LINC01702在制备肝细胞癌的诊断试剂盒中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及linc01702在制备肝细胞癌的诊断试剂盒中的应用。
背景技术：
肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)在所有引起死亡的肿瘤中位居第二。肝硬化是hcc形成的主要危险因素，发生率为80％-90％，而导致肝硬化的主要因素是乙型肝炎病毒感染。目前治疗hcc的主要方法包括手术切除、肝脏移植、辅助治疗和介入治疗等。但hcc在相关症状出现后才能被确诊，导致hcc患者的5年生存率仅7％。hcc术后复发和转移发生是导致生存率低的主要原因。虽然hcc的发生机制尚未清楚，但上皮-间质转化在hcc的形成中发挥重要作用。hcc的传统血清学诊断以甲胎蛋白(crfetoprotein，afp)为主，但15％-58％慢性乙型肝炎患者和11％-47％肝硬化患者血清afp水平也可升高。早期单独测定afp的漏诊率高达40％，晚期仍有30％患者血清afp水平正常。影像学检查虽有较高灵敏性，但准确性取决于鉴别肿瘤性病变与非肿瘤性病变的能力。研究结果表明，长链非编码rna(longnon-codingrna，1ncrna)在hcc发生中发挥重要作用，同时1ncrna有较高组织特异性，在相关肿瘤组织中高度表达，因此，1ncrna有望成为预测hcc的新型标志物和治疗的新靶点。在基因组中少于2％的基因用于编码蛋白质，大部分基因虽被转录但不具备编码蛋白质的功能，这样的转录产物称为非编码rna(non-codingrna,ncrna)。ncrna根据长度不同分为短小ncrna和lncrna。lncrna是一类长度>200nt，不编码蛋白质的分子。lncrna和mrna具有较多共同特点，如:多由rna聚合酶ii转录，经过剪接、多聚腺苷酸化和5’末端加尾而来；但lncrna缺少或极少具有开放阅读框，转录长度短，在细胞内的定位与mrna不同，多位于细胞核处。lncrna转录水平较编码蛋白基因低，稳定性差，但仍有高度保守区域，且这些区域多与肿瘤的发生相关，1ncrna在肿瘤的发生中有重要作用。根据lncrna与编码基因的位置不同，可分为正义(sense)、反义(antisense)、双向(bidirectional)、内含子间(intronic)、基因间(inyergenic)5种。调节机制可能涉及：(1)干扰邻近编码蛋白基因表达；(2)抑制聚合酶ii活性；(3)参与转录后修饰；(4)与功能性蛋白结合；(5)作为小分子rna的前体物质；(6)与染色体结合，通过信号通路调节。lncrna在细胞的生长、凋亡、新陈代谢、机体免疫应答及肿瘤发生中均发挥重要调节作用。因此，lncrna有望成为诊断肿瘤的新型标志物和治疗靶点。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于诊断肝细胞癌的长链非编码rna标志物。本发明利用实验证明linc01702在肝细胞癌组织中的表达水平明显低于在癌旁组织中的水平，因此可以将linc01702作为诊断肝细胞癌的分子标志物。为了实验上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明提供了检测长链非编码rna表达的试剂在制备肝细胞癌诊断产品中的应用。本发明的长链非编码rna在ncbi中的命名为linc01702。属于基因id：102724481编码产物的linc01702具有不同长度的转录本，因此本发明的长链非编码rna-linc01702可以是genbank登录号xr_947471.2(具有1641bp的长度，相应的dna序列如seqidno.1所示)、genbank登录号xr_947473.2(具有1573p的长度，相应的dna序列如seqidno.2所示)、genbank登录号xr_426708.3(具有1080p的长度，相应的dna序列如seqidno.3所示)、中的任意一个或者多个。进一步，所述试剂包括利用sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测linc01702表达量时使用的pcr扩增引物。在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如seqidno.4和seqidno.5所示。本发明提供了一种用于肝细胞癌诊断的产品，所述产品包括检测linc01702表达水平的试剂。进一步，所述试剂包括sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测linc01702表达量时使用的pcr扩增引物。在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如seqidno.4和seqidno.5所示。进一步，前面所述的产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断肝细胞癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的rna表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的rna表达谱，容易分析出哪个rna的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知linc01702的异常表达与肝细胞癌相关也属于linc01702的用途，同样在本发明的保护范围之内。所述试剂盒包括检测linc01702表达量的试剂，所述试剂包括与linc01702或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测linc01702表达量时使用的pcr扩增引物。所述芯片包括检测linc01702表达量的试剂，所述试剂包括与linc01702或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测linc01702表达量的探针。所述试纸包括检测linc01702表达量的试剂，所述试剂包括与linc01702或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测linc01702表达量的探针。本发明提供了一种用于抑制肝细胞癌的药物组合物，所述药物组合物包括linc01702的激动剂。进一步，所述激动剂不受限制，只要是可以促进linc01702表达水平或促进linc01702功能活性即可。所述激动剂包括linc01702本身，或者能够表达linc01702的载体，促进性mirna、促进型转录调节因子、促进型小分子化合物。本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。本发明还提供了前面所述的长链非编码rna在制备治疗肝细胞癌的药物中的应用。本发明还提供了前面所述的激动剂在制备治疗肝细胞癌的药物中的应用。本发明还提供了一种诊断肝细胞癌的方法，所述方法包括如下步骤：(1)获取受试者的样品；(2)检测样品中linc01702的表达水平；(3)将测得的linc01702的表达水平与受试者是否患病关联起来；(4)与正常人群相比，linc01702的表达水平显著降低，则该受试者被判断已患有肝癌，或者将来患有肝癌的风险高。本发明还提供了一种肝细胞癌的抑制方法，所述方法包括促进linc01702表达量或者促进linc01702的功能活性。本发明还提供了一种治疗肝细胞癌的药物的筛选方法，可以通过在对肝细胞癌细胞添加测试药物后的某个时期测量linc01702的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤发展的效果。更具体地说，当linc01702的表达水平在添加或施用测试药物后升高时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为治疗肝细胞癌的治疗药物。本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。本发明的优点和有益效果：本发明的发现了一种诊断肝细胞癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在肝细胞癌发生早期即可作为判断，提高了患者的生存率。本发明的包括linc01702的激动剂的治疗药物可用作新的治疗肝细胞癌的治疗药物。附图说明图1显示利用qpcr检测linc01702在肝细胞癌组织和癌旁组织中表达情况的统计图。具体的实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1筛选差异表达非长链编码rna1、研究对象本研究通过医院伦理委员会审查和批准，所有患者入组前均签署书面知情同意书。4对肝癌组织和癌旁组织标本均来自医院行肝切除术治疗的患者。实验对象纳入标准如下所示：1)经病理学检查证实为肝细胞癌；2)第一次接受肝切除术，之前未接受过化疗、栓塞、射频等治疗；3)患者自愿参加本研究，并能配合完成相关检查；实验共纳入4名肝细胞癌患者，肝细胞癌组织和癌旁非肿瘤肝组织切取自肝切除术的手术标本。病历资料完整，均于术后经医院病理科病理检查证实为肝细胞癌。组织标本于手术后立即切取，置于液氮内转运，储存于-80℃冰箱内。2、组织rna总提取参照mirvanatmisolationkit(appliedbiosystems,fostercity,ca,usa)说明书提取组织总rna。(1)加入10倍体积的lysis/bindingbuffer(1mllysis/bindingbuffer/0.1g组织)匀浆器彻底混匀。(2)加入1/10体积的homogenateadditive，涡旋混匀，冰上放置10分钟。操作均在冰上进行。(3)加入与lysis(不计homogenateadditive)相同体积的acid-phenol：chloroform(300μ1lysis/300μ1acid-phenol：chloroform)，涡旋30-60秒，室温10,000g离心5分钟，如分相不好，则重新离心。取上清置一新管中，记体积。(4)加入1.25倍体积100％乙醇，涡旋混匀，反复过纯化柱，体积不超过700μ1，室温10,000g离心15秒。(5)加入350μ1wash1，离心5-10秒，清洗纯化拄，室温10,000g离心15秒，弃过滤液。(6)dnasei10μl和bufferrdd70μl加入膜上(qiagen#79254)，20-30℃放置15分钟。(7)加入350μ1wash1，离心5-10秒，清洗纯化拄，10,000g离心15秒，弃过滤液。(8)加入500μ1wash2/3，离心5-10秒，清洗纯化柱二次，10,000g离心15秒，弃过滤液，离心1分钟。(9)将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加入100μ195℃预热的elutionsolution或nuclease-free水，室温最高转速离心20-30秒，收集管中液体即为提取的totalrna，放置在-70℃保存。(10)rna的检测：取1μ1rna样品利用nanodrop2000分光光度计(thermoscientific,usa)测定浓度及od260/od280，琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。3、芯片检测lncrna+mrna表达谱芯片检测以待检测样品的总rna为起始，进行体外扩增和荧光标记，标记过程采用生物芯片通用标记试剂盒。主要包括如下步骤：(1)反转录合成第一链cdna：以totalrna起始，含有t7启动子序列的t7oligo(dt)primer和t7-随机引物，既可以结合带poly(a)的mrna，也可以结合除rrna以外其它不带poly(a)的rna，使用第一链enzymemix合成第一链cdna。(2)合成第二链dna：用第二链enzymemix将dna-rna杂合体中的rna链转化为第二链cdna，合成双链dna。(3)体外转录合成crna：以第二链cdna为模板，利用t7enzymemix合成crna。(4)crna纯化：使用rna纯化柱纯化crna，除去反应中的盐、酶等试剂，并对crna进行定量、质控。(5)反转录：以crna为模板，randomprimer为引物，cbcscriptⅱ酶进行反转录。纯化回收反转录得到的cdna并定量。(6)标记：以反转录的cdna产物为模板，randomprimer为引物，用klenowfragment酶合成cdna互补链并掺入带有荧光基团的dntp(cy3-dctp、cy5-dctp)，纯化并定量标记产物。带有荧光基团dna即可用于芯片杂交。(7)芯片杂交及清洗：取1μlcdna溶于杂交液，45℃杂交过夜。取出芯片在博奥slidewasher8芯片洗干仪进行清洗，清洗程序如下：洗液i：0.2％sds，2×ssc,42℃120s清洗2遍。洗液ii：0.2％sds，2×ssc,42℃80s清洗3遍。清洗程序完成后，离心甩干，待扫描。(8)芯片扫描，数据分析，差异基因筛选：使用agilent芯片扫描仪(g2565ca)对清洗后的芯片进行扫描，得到杂交图片。使用agilentfeatureextraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据。然后使用agilentgenespring软件对数据进行归一化和差异分析，并用genespringgx软件进行差异基因筛选。4、结果筛选标准：p<0.01，abs(log2(foldchange))>2，共筛选出311个差异表达lncrna，其中204个上调，107个下调。实施例2大样本验证筛选出的差异表达lncrna基于实施例1的筛选结果，根据pvalue的大小，选择linc01702进行验证。1、样本收集按照实施例1的方法收集肝细胞癌组织36例，相应的癌旁组织36例。2、在转录水平上进行验证2.1提取组织rna步骤同实施例1。2.2引物设计根据linc01702转录本序列，通过ncbi的引物设计工具(primerblast)设计引物，该引物是linc01702三种转录本的通用引物，引物序列如下所示：上游引物：5’-ggcaatggagaatataaag-3’(seqidno.4)；下游引物：5’-ttcatcttgtcactactt-3’(seqidno.5)。根据snu6序列设计引物，上游引物：5’-ctcgcttcggcagcacatatact-3’(seqidno.6)；5’-acgcttcacgaatttgcgtgtc-3’(seqidno.7)。2.3cdna合成以提取的总rna(1μg)为模板，加入以下反应体系，具体为：buffer4μl，rtenzymemix1μl，oligodtprimer(50μm)1μl，random6mers(100μm)1μl，以无rna酶的ddh2o将反应体积补足为20μl。将上述混合液置于37℃15min，85℃5s，即获得cdna。该cdna可用于lncrnareal-timepcr检测。2.4real-timepcr采用北京康润诚业生物科技有限公司2×realstarpowersybrmixtureung荧光定量试剂盒(货号a312)，以反转录的cdna为模板进行荧光定量pcr扩增。荧光定量pcr体系如表1所示。表1荧光定量pcr体系试剂用量2*mix10μl50*rox2μl引物各1μldna模板1μlrnasefree水补齐至20μl荧光定量pcr程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃30s，60℃30s。根据qrt-pcr的相对定量公式：2-△ct，分别计算出linc01702在肝细胞癌患者癌组织和癌旁组织中的表达水平。本实验结果显示：linc01702在36例肝细胞癌组织中相比癌旁组织，32例中下调，阳性检出率＝下调表达例数/总检测例数×100％＝32/36＝88.9％。统计结果如图1显示，与肝细胞癌组织相比，癌旁组织中linc01702表达水平显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。以上结果说明，linc01702在肝细胞癌组织中普遍低表达。linc01702可以作为肝细胞癌诊断的新肿瘤标志物，用于肝细胞癌的筛查。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。序列表<110>泰山医学院,泰山医学院附属医院<120>linc01702在制备肝细胞癌的诊断试剂盒中的应用<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1641<212>dna<213>人源(homosapiens)<400>1tacaggcatacgccaccgcacctggcccaaattattaattgtacgtattctcattgttct60gcttcttccaagaaaactgaagtcacggtattctgaagactagagatgattcaacaggct120gtgaatctattccatttggaatcctactgggcctgatctgttttccattgccaaggcact180gctgtttaagctataccatatgaagcaccctccctaaaggctcaggggccatagtgaaag240aggacacatgggattgtaagagccagattatgggggtggagggtaaaggctgaagcaagt300ccatcttggatgctaactcactatgttagcttctgattaaccccagttccaggaaggctg360ctgaaatttccagtttatgtgttgttccttgtgtaagagcatggacttactgcaaatcct420gcccttagggcaaattcctacctattcctgcggaagcatgtgtatcattcccctatggtt480tataacccctgagtctgggggtaatggcacggggacccaccagcttgtctgccgccatct540ggggtacagtgctggaagcggggatacagggacaaataagacacagatcctgttcctaaa600gagagtcttttctaaggcaccaactacttccttcaagcagcagccagagatctttgctta660atggctgagaaacacagaggagagacccagagagaaggagaaggccgcatgaagatggag720cagagactggagttattcagccaagtcaaggaatgcctggagcaccagaagccggaagag780gcaaggaaggatcctcccttagagcatttggaagagtgtggccctgccaacaccttgact840tcaaacttctggcctccataactatgaaataaattcttgttgttttaagccaccaagttt900gtggtaacttcttacagcaaccctaggaaattaacacacagagtgtcagttacctaaaca960ttgtgagcctcagttaccttatctgaaaatggggctaaaacttagacctaccttttaggg1020ctgctttaaggagtaatagaaattatacatgggaattacatggcaccaagttgttcctta1080atagagggaaactgttatgatggcggaagagcagtaatgaaatactgaattcatccagca1140gatggcagaagatggatttgcaaacaagaggacttcataaggtttgctgcccagcaatgc1200agctccaggcctaaagtagccttcctagctcacagactgatgaggattaaccctcgccaa1260ctcaagtgtgctctcagctctgtagaaactaaactaattctgttttcctttgaccattgt1320acaccacagaggctggcaatggagaatataaagagtggtgcaacagaaaatacctgggtt1380ctaggctcagctctgtcacctcattaggattcagtttgcccatctgtaaagtagtgacaa1440gatgaaataccaagtgtaacgtaattaaagggctgttgtgataccaaaataacataatgt1500gtaaaagtgctaaaaacaagatgccataaagcacagaaggggcccaggagagattaattc1560atggagaacttactcgtttttttgagacagagtctcactgtgttgctcaggctgcagtgc1620agtggcgcgatctcagctaac1641<210>2<211>1573<212>dna<213>人源(homosapiens)<400>2tacgccaccgcacctggcccaaattattaattgtacgtattctcattgttctgcttcttc60caagaaaactgaagtcacggtattctgaagactagagatgattcaacaggctgtgaatct120attccatttggaatcctactgggcctgatctgttttccattgccaaggcactgctgttta180agctataccatatgaagcaccctccctaaaggctcaggggccatagtgaaagaggacaca240tgggattgtaagagccagattatgggggtggagggtaaaggctgaagcaagtccatcttg300gatgctaactcactatgttagcttctgattaaccccagttccaggaaggctgctgaaatt360tccagtttatgtgttgttccttgtgtaagagcatggacttactgcaaatcctgcccttag420ggcaaattcctacctattcctgcggaagcatgtgtatcattcccctatggtttataaccc480ctgagtctgggggtaatggcacggggacccaccagcttgtctgccgccatctgggagtct540tttctaaggcaccaactacttccttcaagcagcagccagagatctttgcttaatggctga600gaaacacagaggagagacccagagagaaggagaaggccgcatgaagatggagcagagact660ggagttattcagccaagtcaaggaatgcctggagcaccagaagccggaagaggcaaggaa720ggatcctcccttagagcatttggaagagtgtggccctgccaacaccttgacttcaaactt780ctggcctccataactatgaaataaattcttgttgttttaagccaccaagtttgtggtaac840ttcttacagcaaccctaggaaa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