鲜西芹叶水提物粉末,其制备,自由基清除作用及应用的制作方法

本发明涉及从鲜西芹叶的水提物制备粉末的方法,涉及从鲜西芹叶的水提物制备粉末的工艺的可重现性由它的特征uplc-质谱总离子流图谱及其34个峰界定,涉及粉末中的组分由它的特征uplc-质谱总离子流图谱及其34个峰界定,涉及34个峰对应鲜西芹叶水提物粉末中的3种蔗糖结构,涉及34个峰对应鲜西芹叶水提物粉末中的13种奎尼酸结构,涉及34个峰对应鲜西芹叶水提物粉末中的18种芹菜苷结构,进一步涉及鲜西芹叶水提粉末的自由基清除作用,因而本发明涉及鲜西芹叶水提物粉末在制备预防自由基损伤药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术：

大量统计数据说明,自由基堆积造成的损伤包括氮自由基及羟自由基堆积造成的损伤与衰老、人体免疫功能低下、动脉粥样硬化、缺血再灌注及癌症发病有密切关系。有效地预防氮自由基及羟自由基堆积造成的损伤已经成为全球关注的健康问题。虽然有些维生素和中药具有氮自由基及羟自由基清除作用,但作为预防药物长期服用仍然存在不确定性。发现无任何毒副作用可用于预防氮自由基及羟自由基堆积造成的损伤的药物,是药物研究的重要方向。

民间一直有芹菜叶性味凉的说法,认为芹菜叶有清热消毒作用,可治疗肝火旺盛,有平肝清热效果。民间还有菜叶富含纤维素,有滑肠通便治疗便秘的说法。民间还认为芹菜叶有降低血压作用,也可治疗头昏,水肿和月经不调。由于没有严格的药效学研究,所以这些说法的基础仅仅是经验。此外,这些说法中的芹菜叶是西芹叶还是香芹叶没有界定。更进一步,这些说法与血管舒张没有直接牵连。此外,发明人曾提出鲜芹菜叶纳米汁的保肝作用。可是鲜芹菜叶纳米汁经20天放置不仅霉变,而且沉淀。霉变可致病,沉淀可改变化学组成。这两个致命性问题,使得发明人不得不放弃鲜芹菜叶纳米汁的后续开发。

发明人长期从鲜西芹叶水提物粉末的化学成分及治疗作用研究。发明人认识到至今业内人既不清楚鲜西芹叶水提物到底含哪些化学组分,也不清楚鲜西芹叶水提物有怎样的治疗作用。针对这种状况,发明人对鲜西芹叶水提物进行质谱分析。对鲜西芹叶水提物中34种组分分析使发明人认识到,鲜西芹叶水提物可清除氮自由基及羟自由基。对鲜西芹叶水提物中34种组分的结构分析导致本发明发现了34种新化合物,从而体现了本发明的智慧与创造性。与所有芹菜相关的已知发明相比,本发明的鲜西芹叶水提物粉末达到了一个全新高度。根据这些认识,发明人提出了本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个内容是提供鲜西芹叶水提物粉末的方法，该方法由下述步骤构成：

(1)表面无泥沙的1000g鲜西芹叶用3000ml自来水洗2次，之后转移至无菌环境用3000ml三蒸水洗3次，滤除水得到清洁的鲜西芹叶；

(2)将清洁的鲜西芹叶用三蒸水于60℃-90℃浸泡3次，每次用3000ml三蒸水至少浸泡30分钟，浸泡期间缓慢搅拌；

(3)每次浸泡之后让水提液自行缓慢流出，用时不少于30分钟；

(4)将得到的约9000ml水提液于60℃-90℃减压浓缩得到24g鲜西芹叶水提物粉末。

本发明的第二个内容是提供鲜西芹叶水提物粉末的紫外图谱。

本发明的第三个内容是提供鲜西芹叶水提物粉末的质谱总离子流图谱。

本发明的第四个内容是提供与鲜西芹叶水提物粉末的质谱总离子流谱中的峰对应的34种组分的化学结构。

本发明的第五个内容是描述鲜西芹叶水提物粉末对自由基的清除作用。

附图说明

图1.鲜西芹叶水提物粉末的uplc色谱图。

图2.鲜西芹叶水提物粉末的uplc-质谱总离子流图谱。

图3.6-o-[e-3-(1,3,5,7,9-十二碳五烯羰氧)-4-羟基桂皮酰]蔗糖的裂解途径。

图4.6-o-[e-3-(1,3,5,7,9-十二碳五烯羰氧)-4-羟基桂皮酰]蔗糖的质谱。

图5.3-o-[e-3,5-二(羧正丙酰氧)-4-甲酰氧桂皮酰]奎尼酸的裂解途径。

图6.3-o-[e-3,5-二(羧正丙酰氧)-4-甲酰氧桂皮酰]奎尼酸的质谱。

图7.3-正己羰氧正庚酰芹菜苷的裂解途径。

图8.3-正己羰氧正庚酰芹菜苷的质谱。

图9.鲜西芹叶水提物粉末浓度依赖地清除氮自由基。

图10.鲜西芹叶水提物粉末浓度依赖地清除羟自由基。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备鲜西芹叶水提物粉末

表面无泥沙的1000g鲜西芹叶用3000ml自来水洗2次,之后转移至无菌环境用3000ml三蒸水洗3次。滤除水,得到清洁的鲜西芹叶。将清洁的鲜西芹叶用三蒸水于60℃-90℃浸泡3次,每次用3000ml三蒸水至少浸泡30分钟,浸泡期间缓慢搅拌。每次浸泡之后让水提液自行缓慢流出,用时不少于30分钟。合并约9000ml缓慢流出的水提液,于60℃-90℃减压浓缩得到24g鲜西芹叶水提物粉末。

实施例2测定鲜西芹叶水提物粉末的色谱和质谱离子流谱

2-1.样品溶液的制备(10mg/ml)

称取26.7mg鲜西芹叶水提物粉末,用2.67ml超纯水中将粉末溶解。得到的溶液超声震荡1分钟,之后再于13000r/min离心10分钟。取上清液,过0.22μm滤膜,置于样品瓶中供色谱和质谱测定用。

2-2.色谱条件

色谱柱:waters,acquityhsst3柱(2.1×100mmi.d.,1.8μm)；

进样体积:2μl；

pda检测器:210-400nm；

流动相:水(0.1％甲酸),乙腈；

流动相按照表1的梯度洗色谱柱。

表1流动相梯度表

2-3.测定色谱图

按照上面的色谱测定条件测定并记录鲜西芹叶水提物粉末的uplc色谱图(见说明书附图1)。

2-4.测定离子流谱和质谱的条件

电喷雾离子化模式:正(pi)及负(ni)模式；

斜坡陷阱碰撞能量:20-60v；

圆锥形电流:40v；

离子源温度:100℃；

毛细管电压:30kv；

喷雾压:6.5bar；

m/z范围:100-1500。

2-5.记录离子流谱和质谱

按照上面的条件测定并记录鲜西芹叶水提物粉末的离子流谱(见说明书附图2)。

实施例3指定鲜西芹叶水提物粉末中34种组分的结构

将实施例2的uplc色谱与质谱联接,测定鲜西芹叶水提物粉末的uplc-质谱。质谱条件是电喷雾离子化的正离子和负离子两种模式。斜阱碰撞能为20-60v。园椎体电压为40v。离子源温度为100℃。毛细管电压为30kv。喷雾器的压力为6.5bar。质/荷比的范围为100-1500。在14分钟内分出34个独立峰。根据质谱裂解规律,与这些峰(对总离子流图谱的峰从左到右顺序编号)被指定为表2的对应组分。

表2与总离子流图谱的峰对应的组分名称

实施例4鲜西芹叶水提物粉末中34种组分的质谱、化学结构及裂解过程

在分析实施例2测定的总离子流中与各峰对应的质谱图的基础上,将分子离子及碎片离子相关联。于是。发明人确立了实施例3的表2中34种组分在所述质谱条件下的裂解途径。这些裂解途径反过来成为支持本发明发现鲜西芹叶水提物粉末中34种组分具有无可争辩的新颖性和创造性的依据。作为34种组分在所述质谱条件下的裂解途径及质谱,图3和图4分别是6-o-[e-3-(1,3,5,7,9-十二碳五烯羰氧)-4-羟基桂皮酰]蔗糖的裂解途径和质谱,图5和图6分别是3-o-[e-3,5-二(羧正丙酰氧)-4-甲酰氧桂皮酰]奎尼酸的裂解途径和质谱,图7和图8分别是3-正己羰氧正庚酰芹菜苷的裂解途径和质谱。

实施例5测定鲜西芹叶水提物粉末的氮自由基清除作用

为考察鲜西芹叶水提物粉末的氮自由基的清除作用，本发明按照标准方法在顺磁共振仪上测定了在不同浓度下鲜西芹叶水提物粉末的水溶液清除氮自由基,即清除1,1-二苯基-2-(2,4,6-三硝基苯基)肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical,dpph)的活性。具体操作包括制备dpph的二氧六环溶液(0.8g/ml)和鲜西芹叶水提物粉末的超纯水溶液(2mg/ml,4mg/ml,6mg/ml,8mg/ml,10mg/ml及15mg/ml)。向0.5mlep管中加10μldpph的二氧六环溶液及10μl超纯水,涡旋混匀得待测样品。用毛细管吸取样品加入顺磁管中,封口胶封口,避光室温孵育10分钟,见光室温孵育10分钟,在顺磁共振仪上重复6次得鲜西芹叶水提物粉末的超纯水溶液浓度为零的氮自由基谱。向0.5mlep管中加10μldpph的二氧六环溶液及10μl鲜西芹叶水提物粉末的超纯水溶液(2mg/ml,4mg/ml,6mg/ml,8mg/ml,10mg/ml及15mg/ml),涡旋混匀得待测样品。用毛细管吸取样品加入顺磁管中,封口胶封口,避光室温孵育10分钟,见光室温孵育10分钟,在顺磁共振仪上重复6次得浓度为2mg/ml,4mg/ml,6mg/ml,8mg/ml,10mg/ml及15mg/ml的鲜西芹叶水提物粉末的超纯水溶液的氮自由基谱。图9的结果说明,鲜西芹叶水提物粉末的超纯水溶液浓度依赖地降低氮自由基峰强度。与临床应用的具有氮自由基清除作用的维生素和中药不同，鲜西芹叶是蔬菜。作为可随意食用的蔬菜，鲜西芹叶水提物粉末具有氮自由基清除作用是意想不到的技术效果。

实施例6测定鲜西芹叶水提物粉末的羟自由基清除作用

为考察鲜西芹叶水提物粉末的羟自由基的清除作用,本发明按照标准方法在顺磁共振仪上测定了在不同浓度下鲜西芹叶水提物粉末的水溶液清除羟自由基的活性。具体操作包括将5μlfeso4.7h2o水溶液(2.78mg/ml),5μl5,5-二甲基-1-氧化吡咯啉(5,5-dimethyl-1-pyridine-n-oxide,dmpo)水溶液(11.316mg/ml)及5μlh2o2水溶液(1％)在ep管中涡旋混匀。用毛细管吸取样品加入顺磁管中,封口胶封口,避光室温孵育10分钟,见光室温孵育10分钟,在顺磁共振仪上重复6次得鲜西芹叶水提物粉末的超纯水溶液浓度为零的羟自由基谱。将5μlfeso4^·7h2o水溶液(2.78mg/ml),5μldmpo水溶液(11.316mg/ml),5μl鲜西芹叶水提物粉末的水溶液(0.5mg/ml,1.0mg/ml,2.0mg/ml及6.0mg/ml)及5μlh2o2水溶液(1％)在ep管中涡旋混匀。用毛细管吸取样品加入顺磁管中,封口胶封口,避光室温孵育10分钟,见光室温孵育10分钟,在顺磁共振仪上重复6次得浓度为0.5mg/ml,1.0mg/ml,2.0mg/ml及6.0mg/ml的鲜西芹叶水提物粉末的超纯水溶液的羟自由基谱。图10的结果说明,鲜西芹叶水提物粉末的超纯水溶液浓度依赖地降低羟自由基峰强度。与临床应用的具有羟自由基清除作用的维生素和中药不同，鲜西芹叶是蔬菜。作为可随意食用的蔬菜，鲜西芹叶水提物粉末具有羟自由基清除作用是意想不到的技术效果。