2`-脱氧-2`-氟-2`-C-甲基尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体及其合成方法与流程

本发明属于核苷酸的化学合成技术领域，特别是涉及一种2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体及其合成方法。

背景技术

寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸dna或核糖核酸rna内的核苷酸)，因其易与它们的互补链对接，常用来作为探针确定dna或rna的结构。寡核苷酸合成的dna可以用于链聚合反应，能放大确定几乎所有dna的片段，在这个过程中寡核苷酸是作为引子，和dna中标的的互补片段结合，作成dna的复制品。其中调控寡核苷酸用于抑制rna片段，防止其翻译成蛋白，在治疗癌症等疾病过程中具有积极的意义。

由于化学修饰的寡核苷酸表现了优于天然寡核苷酸的性质，目前已是生物化学及分子生物的一大研究热点。化学修饰的寡核苷酸的优越性主要有：可用于基础研究方面的基因分析；可用于蛋白质结构及其活性的研究而无需使基因变异；可用于深入研究癌的发展过程；还可用来抑制一些重要的基因产物，如酶，离子通道，受体，免疫调节分子和其他调节蛋白的产生。总之，在研究蛋白及其与核酸的相互作用方面的研究，化学修饰的寡核苷酸提供了一种重要的研究手段。

1952年阐明核酸大分子是由许多核苷酸通过3’-5’磷酸二酯链键连接起来的这个基本结构以后，化学家们便立即开始尝试核酸的人工合成。英国剑桥大学todd实验室于1955年首先合成了具有3’-5’磷酸二酯键结构的tpt和ptptt（a．m．michelson，alexanderr．todd．nucleotidespartxxxii．synthesisofadithymidinedinucleotidecontaininga3’：5’internucleotidiclinkage[j]．j．am．chem．soc．，1955，2632-2638）。1957年，alexanderr．todd也因此而荣获诺贝尔化学奖。此后，khorana等人对基因的人工合成做出了划时代的贡献，不仅创建了基因合成的磷酸二酯法，而且发展了一系列有关核苷酸的糖上羟基、碱基的氨基和磷酸基的保护基及缩合剂和合成产物的分离、纯化方法，并于1967年年首次提出用化学方法合成基因。1970年，khorana等首次报道了基因合成方法（itakura，k．，t．hirose，r．crea，eta1．expressioninescherichiacoliofachemicallysynthesizedgeneforthehormonesomatostatin[j]．science，1977，198(4321)：1056—1063）。两年后，他们合成了酵母丙氨酸trna结构基因的dna双链；此后他们又合成了具有126个核苷酸对的大肠杆菌酪氨酸trna的基因。1979年完成了包括启动子和调节序列在内，共有207bp的大肠杆菌酪氨酸校正trna基因（goeddeldr,kleiddg,bolivarf．expressioninescherichiacoliofchemicallysynthesizedgenesforhumaninsulin[j]．proc．natl．acad．sci．usa．，1979，76(1)：106-110）。

在化学合成的方法方面，除了对khorana等人建立的磷酸二酯法的反应条件和分离方法以及保护基的选择等方面继续进行改善以外，从1966年开始，首先是letsinger然后是reese、narang、itakara、vanboon、ohtsuka和caruthers等人，针对磷酸二酯法的不足建立和发展了磷酸三酯法和亚磷酸三酯法。并在此基础上，又发展了固相的磷酸三酯法和亚磷酸三酯法。此后又发展了固相合成技术，为dna的人工合成提供了新方法，实现了dna合成的自动化。

经过二十多年的探索和研究，脱氧核搪寡核苷酸的化学合成发展很快，特别是最近几年来，由于固相合成技术的推广和应用，使dna片段的化学合成达到了精确、高效和自动化的程度，为遗传工程提供了崭新的手段（itakura．k．，rossi．j．j．，wallace．r．b．synthesisanduseofsyntheticoligonucleotides[j].annualreviewofbiochemistry，1984，53，323-356）。dna的人工合成正在生物学和医学等许多领域中发挥越来越多的作用。

固相合成通常是指连接在固相载体(如树脂等)上的活性官能团与溶解在有机溶剂中的试剂之间的反应。其特点是简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率。固相合成的这些优点为寡聚核苷酸的人工合成提供了新的思路。

dna的化学合成研究始于上世纪50年代。基因是由具有特定的核苷酸顺序的核酸组成的功能单位，它携有特定的遗传信息，在染色体上按一定的顺序排列。核酸的人工合成是指将核苷酸单体通过磷酸二酯键以3’-5’的方式连接，使其具有天然核酸分子的全部生物学活性和特定的排列顺序。固相合成核苷酸时，末端核苷酸的3’-oh与固相载体形成共价键，每延伸一个核苷酸需要4步化学反应，依次经过脱保护，偶联，封闭和氧化四步主要反应。

近年来，对化学修饰的寡核苷酸的合成及其性质和应用的研究开展得越来越广泛和深入。化学修饰涉及到寡核苷酸的各个结构部位，如对碱基，核糖基，磷酸酯基进行了各种结构改造；在寡核苷酸链上连结嵌合基，反应基，发色基和酶。对它们的性质，如杂交稳定性，核酸酶的底物性质，抑制基因表达的顺序专一性和作用机理等的研究也有大量报道。化学修饰的寡核苷酸的应既可用于核酸的结构研究，也可用作抗癌抗病毒的药剂（eugenuhlmann，anuschpeyman．antisenseoligonucleotides：anewtherapeuticprinciple[j]．chem．rev．，1990，90(4)：543-584。）。

通过化学法合成和改造后能够实现基因高表达，也是消除基因多个点突变的好方法。近年来的化学法合成dna的发展使得大规模合成较长dna序列成为可能。随着化学合成寡核苷酸链广泛的用于各类引物、基因全合成、dna芯片等领域，实现了合成寡核昔酸链的小型化，自动化及高通量化。

由于现代科学技术的发展，dna合成已广泛采用dna自动合成仪，仅有少数特殊情况下采用人工合成。目前，主要有abi(appliedbiosysteminc．)、pharmacia、backman等几家公司生产dna／rna合成仪，其中以abi公司的仪器占我国及世界市场的80％-90％。由于合成技术的现代化，大大减少了合成过程的人力和物力，科研工作人员只需输入合成仪的dna序列，整个合成过程在1～2h即可完成。最后取下合成柱再进行dna切落和去保护基以及纯化就可得到所需核苷酸。

索非布韦(又译为索氟布韦，英文名sofosbuvir，商品名sovaldi)是吉利德公司开发用于治疗慢性丙肝的新药，于2013年12月6日经美国食品药品监督管理局(fda)批准在美国上市，2014年1月16日经欧洲药品管理局(emea)批准在欧盟各国上市。2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶是合成索非布韦的重要中间体。

本发明以2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶作为起始原料，合成一种2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体，可以作为dna核苷酸固相合成的原料，可以方便地在寡核苷酸片段中引入一个或多个2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体，合成新型的寡核苷酸序列及其探针。在sidna(小干扰dna，smallinterferingdna)的药物研发、基因功能的研究和全基因库的筛选等方面具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明主要解决的技术问题是提供一种2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体及其合成方法，该合成方法反应条件温和，后处理简单，操作简便，适合工业化生产。能够为合成新的dna核苷序列提供原料，为新sidna药物研发和新核酸序列分析技术的低成本、高速度和高通量奠定基础。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：合成一种2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体，其特征在于结构为：

其中r1选自于：

r2选自于：

r3选自于：

。

具体合成步骤为：

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（1）起始原料为2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶，在碱性条件和催化剂的作用下，选择性保护5'-oh合成式1化合物，保护基优选4,4-二甲氧基三苯甲基，催化剂优选dmap。

（2）式1化合物，在碱性条件和催化剂的作用下，选保护3'-oh合成式2化合物，保护试剂优选2-氰乙基n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺，催化剂优选dmap。

本发明所得化合物作为dna核苷酸固相合成的原料，可以方便地在寡核苷酸片段中引入一个或多个2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体，合成新型的寡核苷酸序列及其探针。在sidna(小干扰dna，smallinterferingdna)的药物研发、基因功能的研究和全基因库的筛选等方面具有广阔的应用前景。

以下两种2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体是本发明的优选化合物：

。

本发明的有益效果是：本发明跟现有技术相比，具有如下优点：

1.本发明的最大优点是2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体作为dna核苷酸固相合成的原料，可以方便地在寡核苷酸片段中引入一个或多个2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体，合成新型的寡核苷酸序列及其探针；

2.该合成方法反应条件温和，后处理简单，操作简便，适合工业化生产；

3.本发明以具合成索非布韦的重要中间体：2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷作为起始原料，有如此特性的结构引入寡核苷酸片段后，在相关研究领域（尤其是sidna药物研发领域）有望取得突破性成果；

4.本发明的起始重要原料2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷，目前已商业化，成本低廉易得。

附图说明

图1是本发明2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体的合成路线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

请参阅图1，本发明实施例包括：

实施例1

5'-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿苷的合成：

在250ml两口瓶中，分别加入100ml乙酸乙酯、2.6g(10mmol)2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿苷、2.0g(20mmol)三乙胺和0.2g(2mmol)dmap，在氮气保护条件下，加入4.4g(13mmol)4,4'-双甲氧基三苯甲基氯固体，然后50°c搅拌反应3小时。tlc检测反应完全后，水洗涤三次（50mlx3）,用无水硫酸钠干燥后，旋干溶剂，柱层析(二氯甲烷／甲醇=30：1)，得到5.0g5'-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2'-c-甲基尿苷，产率88.9％。

实施例2

5'-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3'-(2-氰基乙基-n,n-二异丙基)-2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿苷亚磷酰胺的合成：

在250ml两口瓶中，将0.84g(1.5mmol)5'-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿苷溶于l00ml无水二氯甲烷中，然后依次加入0.7g(6mmol)二异丙基乙基胺和0.03g(0.3mmol)的dmap固体，在冰浴氮气保护条件下，缓慢滴加0.7g(3mmol)2-氰乙基n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺(溶于30ml二氯甲烷中)，继续搅拌5分钟后，恢复室温，搅拌8小时。tlc检测反应完全后，旋干溶剂后，直接柱层析(石油醚／乙酸乙酯=8：1)，得到0.87g5'-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3'-(2-氰基乙基-n,n-二异丙基)-2'-o-[(叔丁基)二甲基硅基]-2'-脱氧-2'-氟-2'-c-甲基尿苷亚磷酰胺，产率76％。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。