿瘤后化疗1个疗程，病程近2年，目前健康状况良好。在征得本人同意后，我们从该人3毫升血液中分离得到6X 104个B细胞。从中取微量B细胞中扩增人抗体重链和轻链基因片段，其方法已申请专利(申请号200710171282. l)，具体如下
(1)从人全血中分离B细胞及B细胞的保存
1)人全血预处理 EDTA或柠檬酸进行抗凝处理的人全血加入二倍体积的缓冲液(含有0. 1 % BSA， 2mM EDTA的PBS缓冲液)离心后，去上清，在血细胞中加入等体积上述溶液混匀后，用于B 细胞的分离； 2)人B细胞的分离 用包被抗CD19抗体的磁珠方法从人全血中分离人B细胞；
3)人B细胞的保存 分离得到的B细胞用冻存液(含10%胎牛血清，10%匿S0的DMEM)冻存于液氮
中，该冻存方法至少在2年内可保持细胞膜及RNA的完整； (2)集群引物来源和设计 1)搜寻y重链及a 、 k轻链的基因序列 应用生物信息学的方法从基因库获得文献已报导的所有的人抗体的y重链及 入、k轻链的基因序列； 2)分拣，归类各y重链及a 、 k轻链的基因序列 将上述搜索到的基因分类为y、 a、 k三组基因序列，在各组序列中进行一系列 对比，并将相似的序列进行兼并； 3)人抗体y重链及a 、 k轻链的集群引物设计 由于是用微量的B细胞扩增人Y重链及A 、 k轻链的基因序列，所得到的模板的 量十分稀少，因此设计了nest-PCR:即通过两次PCR的方法来扩增目的y重链及A、k轻 链的基因片段，为此设计了两组集群引物 a.第一次PCR引物长21bp， y重链引物为18对，A轻链引物为35对，k轻链 引物为33对； b.第二次PCR引物长49bp，在第一次PCR引物的基础上，5'引物加上AscI酶切 位点及信号肽序列，3'引物向上游移动了 20bp，形成巢式结构，并引入了 Notl酶切位点，这 使PCR效率及稳定性大为提高，减少了 PCR反应的非特异性产物，并使所获得的人抗体的 轻、重链功能性片段可直接进行克隆及表达；
(3)人B细胞中抗体相关基因的扩增
1)从10个人B细胞中获取微量mRNA 用裂解缓冲液(Xysis Buffer with Lysis Enhancer, Invitrogen公司)逐级稀 释B细胞，准确地取10个B细胞，置于200微升薄壁PCR管中，并配置裂解反应体系，体系中 含oligo-d(T)20 3. 85uM及RNase OUT 3. 08U，轻柔混合后，置PCR仪中75。C保温10分钟， 立即插入冰中至完全冷却； 2)用上述微量mRNA为模板进行反转录反应 上述样品离心，置于冰上，配置RT反应体系，反应体系中含5XRT缓冲液，O. 33mM dNTP，1.33U RNase OUT (Invitrogen) ， 6. 67U Super ScriptIII反转录酶(Invitrogen)， 3mM DTT，用重蒸水(RNase Free TAKARA)补足体积，混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行反 转录反应，条件如下5(TC 50分钟，85t: 10分钟，反应结 后4t:保持；
3)从上述cDNA产物中扩增y重链及A 、 k轻链的可变区基因片段
应用nest-PCR的方法，用两次PCR扩增出Y重链及A 、 k轻链的基因片段
a.第一次PCR反应将反转录产物(15微升)用重蒸水稀释5倍，各取PCR反 应终体积(30微升)的1/5分别置于三个200微升PCR管中，用于扩增Y重链及入、 k轻链的基因片段；PCR反应体系中每管含0.2uM各自的3'引物，IOXPCR缓冲液， 0.2mM dNTP(Invitrogen) ， 1. 5mM MgC12，0.04U Platei皿mTaq DNA Polymerase (聚合酶 Invitrogen)及0. 4uM各自5，集群引物，用重蒸水补足体积; 反应条件94°C 1分钟，94t: 15秒，55。C 30秒，72。C 1分钟，然后共40个循环，反 应结束后4°C (冰浴)保存； b.第二次PCR反应将上述产物分别置于三个200微升PCR管中，扩增Y重链及 入、k轻链的目的基因序列；每管含模板(30微升反应终体积的l/5)，0.2uM各自的3' 引物，IOXPCR缓冲液，O. 2mM dNTP (Invitrogen) ， 1. 5薩gC12， 0. 04U Platein咖Taq DNA Polymerase (聚合酶Invitrogen)及0. 4uM各自5，引物，用重蒸水补足体积；
反应程序94°C 1分钟，然后94°C 15秒，6(TC 30秒，72。C 1分钟共40个循环，反 应结束后4t:(冰浴)保存，取部分产物用1%琼脂糖电泳检测。 二、从上述专利发明中用RT-PCR方法中获得的人抗体的轻，重链的功能性片段， 分别克隆进表达载体pCABHCV和pCABLCV(pCABHCV和pCABLCV载体的构建如下pCABHCV 由原始质粒pBK-CMV构建，在该质粒多酶切位点内的Ecoll和Notl先克隆进带有Ascl酶 切位点的肿瘤坏死因子基因，再在Notl和Kpnl酶切位点克隆进内酰胺酶基因；pCABLCV质 粒由pBK-CMV质粒作为模板，由PCR方法获得带有Xhol和Pstl酶切位点，并含有pCMV和 带有AscI酶切位点的肿瘤坏死因子基因的片段共为2577bp，另以pACYC质粒(Fermentas 公司)作为模板，用带有Xhol和Pstl酶切位点的引物扩增含有CatK基因和pl5A片段，共 1948bp，再将此两片段连接构成。
1. PCR扩增片段AscI/Notl内切酶双切 1) RT-PCR产物——人IgG Y重链和A k轻链基因片段中分别加入2倍体积的无
水乙醇及1/10倍体积的3M醋酸钠(pH5. 2)，置于-2(TC 2 3小时后，12500rpm离心10分
钟，弃上清，用80%酒精洗涤一次，烘干后用25. 5微升的ddH20溶解。 2)上述体系中补3微升10XNEB缓冲液4，0. 3微升100微克/毫升牛血清白蛋
白，0. 5微升Ascl (NEB)及0. 5微升Notl (NEB)，混匀后37。C反应过夜。 3)上述酶切体系中加入2倍体积的无水乙醇及1/10倍体积的3M醋酸钠(pH5. 2)，
置于-20。C 2 3小时后，12500rpm离心10分钟，弃上清，用80%酒精洗涤一次，烘干后用
IO微升的ddH20溶解。 2.重链载体(pCABHCV)及轻链载体(pCABLCV)AscI/Notl双切
1)重链质粒(pCABHCV)载体制备 a.pCABHCV质粒转化DH-10B感受态细胞(Invitrogen)后涂布于含有30微克/毫 升卡那霉素的LB琼脂培养板上，置于37t:过夜。 b.挑选单克隆于5毫升含有30微克/毫升卡那霉素的液体LB培养基中，于 300rpm，37t:摇床培养过夜。次日，收集细菌，用质粒小量快速提取试剂盒(QIApr印Spin Minipr印Kit，QIAGEN)按说明书要求抽提质粒。 c.E卯管中加入pCABHCV质粒20微升(约300纳克/微升)，30微升10XNEB缓
12冲液4， 3微升100微克/毫升牛血清白蛋白，3微升Notl (NEB) ， 3微升AscI (NEB)，补ddH20 至300微升，37t:过夜。 d.上述酶切体系1%琼脂糖电泳纯化，待条带完全走散后，用手术刀割下5200bp 的片段，胶回收试剂盒回收(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen)。 [Cms] 2)轻链质粒(pCABLCV)载体制备 a. pCABLCV质粒转化DH-10B感受态细胞(Invitrogen)后涂布于含有50微克/毫 升氯霉素的LB琼脂培养板上，置于37t:过夜。 b.挑选单克隆于5毫升含有50微克/毫升氯霉素的液体LB培养基中，于300rpm， 37t:摇床培养过夜。次日，收集细菌，用质粒小量快速提取试剂盒(QIApr印Spin Minipr印 Kit， QIAGEN)按说明书要求抽提质粒。 c. E卯管中加入20微升pCABLCV质粒(约300纳克/微升)，30微升10 XNEB缓 冲液4， 3微升100微克/毫升牛血清白蛋白，3微升Notl (NEB) ， 3微升AscI (NEB)，补ddH20 至300微升，37t:过夜。 d.上述酶切体系1%琼脂糖电泳纯化，待条带完全走散后，用手术刀割下3700bp 的片段，胶回收试剂盒回收(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen)。
3.连接 1)将人IgG Y重链基因片段连接入pCABHCV表达载体E卯管中加入10微升Y 重链基因AscI/NotI双切片段(约30纳克/微升)，5微升AscI/NotI双切的pCABHCV表达 载体(约15纳克/微升)，2微升10 X T4连接酶缓冲液，1微升T4连接酶(NEB)，补ddH20 至20微升，16。C过夜。 2)将人IgG A或k轻链基因片段分别连接入pCABLCV表达载体将10微升入 或k轻链基因AscI/Notl双切片段(约10纳克/微升)分别加入印p管中，每管均加入 0. 7微升AscI/NotI双切的pCABLCV表达载体(约83纳克/微升)，2微升10XT4连接酶 缓冲液，1微升T4连接酶(NEB)，补ddH20至20微升，16。C过夜。 三、用pCABHCV和pCABLCV双转化大肠杆菌JM109，人抗体重链或轻链表达后，分泌 于培养液上清。应用实例确定本发明的技术路线能获得人单克隆抗体，具有和人肺癌细胞 抗原具有特异性的结合作用。
1.双转化 将上述连接产物合并，在无菌柜中加入IOO微升JM109或BL21感受态细胞 (Invitrogen)，置于冰上30分钟后于42。C热激30秒。在无菌柜中加入500微升37。C预热 的SOC培养液，置于200rpm，37t:摇床上复苏2小时后，3000rpm离心3分钟，在无菌柜中弃 去部分上清，余下的细胞轻柔混匀后均匀地涂布于含有30毫克/毫升卡那霉素及50毫克 /毫升氯霉素的TB固体培养基上，静置于37t:培养48小时。
2.表达 每个克隆经分别用3毫升TB培养液37t:摇床培育1. 5小时后，分别加3微升浓度 为0. 1M的IPTG， 2小时后人单克隆抗体重链和轻链表达后，同时分泌于培养液上清，并形成 复合物。 3.人IgGY重链基因、A轻链抗体基因的表达及抗体对抗原专一性结合的测定
1)包被抗原测定前两天分别将状态良好的抗体结合靶细胞A549及对照细胞
13Hela从细胞培养瓶中转入96孔板中，密度为每孔1 X 104 2 X 104个细胞，每孔中加200微 升含10%胎牛血清的DMEM，在5% (A，37。C的培养条件下培养48小时。
2)测定前一天，人IgGY重链基因、A轻链抗体基因的表达在96孔板中加入108 微升含有50微克/毫升羧苄青霉素及50微克/毫升氯霉素的TB培养液，挑入上述转化入 人IgGY重链基因、A轻链抗体基因的JM109或BL21单克隆，混匀，37t:静置培养6小时 后每孔加入12微升含有1毫摩/升IPTG的TB培养液，混匀后于37t:静置培养过夜。由于 pCABHCV和pCABLCV均含有分泌信号肽，因此表达产物在培养过程中分泌于细菌培养液，抗 体轻、重链片段形成人IgG单克隆抗体的部分结构。 3)人IgG Y重链基因、A轻链基因的表达抗体对A549及Hela结合的测定将长 有A549及Hela细胞的96孔板中的培液吸尽，用含有0. 1%牛血清白蛋白及0. 901毫摩/ 升钙离子及0. 493毫摩/升镁离子的磷酸缓冲液洗两次后加入100微升细菌上清培液，静 置于37°C中孵育30分钟。而后，用上述磷酸缓冲液洗涤三次，每孔加入100微升含有0. 1 % 牛血清白蛋白及0. 2微摩CCF2(报告基因内酰胺酶的底物)的磷酸缓冲液，置于荧光读板 机上，测定在波长为409纳米的激发光激发下的发射光，其波长分别为447纳米及520纳 米。447纳米为CCF2经内酰胺酶酶解后产物的荧光发射光，520纳米为CCF2底物本身的发 射荧光，因此，447纳米和520纳米的读数比值，并参照阴性对照和对照细胞的读数比值即 为结合于肺癌细胞A549的所表达人单克隆抗体的表达量和专一性。 用本实施例方法得到的Y重链基因、A轻链基因表达的人单克隆抗体片段复合 物专一性结合A549测定结果如图1、图2所示。
权利要求
一种构建人单克隆抗体片段复合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)从人全血中分离B细胞，并从人微量B细胞中用RT-PCR方法扩增人抗体重链和轻链基因片段；(2)从步骤(1)中获得的基因片段，分别克隆进表达载体pCABHCV和pCABLCV；(3)用pCABHCV和pCABLCV双转化大肠杆菌JM109或BL21，人抗体重链和轻链片段表达后，同时分泌于培养液上清，并形成复合物，该复合物为人单克隆抗体片段复合物。
2. 根据权利要求1所述的构建人单克隆抗体片段复合物的方法，其特征在于，所述的 步骤(1)具体包括以下分步骤(1) 从人全血中分离B细胞及B细胞的保存1) 人全血预处理EDTA或柠檬酸进行抗凝处理的人全血加入二倍体积的缓冲液(含有0. 1 % BSA， 2mM EDTA的PBS缓冲液)离心后，去上清，在血细胞中加入等体积上述溶液混匀后，用于B细胞的分离；2) 人B细胞的分离用包被抗CD19抗体的磁珠方法从人全血中分离人B细胞；3) 人B细胞的保存分离得到的B细胞用冻存液(含10%胎牛血清，10%匿S0的DMEM)冻存于液氮中，该 冻存方法至少在2年内可保持细胞膜及RNA的完整；(2) 集群引物来源和设计1) 搜寻y重链及a 、 k轻链的基因序列应用生物信息学的方法从基因库获得文献已报导的所有的人抗体的y重链及a、 k 轻链的基因序列；2) 分拣，归类各y重链及a 、 k轻链的基因序列将上述搜索到的基因分类为y、 a、 k三组基因序列，在各组序列中进行一系列对比， 并将相似的序列进行兼并；3) 人抗体y重链及a 、 k轻链的集群引物设计由于是用微量的B细胞扩增人y重链及a 、 k轻链的基因序列，所得到的模板的量十 分稀少，因此设计了nest-PCR:即通过两次PCR的方法来扩增目的y重链及A、k轻链的基因片段，为此设计了两组集群引物a. 第一次pcr引物长21bp， y重链引物为18对，a轻链引物为35对，k轻链引物 为33对；b. 第二次PCR引物长49bp，在第一次PCR引物的基础上，5'引物加上Ascl酶切位点 及信号肽序列，3'引物向上游移动了 20bp，形成巢式结构，并引入了Notl酶切位点，这使 PCR效率及稳定性大为提高，减少了 PCR反应的非特异性产物，并使所获得的人抗体的轻、 重链功能性片段可直接进行克隆及表达；(3) 人B细胞中抗体相关基因的扩增 1)从10个人B细胞中获取微量mRNA用裂解缓冲液(Lysis Buffer with Lysis Enhancer, Invitrogen公司)逐级稀释B 细胞，准确地取10个B细胞，置于200微升薄壁PCR管中，并配置裂解反应体系，体系中含oligo-d(T)203. 85uM及RNase OUT 3. 08U，轻柔混合后，置PCR仪中75。C保温IO分钟，立即 插入冰中至完全冷却；2) 用上述微量mRNA为模板进行反转录反应上述样品离心，置于冰上，配置RT反应体系，反应体系中含5XRT缓冲液，O. 33mM dNTP，1.33U RNase OUT(Invitrogen) ，6. 67U Super ScriptIII反转录酶(Invitrogen)， 3mM DTT，用重蒸水(RNase Free TAKARA)补足体积，混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行反 转录反应，条件如下5(TC 50分钟，85t: 10分钟，反应结束后4t:保持；3) 从上述cDNA产物中扩增y重链及A 、 k轻链的可变区基因片段应用nest-PCR的方法，用两次PCR扩增出y重链及A 、 k轻链的基因片段a. 第一次PCR反应将反转录产物(15微升)用重蒸水稀释5倍，各取PCR反应 终体积(30微升)的1/5分别置于三个200微升PCR管中，用于扩增y重链及入、 k轻链的基因片段；PCR反应体系中每管含0.2uM各自的3'引物，10XPCR缓冲液， 0.2mM dNTP (Invitrogen) ， 1. 5mM MgC12，0.04U Platei皿mTaq DNA Polymerase (聚合酶 Invitrogen)及0. 4uM各自5，集群引物，用重蒸水补足体积;反应条件94°C 1分钟，94t: 15秒，55t: 30秒，72。C 1分钟，然后共40个循环，反应结 束后4°C (冰浴)保存；b. 第二次PCR反应将上述产物分别置于三个200微升PCR管中，扩增y重链及入、 k轻链的目的基因序列；每管含模板(30微升反应终体积的1/5) ，0. 2uM各自的3'引 物，10 X PCR缓冲液，O. 2mM dNTP (Invitrogen) ， 1. 5薩gC12，0. 04U Platei皿m Taq DNA Polymerase (聚合酶Invitrogen)及0. 4uM各自5，引物，用重蒸水补足体积;反应程序94°C 1分钟，然后94°C 15秒，6(TC 30秒，72。C 1分钟共40个循环，反应结 束后4t:(冰浴)保存，取部分产物用1%琼脂糖电泳检测。
3.根据权利要求1所述的构建人单克隆抗体片段复合物的方法，其特征在于，所述的 步骤(2)具体包括以下分步骤(1) PCR扩增片段的AscI/Notl内切酶双切1) RT-PCR产物——人IgGY重链和A或k轻链基因片段中分别加入2倍体积的无 水乙醇及1/10倍体积的3M醋酸钠，置于_20°C 2 3小时后，12500rpm离心10分钟，弃上 清，用80%酒精洗涤一次，烘干后用25. 5微升的ddH20溶解；2) 上述体系中补3微升10 X NEB缓冲液4， 0. 3微升100微克/毫升牛血清白蛋白，0. 5 微升Ascl及0. 5微升Notl，混匀后37t:反应过夜；3) 上述酶切体系中加入2倍体积的无水乙醇及1/10倍体积的3M醋酸钠，置 于-20。C 2 3小时后，12500rpm离心10分钟，弃上清，用80X酒精洗涤一次，烘干后用10 微升的ddH20溶解；(2) 重链载体pCABHCV及轻链载体pCABLCV的AscI/Notl内切酶双切 1)重链质粒pCABHCV载体制备a. pCABHCV质粒转化DH-10B感受态细胞后涂布于含有30微克/毫升卡那霉素的LB琼 脂培养板上，置于37t:过夜；b. 挑选单克隆于5毫升含有30微克/毫升卡那霉素的液体LB培养基中，于300rpm， 37t:摇床培养过夜，次日，收集细菌，用质粒小量快速提取试剂盒抽提质粒；c. E卯管中加入pCABHCV质粒20微升，30微升10 XNEB缓冲液4， 3微升100微克/毫升牛血清白蛋白，3微升Not I ， 3微升Ascl ，补ddH20至300微升，37 °C过夜；d. 上述酶切体系1^琼脂糖电泳纯化，待条带完全走散后，用手术刀割下5200bp的片段，胶回收，电泳试剂盒回收；2)轻链质粒pCABLCV载体制备a. pCABLCV质粒转化DH-10B感受态细胞后涂布于含有50微克/毫升氯霉素的LB琼脂培养板上，置于37t:过夜；b. 挑选单克隆于5毫升含有50微克/毫升氯霉素的液体LB培养基中，于300rpm， 37°C摇床培养过夜，次日，收集细菌，用质粒小量快速提取试剂盒抽提质粒；c. E卯管中加入20微升pCABLCV质粒，30微升10 XNEB缓冲液4， 3微升100微克/毫升牛血清白蛋白，3微升Not I ， 3微升Ascl ，补ddH20至300微升，37 °C过夜；d. 上述酶切体系1^琼脂糖电泳纯化，待条带完全走散后，用手术刀割下3700bp的片段，胶回收，电泳试剂盒回收；(3)连接1) 将人IgG y重链基因片段连接入pCABHCV表达载体E卯管中加入10微升y重链基因AscI/NotI双切片段，5微升AscI/NotI双切的pCABHCV表达载体，2微升10 X T4连接酶缓冲液，1微升T4连接酶，补ddH20至20微升，16t:过夜；2) 将人IgGA或k轻链基因片段分别连接入pCABLCV表达载体将10微升A或k轻链基因AscI/NotI双切片段分别加入E卯管中，每管均加入0. 7微升AscI/NotI双切的pCABLCV表达载体，2微升10 X T4连接酶缓冲液，1微升T4连接酶，补ddH20至20微升，16°C过夜。
4. 根据权利要求1所述的构建人单克隆抗体片段复合物的方法，其特征在于，所述的步骤(3)具体包括以下分步骤(1) 双转化将上述连接产物合并，在无菌柜中加入100微升JM109或BL21感受态细胞，置于冰上30分钟后于42t:热激30秒，在无菌柜中加入500微升37。C预热的SOC培养液，置于200rpm，37t:摇床上复苏2小时后，3000rpm离心3分钟，在无菌柜中弃去部分上清，余下的细胞轻柔混匀后均匀地涂布于含有30毫克/毫升卡那霉素及50毫克/毫升氯霉素的TB固体培养基上，静置于37t:培养48小时，每次获得数十至数百个克隆；(2) 表达每个克隆经分别用3毫升TB培养液37t:摇床培育1. 5小时后，分别加入3微升浓度为0. 1M的IPTG，2小时后人单克隆抗体重链和轻链表达后，同时分泌于培养液上清，并形成复合物。
5. 根据权利要求1或3所述的构建人单克隆抗体片段复合物的方法，其特征在于，所述的pCABHCV和pCABLCV载体的构建如下pCABHCV由原始质粒pBK-CMV构建，在该质粒多酶切位点内的Ecoll和Notl先克隆进带有Ascl酶切位点的肿瘤坏死因子基因，再在Notl和Kpnl酶切位点克隆进内酰胺酶基因；pCABLCV质粒由pBK-CMV质粒作为模板，由PCR方法获得带有Xhol和Pstl酶切位点，并含有pCMV和带有Ascl酶切位点的肿瘤坏死因子基因的片段共为2577bp，另以pACYC质粒作为模板，用带有Xhol和Pstl酶切位点的引物扩增含有CatK基因和pl5A片段，共1948bp，再将此两片段连接构成。
6. 根据权利要求3所述的构建人单克隆抗体片段复合物的方法，其特征在于，所述的3M醋酸钠的pH为5. 2，所述的DH-10B感受态细胞为Invitrogen公司产品，所述的质粒小量快速提取试剂盒包括QIAGEN公司的QIApr印Spin Minipr印Kit，所述的电泳试剂盒包括QIAGEN公司的QIAquick Gel Extraction Kit，所述的AscI、Notl和T4连接酶为NEB公司产品。
7. 根据权利要求3所述的构建人单克隆抗体片段复合物的方法，其特征在于，所述的E卯管中加入的pCABHCV质粒的含量为300纳克/微升，pCABLCV质粒的含量为300纳克/微升，Y重链基因AscI/Notl双切片段的含量为30纳克/微升，AscI/Notl双切的pCABHCV表达载体的含量为15纳克/微升，A或k轻链基因AscI/Notl双切片段的含量为10纳克/微升，AscI/Notl双切的pCABLCV表达载体的含量为83纳克/微升。
8. 根据权利要求4所述的构建人单克隆抗体片段复合物的方法，其特征在于，所述的JM109或BL21感受态细胞为Invitrogen公司产品。
9. 根据权利要求5所述的构建人单克隆抗体片段复合物的方法，其特征在于，所述的原始质粒pBK-CMV为Invitrogen公司产品，pACYC质粒为Fermentas公司产品。
全文摘要
本发明涉及一种构建人单克隆抗体片段复合物的方法，包括(1)从人全血中分离B细胞，并从人微量B细胞中扩增人抗体重链和轻链基因片段；(2)从步骤(1)中获得的基因片段用RT-PCR方法获得人抗体的轻链和重链功能性片段，分别克隆进表达载体pCABHCV和pCABLCV；(3)用pCABHCV和pCABLCV双转化大肠杆菌JM109或BL21，人抗体重链或轻链片段表达后，同时分泌于培养液上清，并形成人单克隆抗体片段复合物。与现有技术相比，本发明构建人单克隆抗体片段复合物的方法工艺先进独特，操作简单，制得的人单克隆抗体片段复合物和抗原特异性结合优良、专一性强，使用安全，有应用于人癌症或传染性疾病的检测和治疗的可能性。
文档编号C12N15/70GK101748130SQ20081020469
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月16日 优先权日2008年12月16日
发明者吴建华, 吴鸿菲, 姚亚媄, 张奉武, 张祖传, 沈菊英, 龚祖埙 申请人:上海凯勃生物技术有限公司