一种检测黄牛SH3PXD2B基因插入/缺失标记的方法与流程

本发明属于分子遗传学领域，涉及黄牛sh3pxd2b基因插入/缺失(indel)的检测。

背景技术

插入/缺失(insertion/deletion,indel)突变是指在同一物种不同个体之间或亲缘相近的物种之间的基因组同一位点的序列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，即一个序列上某一位点，与同源的另一个序列相比，插入或缺失了一个或多个碱基。

indel标记是一种基于pcr扩增技术的分子标记，本质上属于长度多态性标记。indel标记具有许多优点，如稳定性好、多态性高、分型系统简单等，因此现在广泛应用于动植物标记辅助选择育种工作中。

2006年，人类第一个基因组indel图谱被mills等人创建出来，该图谱中有超过41万多个特异性的indel位点，平均每7.2kb就存在一个indel位点。2011年其又在人类基因组中发现了长度从1bp到10000bp不等的近200万个indel标记，这些标记长度大部分都集中在100bp以内。

因为indel标记本质上属于长度多态性遗传标记，所以可以用pcr扩增技术对indel进行分型。与分型系统复杂的snp标记相比，indel标记检测简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，用琼脂糖凝胶电泳即可进行分型。与snps相似，indel标记在基因组中大量存在，然而，它们的分布并不均匀，它们的位置具有一定互补性，因此可将indel标记和snps进行综合应用，根据目的基因所在区域不同来设计不同的分子标记。

随着分子遗传学、数量遗传学和分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择(mas)在动物遗传育种中已获得许多成果，并已经成为目前家畜选育和研究的热点。mas是一种充分利用了表型、系谱和遗传标记信息的方法，因此与只利用表型和系谱信息的常规选种方法相比，mas也具有更大的信息量。

目前，mas在动物育种中已获得许多研究成果，例如，雌激素受体(estrogenreceptor,esr)基因、猪的氟烷(halothane,hal)基因等，这些基因的dna标记检测已经在育种实践中得到应用。此外，还有许多与肉质、生长和繁殖等有关的基因也逐渐被发现。将遗传标记应用在动物育种中，可显著地加速动物育种的遗传进展，有效的加快育种进程，为育种工作的进行提供便利。

sh3pxd2b(sh3andpxdomains2b)基因属于酪氨酸受体蛋白家族，又称酪氨酸激酶4(tyrosinekinasesubstratewithfoursh3domains，tks)基因或脂肪细胞分化因子49(factorforadipocytedifferentiation，fad)基因，位于牛的20号染色体上。sh3pxd2b基因所编码的蛋白是一种结构蛋白，该蛋白具有1个n端的px结构域和4个sh3结构域。sh3pxd2b蛋白在多种细胞中均有表达，如巨噬细胞、破骨细胞、成纤维细胞等，该蛋白作为一种细胞表面的伪足受体蛋白，与细胞表面伪足形成、细胞外基质间伪足粘附、相互诱导、细胞外基质改建与重塑等许多过程有关。

sh3(srchomology3)结构域是最常见的结构域之一，属于src家族，即酪氨酸激酶家族，细胞内有多条信号转导途径与该家族有关，其相关基因参与许多重要的生理过程，如生长、分化、粘附、转录等。px(phoxhomology)结构域是一个球状的三级结构域，由大约110个氨基酸残基折叠形成，含有3个α螺旋和3个β折叠，在其螺旋α1和α2之间有一个富含脯氨酸的长环。有研究发现px结构域可以与高度保守的磷脂酰肌醇(ptdinsp)结合，从而将蛋白质结合到膜上，发挥其各自的功能。px结构域除可以结合ptdin3p，还可以与其他的ptdinsp，如3，4-磷酸肌醇，以及4，5-磷酸肌醇有不同程度的结合能力，这也一定程度上赋予了px蛋白的功能多样性，目前，关于px结构域的研究大都集中于其结合ptdinsp的能力和功能等，但是也有大量证据表明px结构域也可作为蛋白支架结构起作用。

目前，关于sh3pxd2b基因的研究并不是很多，现有研究大多集中在模式动物小鼠和人上，杨彬研究发现sh3pxd2b基因的突变与人的颅颌面畸形和中耳炎等疾病有关；maom等人发现，老鼠sh3pxd2b基因存在的1bp的碱基缺失会使sh3pxd2b基因发生移码突变，从而使第三个sh3结构域结构发生改变以及第四个sh3结构域的全部缺失，该突变会导致间质细胞组织，包括颅面组织，眼睛角膜角和白色脂肪组织的发育异常；此外，还有研究发现，sh3pxd2b蛋白可以与去整联蛋白金属基质蛋白酶15(adisintegrinandmetalloproteaseadam)或膜型-1-基质金属蛋白酶(membranetype-1-matrixmetalloproteinasemt-1-mmp)等跨膜蛋白结合后，介导其水解与重塑细胞外基质，由此可以推测，sh3pxd2b基因可能对细胞迁移、器官形成有重要作用。目前，对中国地方黄牛sh3pxd2b基因遗传变异领域的研究相当匮乏，特别是该基因的功能研究及其遗传变异与经济性状(如生长性状)关联的研究更是空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测黄牛sh3pxd2b基因插入/缺失标记的方法，加快建立遗传资源优良的地方黄牛种群。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

以待检黄牛全基因组dna为模板，以引物对p1、p2为引物，分别pcr扩增黄牛个体sh3pxd2b基因部分片段，通过电泳检测pcr扩增产物，根据电泳检测结果分别判定黄牛个体sh3pxd2b基因上两个插入/缺失突变位点的基因型；

所述引物对p1为：

上游引物：5`-tgcgaggaaagactctggt-3`

下游引物：5`-ttgtgaggtttggctgtatg-3`

所述引物对p2为：

上游引物：5`-agtgggttccctctgatttgc-3`

下游引物：5`-ctgcctgtgctgtcctctttg-3`。

所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃～54℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。

所述电泳检测采用10％(质量浓度)聚丙烯酰胺凝胶电泳。

所述sh3pxd2b基因上两个插入/缺失突变位点的基因型的判定依据为：对于由引物对p1扩增的插入/缺失突变位点(nc_007318.6g.4071212-4071213insaggagtgggtacc)，野生型(dd型)表现为248bp条带，突变纯合型(ii型)表现为261bp条带，杂合型(id型)表现为261bp和248bp两个条带；对于由引物对p2扩增的插入/缺失突变位点(nc_007318.6g.4088290-4088299deltgtggccaca)，野生型(ii型)表现为215bp条带，突变纯合型(dd型)表现为205bp条带，杂合型(id型)表现为215bp和205bp两个条带。

本发明的有益效果体现在：

本发明建立了一种检测中国地方黄牛sh3pxd2b基因插入/缺失分子标记的方法，根据检测到的与黄牛生长性状关联的sh3pxd2b基因插入/缺失突变位点(nc_007318.6g.4071212-4071213insaggagtgggtacc、nc_007318.6g.4088290-4088299deltgtggccaca)的基因型，可应用于黄牛的分子标记辅助选择中，从而加快生长性状优良的地方黄牛种群的建立。

附图说明

图1为中国地方黄牛sh3pxd2b基因上两个插入/缺失突变位点的pcr产物电泳结果。

图2为中国地方黄牛sh3pxd2b基因上两个插入/缺失突变位点的pcr产物测序结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。

本发明通过对中国地方黄牛sh3pxd2b基因上与生长性状关联的潜在位点进行检测，以便于快速进行中国地方黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的地方黄牛种群，具体样本的检测和性状关联分析如下。

(1)中国地方黄牛sh3pxd2b基因突变位点引物设计

根据genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)所公布的牛sh3pxd2b基因(nc_007318.6)序列作为参考，利用primer5.0设计能够扩增包含sh3pxd2b基因indel突变位点的特异性pcr引物，其引物序列如下(引物设计完成时间为2017年3月)：

引物对p1为：

上游引物：5`-tgcgaggaaagactctggt-3`19nt

下游引物：5`-ttgtgaggtttggctgtatg-3`20nt

引物对p2为：

上游引物：5`-agtgggttccctctgatttgc-3`21nt

下游引物：5`-ctgcctgtgctgtcctctttg-3`21nt

以上述引物对黄牛基因组进行pcr扩增，扩增产物为分别包含两个indel位点的特异性片段。

两个indel位点中存在的插入/缺失多态性：对于突变位点一(即引物对p1扩增的位点：nc_007318.6g.4071212-4071213insaggagtgggtacc)，野生型(dd型)表现为248bp条带，突变纯合型(ii型)表现为261bp条带，杂合型(id型)表现为261bp和248bp条带；对于突变位点二(即引物对p2扩增的位点：nc_007318.6g.4088290-4088299deltgtggccaca)，野生型(ii型)表现为215bp条带，突变纯合型(dd型)表现为205bp条带，杂合型(id型)表现为215bp和205bp条带。因此，利用pcr扩增和电泳检测，可对对应位点突变进行检测。

(2)以引物对p1、p2pcr扩增待检测黄牛的sh3pxd2b基因片段

a、中国地方黄牛样本收集

本发明以秦川牛(n＝274)、鲁西牛(n＝113)、郏县红牛(n＝138)和南阳牛(n＝135)四个中国地方黄牛种群作为检测对象，具体采集样本见表1：

表1.黄牛样本的采集

b、血样基因组dna的提取和均质化

使用北京艾德莱生物科技有限公司生产的小量全血基因组dna快速提取试剂盒(目录号：dn01)进行黄牛全血基因组dna的提取，具体操作步骤：

1)取200μl新鲜、冷冻或加入抗凝剂的血液，放入1.5ml离心管；

2)加入20μl蛋白酶k(20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl结合液cb，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟，溶液变清亮(但颜色偏黑色)；

3)冷却后加100μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时会出现絮状沉淀；

4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱ac中，(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液；

5)加入500μl抑制物去除液ir，12000rpm离心30秒，弃废液；

6)加入600μl漂洗液wb，12000rpm离心30秒，弃掉废液；

7)加入600μl漂洗液wb，12000rpm离心30秒，弃掉废液；

8)将吸附柱ac放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

9)取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液eb(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，收集dna；

10)dna可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。

11)吸取1μldna溶液，利用tecan全波长酶标仪测定od260和od280，所有样品的od260/od280均需处于1.8-2.2之间，dna浓度均需大于100μg/μl。不合格的样品做好标记，并进行重新提取。dna检测完成后，取一定量dna溶液，将其稀释至模板工作浓度10ng/μl，-20℃保存备用，其余未稀释dna样品于-80℃冰箱中存放。

c、pcr扩增

pcr反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需要的各种组分的数量和1次反应所需的pcr反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到2.0ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mlpcr管中，然后加入模板dna，震荡混匀，瞬时离心后进行pcr扩增；

pcr反应体系见表2：

表2.pcr反应体系

pcr反应程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s，退火温度分别为54℃(p1)或50℃(p2)，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。

对4个地方黄牛种群共计660个样本基因组dna进行pcr扩增。

(3)收集采样个体的生长数据

收集660个中国地方黄牛的生长数据，为后续相关性分析做准备。所有采样个体年龄均在4-6岁之间。生长数据包括体高(bodyheight，bh)、体斜长(bodylength，bl)、胸围(chestcircumference，cc)、腹围(abdominalcircumference，ac)、腰角宽(hipbonewidth，hbw)、坐骨端宽(hucklebonewidth，hw)、十字部髙(hipheight，hh)和体重(bodyweight，bw)。其中，秦川牛体尺数据由秦川牛繁殖中心提供，南阳黄牛、郏县红牛的体尺数据由南阳黄牛保种场和郏县红牛保种场提供，鲁西牛的体尺数据由鲁西牛原种场提供。

(4)pcr产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳

a、制作10％聚丙烯酰胺凝胶，点样，200v电压电泳2h后，用dured染色30min；

b、在bio-radgeldoc2000凝胶成像系统成像；

c、根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析各个体indel类型。扩增后电泳结果如图1所示，其中，泳道m为markeri，其余泳道为不同基因型个体pcr后电泳检测片段。

d、不同基因型个体pcr产物测序验证

每个位点随机抽取各个基因型个体10个进行正反向测序；同时，进行indel位置分析，确认插入/缺失序列及其位置，如图2所示，结果表明电泳检测的结果与实际序列分型一致。

(5)中国地方黄牛sh3pxd2b基因indel位点频率统计分析

a、群体遗传学参数

1)基因型频率：一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。pjj＝njj/n，其中pjj代表某一位点的jj基因型频率；njj表示群体中具有jj基因型的个体数；n为检测群体的总数量。

2)等位基因频率：一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：pj＝(2njj+nji1+nji2+nji3+nji4+……+njin)/2n

式中，pj表示等位基因j频率，njj表示群体中具有jj基因型的个体数量，nji1表示群体中具有ji1基因型个体数量，i1－in为等位基因j的n个互不相同的复等位基因。

本发明所涉及的等位基因为i(插入)和d(缺失)，所以具体的基因频率计算公式为：

pi＝(2nii+nid)/2n

pd＝(2ndd+nid)/2n

式中，pi，pd分别表示等位基因i和等位基因d的频率，nii、nid和ndd分别表示ii、id和dd基因型的个体数量，n表示总群体数目。

3)多态信息含量(pic)

pic是衡量基因变异程度高低的一项指标。在一个群体中，pic>0.5表示高度多态，pic<0.25表示低度多态，pic在两者之间表示中度多态。

式中:pi、pj分别指群体中第i、j个等位基因频率，m为等位基因数目。

4)遗传杂合度(he)

遗传杂合度是指特定位点等位基因不相同的可能性。

式中，pi代表群体中第i个等位基因频率，n代表等位基因数目。

5)有效等位基因数(ne)

有效等位基因数指一个基因座上产生与实际群体相同的纯合度所需的等位基因数。

式中：pi代表群体中第i个等位基因频率，n为等位基因数目。

b、统计分析参见表3：

表3.中国地方黄牛sh3pxd2b基因indel群体遗传学参数统计表

(6)indel位点与中国地方黄牛生长性状的关联分析

a、关联分析模型：利用spss18.0软件，分析sh3pxd2b基因不同indel类型对体尺性状表现的影响。所用的线性模型：

yijklmn＝μ+ai+ej+ck+ll+gm+eijklmn

yijklmn为性状观察值(scs)，μ为总体均值，ai为年龄的固定效应，ej为季节的固定效应，ck为产犊次数的固定效应，ll为哺乳次数的固定效应，gm为基因型的固定效应，eijklmn为随机误差。

b、关联分析结果见表4：

表4.sh3pxd2b基因indel位点与中国地方黄牛生长性状的关联分析

注：字母不同表示差异显著

由表4可以看出，对于突变位点一，与优势生长性状相关联的基因型为id杂合型，特别在秦川牛的腹围以及南阳黄牛的腰角宽上优势显著，插入突变与生长性状的优势相关。对于突变位点二，与优势生长性状相关联的基因型为dd突变纯合型，特别在郏县红牛的体重以及南阳黄牛的体重、坐骨端宽上优势显著。

总之，本发明提供的黄牛sh3pxd2b基因插入/缺失标记的检测方法，针对sh3pxd2b基因内含子插入/缺失位点设计特异性引物，pcr扩增目的片段后用10％聚丙烯酰氨凝胶电泳进行个体分型。对于突变位点一(nc_007318.6g.4071212-4071213insaggagtgggtacc)，当该位点发生插入突变时，pcr扩增产物插入aggagtgggtacc序列，ii基因型表现为261bp片段，id基因型表现为261bp和248bp片段，dd基因型表现为248bp片段；对于突变位点二(nc_007318.6g.4088290-4088299deltgtggccaca)，当该位点发生缺失突变时，pcr扩增产物缺失tgtggccaca序列，dd基因型表现为205bp条带，ii基因型表现为215bp条带，id基因型表现为215bp和205bp条带。通过对中国地方黄牛sh3pxd2b基因以上2个indel位点基因型频率和等位基因频率进行检测，有助于快速建立遗传资源优良的地方黄牛种群。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种检测黄牛sh3pxd2b基因插入/缺失标记的方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工合成()

<400>1

tgcgaggaaagactctggt19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工合成()

<400>2

ttgtgaggtttggctgtatg20

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工合成()

<400>3

agtgggttccctctgatttgc21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工合成()

<400>4

ctgcctgtgctgtcctctttg21

<210>5

<211>13

<212>dna

<213>nc_007318.6g.4071212-4071213ins

<400>5

aggagtgggtacc13

<210>6

<211>10

<212>dna

<213>nc_007318.6g.4088290-4088299del

<400>6

tgtggccaca10