本发明涉及一种固定化l-酪氨酸解氨酶的方法及其应用，属于生物工程领域。
背景技术
对羟基肉桂酸，又称香豆酸。广泛存在于自然界植物中，尤其豆科植物含量居多。对羟基肉桂酸广泛应用于医药、食品、日用品、化工、饲料等领域。现在多用于香料或作为饮料的酸化剂，也可作为油脂的抗氧化剂。在医药工业中，它是许多医药品的原材料，如合成抗肾上腺素药艾司洛尔。此外，对羟基肉桂酸还在医药中作酸化剂和医学上用作多价鳌合剂，也是化学中间体，如用于祛痰新药杜鹃素的合成；用作生产冠心病治疗药物可心定的中间体，以及用于制造局部麻醉剂、杀菌剂和止血药等；它还具有抑制子宫颈癌的作用。在农业方面，用于生产植物生长促进剂、长效杀菌剂和果蔬保鲜防腐剂。在化学工业方面，对羟基肉桂酸是很重要的香精香料，主要用于配置香辛樱桃、杏、蜂蜜等香料。在日化行业中用于配制香皂和化妆品香精。在化妆品方面，对羟基肉桂酸对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活性均有抑制作用，导致单酚酶活力和二酚酶活力下降50％，用在化妆品里面抑制黑色素的生成。此外，对羟基肉桂酸还是一种强效的导电材料，在液晶显示器工业中近年来研究广泛。通过羟基聚酰亚胺与对羟基肉桂酸的接枝反应合成了具有光敏性的对羟基聚酰亚胺，并通过红外、核磁确定了光敏性对羟基聚酰亚胺的结构。将合成的对羟基聚酰亚胺作为液晶取向层用在液晶显示器件中，证明有良好的热稳定性。近年来，国内外很多科学家还致力于将对羟基肉桂酸研究扩展到微生物和医学领域——细胞分化及端粒酶活性的影响。
在对羟基肉桂酸的合成方法中，目前有以下几种：天然提取法难度大、成本高，且产率极低；以往的合成工艺中采用对羟基苯甲醛与丙二酸为原料，按照knoevenagel-doebner反应合成了对羟基肉桂酸，但收率低，收率仅为50％；以对羟基苯甲醛和丙二酸、吡啶、哌啶在微波条件下进行反应，收率虽有提高，但是原材料的成本相应提高，实现工业化生产较为复杂。目前还不见国内外对酶法生产对羟基肉桂酸的工艺。
技术实现要素：
本发明针对上述现有技术的不足，提供一种绿色环保的固定化l-酪氨酸解氨酶的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种固定化l-酪氨酸解氨酶的方法，步骤如下：
(1)反应液的制备：称取海藻酸钠3g溶解于150-250ml去离子水中，充分溶解形成胶体溶液，再加入0.03-0.07g聚乙二醇，充分搅拌均匀；
所述海藻酸钠质量浓度为1-5％；
(2)酶的固定化：将步骤(1)得到的反应液和酶活力100～500u/ml的l-酪氨酸解氨酶缓冲液混合，置于37℃水浴中充分搅拌混匀后，放入4℃冰箱静置1h后，用带有针头的蠕动泵滴入1l的氯化钙溶液中，立即形成凝胶球；滤除凝胶球，再次加入1l的氯化钙溶液中，置于4℃冰箱静置硬化1.5h；然后加入一定量的戊二醛，在振荡器上震荡30min，置于4℃冰箱静置交联3h；抽滤并用氯化钠质量分数为0.9％的溶液洗涤；储存于4℃冰箱保存；
所述反应液和所述l-酪氨酸解氨酶缓冲液的质量比为2:1。
优选地，所述聚乙二醇分子量为2000、4000或6000。
优选地，所述酶活力100～500u/ml的l-酪氨酸解氨酶缓冲液的制备方法：将酶活力单位为5000u/g～10000u/g的l-酪氨酸解氨酶50-100mg溶解于250mlph6.0的磷酸缓冲液中，制得酶活力100～500u/ml的l-酪氨酸解氨酶缓冲液。
优选地，所述用带有针头的蠕动泵滴入1l的氯化钙溶液中，立即形成凝胶球具体为：用带针头的蠕动泵10-15cm处逐滴滴入1l的氯化钙溶液中，速度每2.5s/滴，得到直径2-3mm的光滑凝胶球；所述氯化钙质量分数为2-3％。
优选地，所述戊二醛质量浓度为0.2-1％。
本发明还提供一种成本低、杂质少、污染少、工艺简单、收率高、反应条件温和的对羟基肉桂酸的合成工艺，步骤为：
(1)催化：以l-酪氨酸为底物，调节ph8.0-9.0，温度控制在37-45℃；加入固定化的l-酪氨酸解氨酶，通风搅拌反应5-8h，生成对羟基肉桂酸反应液；
(2)提取：将所述对羟基肉桂酸反应液抽滤除去固定化酶，用氯化钠质量分数为0.9％的溶液洗涤，放4℃冰箱保存；清液调节ph到5.5，析出剩余酪氨酸，抽滤，然后活性炭60℃解色30min，抽滤除碳，清夜搅拌用盐酸调节ph至0.8-1.2，降温搅拌结晶，抽滤烘干，得对羟基肉桂酸晶体。
优选的，所述l-酪氨酸底物浓度为2％，流加l-酪氨酸固体6％，温度控制在40℃，ph为8.5，固定化的l-酪氨酸解氨酶量为30g/l。
有益效果：本发明采用酪氨酸解氨酶生产对羟基肉桂酸，用海藻酸钠做固定化酶的载体，以聚乙二醇为致孔剂，对载体进行处理，以戊二醛为交联剂，对固定化酶进行交联，有效的提高了固定化酶的稳定性，提高了循环使用次数，进一步调节了载体中孔的大小密度，制备出了具有多孔结构的固定化酶，提高了单位酶活。本发明所制备的固定化酶保持游离酶活的98％以上，同时固定化酶的稳定性和可重复利用性也大大提高，在4℃下可保存100天，可重复使用100次以上，为其在工业上的应用提供了广泛前景。
附图说明
图1为本发明的产物对羟基肉桂酸液相图；
图2为本发明不同分子量的聚乙二醇对固定化酶的循环次数以及相对活性的影响图；
图3为本发明不同海藻酸钠浓度对固定化酶的循环次数以及相对活性的影响图；
图4为本发明不同氯化钙浓度对固定化酶的循环次数以及相对活性的影响图。
具体实施方式
实施例1
一种固定化l-酪氨酸解氨酶的方法，步骤包括：
(1)反应液的制备
称取3g的海藻酸钠溶解于200ml去离子水中，充分溶解形成胶体溶液，加入0.05g的2000分子量的聚乙二醇，充分搅拌均匀。
(2)酶液的制备
将酶活力单位为1000u/g～10000u/g的l-酪氨酸解氨酶50mg-100mg溶解于100mlph6.0的磷酸缓冲液中，制得酶活力50～500u/ml的l-酪氨酸解氨酶缓冲液。
(3)酶的固定化
将步骤(1)得到的反应液和步骤(2)得到的酶液混合，置于37℃水浴中充分搅拌混匀后，放入4℃冰箱静置1h；用带有针头的蠕动泵滴入质量分数为2％的1l氯化钙溶液中，滴加速度为3s/滴，立即形成凝胶球；滤除凝胶球，加入新的氯化钙溶液中，置于4℃冰箱静置硬化1.5h；然后加入质量分数为0.5％的戊二醛，在振荡器上震荡30min，置于4℃冰箱静置交联3h；抽滤并用氯化钠质量分数为0.9％的溶液洗涤，重复三次，每次用500ml，洗去聚乙二醇及其他杂质；储存于4℃冰箱保存。
本发明酶活力单位的定义：一个酶活力单位是指在一定实验条件(ph8.5、40℃)下，1分钟内转化1微摩尔l-酪氨酸的酶量，称为一个酶活力国际单位(iu，又称u)。
本发明固定化酶的相对活力是指在同组实验中以最高的为100，其余的酶活与之相比，以百分数相比。
实施例2
一种固定化l-酪氨酸解氨酶的方法，工艺同实施例1。不同之处仅在于，加入的是4000分子量的聚乙二醇。
实施例3
一种固定化l-酪氨酸解氨酶的方法，工艺同实施例1。不同之处仅在于，加入的是6000分子量的聚乙二醇。
如图2所示，不同分子量的聚乙二醇对固定化酶的循环次数以及相对活性的影响，用分子量为4000的聚乙二醇作为致孔剂，相对酶活力最高，在循环使用80次的情况下，酶活力回收超过75％。
实施例4
一种固定化l-酪氨酸解氨酶的方法，工艺同实施例2。不同之处仅在于，加入的是6g的海藻酸钠。
实施例5
一种固定化l-酪氨酸解氨酶的方法，工艺同实施例2。不同之处仅在于，加入的是9g的海藻酸钠。
如图3所示，不同海藻酸钠浓度对固定化酶的循环次数以及相对活性的影响，当海藻酸钠质量体积比为2％时相对酶活力最高，在循环使用80次的情况下，酶活力回收超过78％。
实施例6
一种固定化l-酪氨酸解氨酶的方法，工艺同实施例3。不同之处仅在于，酶的固定化步骤中，用带有针头的蠕动泵滴入质量分数为2％的1l氯化钙溶液中，滴加速度为3s/滴和2.5s/滴，立即形成凝胶小球。
实施例7
一种固定化l-酪氨酸解氨酶的方法，工艺同实施例3。不同之处仅在于，酶的固定化步骤中，用带有针头的蠕动泵滴入质量分数为3％的1l氯化钙溶液中，滴加速度为2.5s/滴，立即形成凝胶小球。
如图4所示，不同氯化钙浓度对固定化酶的循环次数以及相对活性的影响，当氯化钙质量体积比为3％时相对酶活力最高，在循环使用80次的情况下，酶活力回收超过78％。
实施例8
一种采用固定化l-酪氨酸解氨酶合成对羟基肉桂酸的工艺，以初始浓度是2-5％的l-酪氨酸为底物，调节ph8.0-9.0，温度控制在37-45℃。加入固定化的l-酪氨酸解氨酶30-80g/l，通风搅拌反应5-8h，生成对羟基肉桂酸反应液。
对本发明催化条件进行优化，经过优化实验，得出最优催化条件：l-酪氨酸初始浓度为2％，流加6％，ph维持8.5，温度40℃，，固定化的l-酪氨酸解氨酶量为30g/l(湿重)，通风搅拌反应8h，l-酪氨酸可反应完全。此条件下，l-酪氨酸反应量最高，反应速度快，且底物无残留。
实施例9
将实施例8得到的对羟基肉桂酸反应液抽滤除去固定化酶，用500ml氯化钠质量分数为0.9％的溶液洗涤，重复洗涤3次，洗去聚乙二醇及其他杂质，放4℃冰箱保存。清液用3mol的盐酸调节ph到5.5，析出剩余酪氨酸，抽滤，然后1％的活性炭60℃解色30min，抽滤除碳，清夜继续用盐酸调节ph至0.8-1.2，降温搅拌结晶，4℃冰箱静置育晶3h，抽滤，去离子水冲洗，60℃真空烘干，得对羟基肉桂酸晶体。
根据液相测定对羟基肉桂酸的含量，液相分析条件如下：流动相为甲醇和乙酸的混合液，甲醇：1％乙酸＝20:80，柱型：c18250×4.6×5μm，波长：310nm，柱温20℃，流速：1ml/min。进样10μl。
经测定，对羟基肉桂酸含量为99％以上，摩尔收率超过90％。
本发明公布的固定化酶法生产对羟基肉桂酸成本低、杂质少、污染少、工艺简单、收率高、反应条件温和，且采用海藻酸钠作为固定化酶载体进行生产，在当前环保压力大日益增加的情况下，对大规模生产非常有利。
本发明所制备的的固定化酶保持游离酶活的98％以上，同时固定化酶的稳定性和可重复利用性也大大提高，在4℃下可保存100天，可重复使用100次以上。减少了对环境的污染，简化的生产工艺，提高了固定化酶的单位酶活及循环使用次数。生产的对羟基肉桂酸质量好，基本实现三废的零排放，为其在工业上的应用提供了广泛前景。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。