苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物及其制备方法和应用。

背景技术

铂类药物在临床抗瘤药物中一直占据着重要的地位，其对诸如膀胱癌、结肠癌以及非小细胞肺癌等许多恶性实体瘤有显著疗效[kellandl.theresurgenceofplatinum-basedcancerchemotherapy[j].naturereviewscancer,2007,7(8):573-584；frickersp.metalbaseddrugs:fromserendipitytodesign[j].daltontransactions,2007(43):4903-4917.]，故新型高效低毒的铂类抗肿瘤药物的研发是当前的研究热点。

据报道，铂类药物的作用机制主要是和鸟苷酸残基的n7结合形成dna中1,2-和1,3-的链内交联，从而导致dna双链的弯曲，这样的结构被其他结合dna的生物分子识别后，阻止了dna的复制造成了dna损伤[ramachandrans,templeb,alexandrovaan,etal.recognitionofplatinum–dnaadductsbyhmgb1a[j].biochemistry,2012,51(38):7608-7617.]。同样有报道说明癌细胞加强对dna损伤的修复和容忍是癌细胞对抗铂类药物耐药性的重要方面之一[martinlp,hamiltontc,schilderrj.platinumresistance:theroleofdnarepairpathways[j].clinicalcancerresearch,2008,14(5):1291-1295.]。申请人通过改变铂类药物使其与dna有不同的作用方式从而期望研发出高效低毒的新型铂类抗肿瘤配合物。

萘酰亚胺类化合物是一类经典的小分子dna嵌入剂，其代表化合物氨萘非特(amonafide)和米托萘胺(mitonafide)对多株癌细胞都有很高的抗癌活性。但目前尚未见有苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物的制备方法及其对细胞毒性的相关报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖且对肿瘤细胞毒性高的苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物，以及它的制备方法和应用。

本发明涉及下述式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐：

本发明还提供上述化合物的制备方法，主要包括以下步骤：取下述式(ii)所示化合物和式(iii)所示化合物在有机溶剂中，于加热或不加热条件下进行配位反应，即得目标产物；

上述制备方法中，所述式(ii)所示化合物为苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺，该化合物可参考现有文献(yarnellje,torrepdl,castellanofn,efficientphosphorescencefromnaphthalenebenzimidizole-coordinatediridium(iii)chromophores[j],eur.j.inorg.chem.,2017,5238–5245)进行合成，也可自行设计合成路线进行合成。优选采用下述方法进行合成：

按化学计量比取1,8-萘酐和邻苯二胺在极性溶剂(选自乙酸、二甲苯、甲苯、dmf、dmso和乙二醇甲醚中的一种或两种以上的组合)中回流反应(约4-8h)，冷却，过滤，即得到苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺(黄色晶体)，具体的合成路线如下所示：

上述制备方法中，所述式(iii)所示化合物为顺式二氯·二(二甲基亚砜)合铂(ii)，可参考现有文献(al-allaftak,etal.transit.met.chem.，1998)进行制备。

上述制备方法中，所述式(ii)所示化合物和式(iii)所示化合物的摩尔比为化学计量比，在实际的操作中，式(ii)所示化合物或式(iii)所示化合物也可相对过量，但过量会造成所得产物不纯。

上述制备方法中，所述的有机溶剂可以是选自甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜(dmso)和n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中的一种或两种以上的组合。当有机溶剂的选择为上述选择中两种以上的混合物时，它们之间的配比可为任意配比。所述有机溶剂的用量可根据需要确定。在具体的溶解步骤中，可将式(ii)所示化合物和式(iii)所示化合物分别用有机溶剂溶解，再混合在一起反应；也可将式(ii)所示化合物和式(iii)所示化合物混合后再用有机溶剂溶解。

本发明所述的苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物在具体制备时，可采用溶液法或溶剂热法进行制备。

当采用溶液法制备时，主要包括：取式(ii)所示化合物和式(iii)所示化合物溶解于有机溶剂中，于加热或不加热条件下进行配位反应，反应结束后趁热过滤，滤液冷却，有固体析出，收集固体，即为目标产物。

上述溶液法中，可以通过薄层层析跟踪检测反应是否完全。为了提高反应的产率，反应优选是在加热条件下进行，进一步优选在≥40℃的条件下进行，更优选在60-80℃条件下进行，当反应在此优选温度范围内进行时，反应的时间通常为24-48h。该方法中，1mmol的式(ii)所示化合物和1mmol的式(iii)所示化合物通常用5-20ml或更多的有机溶剂来溶解。

当采用溶剂热法制备时，主要包括：取式(ii)所示化合物和式(iii)所示化合物溶解于有机溶剂中，然后置于容器(通常为一端开口的厚壁玻璃管或耐压瓶)中，经液氮冷冻后抽至真空、熔封后于加热条件下进行配位反应，冷却，有固体析出，收集固体，即为目标产物。该方法中，反应优选是在≥40℃的条件下进行，更优选在60-80℃条件下进行，当反应在此优选温度范围内进行时，反应的时间通常为24-48h。采用此方法时，1mmol的式(ii)所示化合物和1mmol的式(iii)所示化合物通常用5-20ml的有机溶剂来溶解。

上述溶剂热法析出的目标产物为晶体，而溶液法析出的产物通常为粉末状，所得粉末状目标产物可进一步采用溶剂结晶的方法来获得晶体，具体为：将粉末状目标产物置于甲醇和乙醇中的一种与氯仿和二氯甲烷中的一种组成的混合溶剂中，在60-80℃条件下反应24-48h，冷却后即可得到晶体状的目标产物。

本发明还包括上述苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明进一步包括一种药物组合物，它含有治疗上有效剂量的上述苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物或其药学上可接受的盐。

与现有技术相比，本发明提供了一种结构新颖的苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物，其制备周期短，产率高，质量稳定；申请人的试验结果表明，该配合物对某些细胞株的抑制活性大大高于其母核(如人宫颈癌细胞hela，活性与顺铂相当)和顺铂(如人肝癌细胞smmc-7721、人神经胶质瘤细胞株u251)，同时其对正常细胞的毒性远远低于常用抗癌药物(如顺铂和5-氟尿嘧啶)，有望用于抗肿瘤药物的制备。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的最终产物的晶体结构图；

图2为不同浓度的化合物i与topoi作用琼脂糖凝胶电泳图；

图3为加入不同浓度化合物i后smmc-7721细胞拓扑异构酶i表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

以下各实施例中涉及的式(ii)所示化合物(即苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺)按以下方法制备得到：

取1,8-萘酐(5g，25.2mmol，1.0equiv)、邻苯二胺(2.73g，25.2mmol，1.0equiv)置于100ml圆底烧瓶中，加入50ml乙酸完全溶解后，反应加热至118℃搅拌回流7h。停止反应，自然冷却至室温，有黄色固体析出，过滤，得到式(ii)所示化合物(黄色粉末状固体)6g，产率88.17％。¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.70(ddd,j＝18.9,7.3,1.1hz,2h),8.51(dd,j＝8.2,1.0hz,1h),8.46–8.40(m,1h),8.39–8.34(m,1h),7.98–7.84(m,3h),7.53–7.46(m,2h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ160.74,149.61,143.91,136.08,132.68,132.41,132.00,131.74,128.00,127.70,127.19,126.98,126.01,125.56,123.23,120.62,120.27,115.76.msm/z:271.08[m+h]⁺。

实施例1

量取苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.3702mmol)、二氯二(二甲亚砜)合铂(ii)(pt(dmso)2cl2)(155.82mg，0.3702mmol)、5ml甲醇和5ml氯仿，置于圆底烧瓶中，在温度为60℃下、搅拌反应48h，反应结束后趁热过滤除去未反应原料，滤液冷却至室温，有黄色固体析出，收集固体，干燥，得到黄色粉末状产物170mg，产率75.15％。

对本实施所得产物进行质谱、元素分析和x-单晶衍射分析等表征，具体如下：

(1)msm/z:657.0385[m-cl+dmso]⁺.(质谱表征时以dmso为溶剂)

(2)anal.calc.(forc20h16cl2n2o2pts)c39.10；h2.62；n4.56％,found.c39.41；h2.57；n4.32％。

(3)取10mg本实施所得产物和3ml甲醇/氯仿混合溶液(甲醇和氯仿的体积比为1:1)置于封管中，升温至90℃，反应10h，冷却，有晶体析出，收集晶体，干燥，得到黄色晶体。将所得黄色晶体经x-ray单晶衍射解析，其晶体学数据如下述表1所示，部分键长和键角如下述表2所示，所得产物的晶体结构如图1所示。

表1：产物的晶体学和结构修正数据

表2：产物的部分健长和键角[°]

因此，可确定本实施例所得黄色粉末状产物为目标产物苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物，其结构式如下述式(i)所示：

实施例2

取苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺(270.3mg，1mmol)、pt(dmso)2cl2(422.9mg，1mmol)和8ml甲醇，置于厚壁耐压瓶中，溶解后在温度为70℃下、搅拌反应36h，自然冷却至室温，有黄色固体析出，分离，干燥，得到黄色粉末485.24mg，产率70.00％。

对本实施所得产物进行质谱、元素分析和x-单晶衍射分析，确定本实施例所得产物为目标化合物。

实施例3

取苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺(200mg，0.7404mmol)、pt(dmso)2cl2(311.64mg，0.7404mmol)和8mldmso，置于圆底烧瓶中，溶解后在温度为80℃下、搅拌反应24h，自然冷却至室温，有黄色固体析出，分离，干燥，得到黄色粉末200mg，产率62.62％。

对本实施所得产物进行质谱、元素分析和x-单晶衍射分析，确定本实施例所得产物为目标化合物。

实施例4

取苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.3702mmol)、pt(dmso)2cl2(155.82mg，0.3702mmol)和5ml氯仿，置于圆底烧瓶中，溶解后在温度为80℃下、搅拌反应，反应42h，反应结束后趁热过滤除去未反应原料，自然冷却至室温，有黄色固体析出，分离，干燥，得到黄色粉末100mg，产率44.21％。

对本实施所得产物进行质谱、元素分析和x-单晶衍射分析，确定本实施例所得产物为目标化合物。

实施例5

取苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.3702mmol)、pt(dmso)2cl2(155.82mg，0.3702mmol)、5ml乙醇和5ml二氯甲烷，置于圆底烧瓶中，在温度为40℃下、搅拌反应48h，反应结束后趁热过滤除去未反应原料，自然冷却至室温，有黄色固体析出，分离，干燥，得到黄色粉末50mg，产率22.10％。

对本实施所得产物进行质谱、元素分析和x-单晶衍射分析，确定本实施例所得产物为目标化合物。

实施例6

重复实施例5，不同的是，反应温度为常温。

最终得到黄色粉末5mg，产率4.42％。

对本实施所得产物进行质谱、元素分析和x-单晶衍射分析，确定本实施例所得产物为目标化合物。

实验例1：本发明目标化合物对多种人肿瘤细胞株的体外抗肿瘤活性实验：

为说明本发明所述苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物的抗肿瘤作用，申请人对配合物均进行了的抗肿瘤活性实验(以常用抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(5-fu)和顺铂(cis-platin)为参比)，并对按上述实施例1所述方法制得的化合物开展对正常细胞的毒性实验。

1.细胞的接种与培养

所选细胞株均置于37℃、5％co2充分湿化条件下的培养箱中，接种于含10％灭活新生牛血清的ppmi1640培养液中培养。用倒置显微镜观察细胞生长情况，每周更换2-3次培养基，6-7天传代一次，接种时以0.25％胰蛋白酶消化传代，通常取传代3-4次，处于对数生长期细胞用于实验。

2.化合物细胞水平的活性初筛

本次实验所使用的化合物(其中本发明所述配合物为按上述实施例1所述方法制得)，纯度≥95％，将所有化合物配制成100μg/ml，助溶剂dmso终浓度不超过1％，测试该浓度下各化合物对癌细胞的抑制率，凡抑制率大于50％并符合光镜下细胞受抑(或受损)形态变化的(如细胞皱缩、破碎、漂浮等)，且对正常细胞毒性不是很大的化合物，则初步判定为该化合物初筛有效，即进入下一步骤求取ic50阶段。

3.细胞生长抑制实验(mtt法)

mtt比色法，是一种检测细胞生长和存活的方法。检测原理：与死细胞不同，外源性mtt能被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中。二甲基亚砜(dmso)能把细胞中的甲瓒溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等，具有灵敏度高、经济等特点。

取处于对数生长期的细胞，每孔180μl(约4500-5000个细胞)含细胞的培养基接种于96孔培养板，于37℃、5％co2充分湿化条件下培养24h。待细胞贴壁后，按每孔20μl的量加入样品,每个样品设6个复孔，同时设定相应的空白对照。继续培养48h后，每孔加入10μlmtt试剂(浓度为5mg/ml)，继续孵育4h后，吸弃上清液，每孔再加入150μldmso，轻微震荡反应5-8min，使结晶颗粒充分溶解。空白对照组调零，用酶标仪以490nm波长测定去除本底光吸收值后的吸光度值计算细胞增殖抑制率，对初筛抗肿瘤效果好的受试化合物，继续用5个浓度梯度继续做相应细胞株的ic50值，所有实验均重复3次后取平均值。实验结果详见下表3。

表3：化合物对不同肿瘤细胞株的半抑制率浓度(c50，μm).

nd^a表示没有测试。

由表3中数据可知，本发明所述配合物对人肝癌细胞smmc-7721、人神经胶质瘤细胞株u251、人宫颈癌细胞hela、人卵巢癌细胞skov-3和人大细胞肺癌细胞nci-h460的抑制活性均优于常用抗肿瘤药物顺铂，且配体和配合物对人肝正常细胞hl-7702的毒性显著小于顺铂。以上结果表明，通过将苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺目核引入铂类金属结构上制备出新型的苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂抗肿瘤配合物是可行的，可筛选出高效低毒的新型抗肿瘤配合物。但是，本发明所述配合物对人大细胞肺癌细胞nci-h460的抑制活性低于其配体，也就是说，将苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺目核引入铂类金属结构并不是肯定就能提高对肿瘤细胞的细胞毒性。

实验例2：本发明所述配合物的抗肿瘤作用机制

为说明本发明所述苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物的抗肿瘤作用机制，申请人基于dna和拓扑异构酶i靶点研究该配合物的抗肿瘤作用机制。

1.与dna的作用

配置5mmtris-no3(ph7.4)溶液，使用该水溶液将gmp配制成2mm的储液备用，使用dmso将化合物i(即本发明目标化合物苯并咪唑-1,8-萘酰亚胺-铂配合物，按上述实施例1所述方法制得)配成2mm的储液备用。将gmp：i配制成2比1的溶液在37摄氏度孵育不同时间，测试时用少量甲醇稀释终浓度分别为400nm和200nm，采用质谱仪检测跟踪配合物与gmp的作用，以表征配合物与dna的作用。

由化合物i与鸟苷酸作用不同时间的质谱图可知，i在与gmp作用后使用质谱检测有三个主峰分别是597.053，657.039，956.993其荷质比均为1，三个主峰分别对应的是[i–cl+h2o]⁺＝597.053、[i-cl+dmso]⁺＝657.039和[i–cl+gmp+ch3oh]⁺＝956.993。[i-cl+h2o]⁺的峰高随着时间加长而逐渐增加，并在12h趋于稳定；[1p-cl+dmso]⁺的峰高随着时间加长而逐渐变弱，也在12h趋于稳定；[i–cl+gmp+ch3oh]⁺的峰1h左右就已经出现，峰高伴随作用时间延长逐渐越来越弱。上述实验数据表明化合物i在有水存在下环境下优先与水形成稳定的一水合加合物，与水结合能力大于dmso大于gmp。这种结合在测试条件下在于12h趋于平稳。实验结果表明，化合物i与gmp共价结合能力远远小于顺铂，说明化合物i与顺铂的作用机制不同并不是通过与gmp发生共价结合从而影响dna的合成从而杀死癌细胞。

2.与拓扑异构酶i相互作用研究

基于拓扑异构酶是萘酰亚胺类化合物和顺铂的一个共同靶点，我们使用琼脂糖凝胶电泳以及蛋白印迹法研究配合物与拓扑异构酶的相互作用。

电泳结果表明化合物i在体外对topoi有较强抑制作用，其在40μm浓度下就能完全抑制0.1u/l的topoi的催化功能，化合物i在80μm能完全抑制拓扑异构酶i活性。经典topoi毒剂喜树碱体外对于拓扑异构酶i的半抑制浓度大约为17μm，化合物i对拓扑异构酶i的抑制活性与其相当。

前面实验表明，化合物i与dna直接的共价作用较弱，而它们却有较强的拓扑异构酶抑制活性，故我们推测它发挥抗癌活性可能是通过抑制细胞内拓扑异构酶的活性。

为了验证化合物的加入对细胞内拓扑异构酶的的表达量同样有影响，在smmc7721肝癌细胞内加入不同浓度的化合物i，作用24小时后提取细胞内蛋白质使用电泳分析加入不同浓度的化合物i对细胞内拓扑异构酶表达量的变化，如图2所示。图2表明加入不同浓度的化合物i后(作用24小时之后)，7721细胞内拓扑异构酶i的表达量明显上调并且这种上调与加入化合物i的浓度呈正相关关系。众所周知拓扑异构酶抑制剂分为两种一种是拓扑异构酶催化抑制剂，其能直接抑制拓扑异构酶与dna结合，另一种是拓扑异构酶毒剂像喜树碱，其能稳定拓扑异构酶与dna的中间产物。

图3为加入化合物不同浓度化合物i后smmc-7721细胞拓扑异构酶i表达量，其表明化合物i可能是拓扑异构酶催化抑制剂，它们能够阻止拓扑异构酶与dna的结合而又不能稳定拓扑异构酶i-dna加合物或者稳定能力较弱。减少了拓扑异构酶与dna的结合,但是却不影响拓扑异构酶i-dna加合物的分离(或者影响很小)，从而导致细胞内拓扑异构酶i的量增加。