技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别是vps10基因在发酵末期胁迫条件下适合低蛋白酶a外泌的酵母菌株中的应用。
背景技术：
在纯生啤酒发展的过程中，一些有关纯生啤酒的质量问题一直困扰着酿造工程师，其中纯生啤酒的泡沫稳定性问题尤为突出。由于纯生啤酒在包装前未经过巴氏灭菌，在发酵末期，氮源不足，高的酒精和二氧化碳浓度会给酵母造成一个胁迫环境，导致蛋白酶a的外泌，分解泡沫阳性蛋白，降低啤酒泡持性，对纯生啤酒的泡沫质量产生不利影响。因此，提高纯生啤酒的泡沫稳定性，成为当今世界改善纯生啤酒质量的一个重大技术难题。
虽然，通过优化发酵工艺，或者添加泡沫稳定剂能够从一定程度上改善啤酒泡沫稳定性，但是这种方法都不能从源头上解决泡沫衰减问题。基因工程上通过敲除产生蛋白酶a的基因pep4来降低蛋白酶a外泌，从而使啤酒的稳定性增加。但是，由于胞内蛋白酶a对酿酒酵母细胞的生理生化功能有很重要的作用，例如参与液泡内多种酶的成熟和激活过程；影响细胞内一些糖代谢酶的正常表达等。所以pep4缺失菌株的发酵特性会受到胞内蛋白酶a缺失的影响。
正常代谢条件下酿酒酵母蛋白酶a的分泌过程是，前蛋白酶a原(prepropra)在粗面内质网合成后，先经过内质网的修饰和折叠，再运输到高尔基体，最终被液泡分选受体定向运输至液泡并在液泡中形成成熟的蛋白酶a(pra)。但是随着发酵后期各种营养物质缺乏、氮源不足等胁迫条件下就会错误地运送到胞外，并在胞外被激活。
正常代谢条件下，vps10作为编码液泡分选受体的基因，在蛋白酶a从高尔基体向液泡定向分泌的过程中起着重要作用。当蛋白酶a原前肽上的识别位点与分选受体特异性结合，蛋白酶a原从反面高尔基体网络被输送至液泡，并在到达液泡后被激活，由54个氨基酸残基组成的前肽被切除，最后形成分子量约42kd活性蛋白酶a。
然而，目前对于在胁迫条件下，通过调控液泡分选受体的表达量来控制蛋白酶a的内外分泌的研究报道很少，尤其是在选育低蛋白酶a外泌的酵母菌株的研究方面更是空白，因此，本发明通过设置一个氮源缺乏，并且高的酒精和二氧化碳浓度的胁迫环境，来模拟啤酒发酵后期的发酵条件，分别敲除和过表达vps10基因，来调控液泡受体表达量，进而选育出适合发酵的低产蛋白酶a菌株，这种方法对于提高啤酒泡沫稳定性，尤其是纯生啤酒的泡沫稳定性具有指导意义。
技术实现要素：
本发明所述的调控蛋白酶a胞内外分泌的新方法是通过过表达酿酒酵母出发菌株中编码液泡分选受体的vps10基因全序列，获得低蛋白酶a酿酒酵母菌株。
所述vps10基因其geneid为：852264，核苷酸序列如序列表中seqidno:1所示。
优选的，所述酿酒酵母出发菌株为模式菌株w303-1a；
所述低蛋白酶a分泌的酿酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)先将ppgk1质粒上的强启动子pgk1p-pgk1t片段插入到yep352表达载体上，再将vps10基因插入到启动子pgk1p和终止子pgk1t之间，最后将kanmx抗性标记插入表达质粒。
(2)将重组表达质粒导入到出发菌株中,得到过表达vps10的重组菌株wgv10。
具体如下：
(1)yep-pvk质粒的构建
①以ppgk1质粒为模板，pcr扩增出强启动子pgk1p-pgk1t基因片段；
②以酵母出发菌株w303-1a总dna为模板，pcr扩增出vps10基因；
③以puc6质粒为模板，pcr扩增出kanmx抗性基因；
将pcr产物依次连接到yep352表达载体上，得到重组质粒yep-pvk；
(2)vps10过表达菌株的构建
将游离过表达质粒yep-pvk通过醋酸锂转化法导入到出发菌株w303-1a中，得到vps10游离过表达重组菌株。
所述重组菌株可通过上述方法构建获得，这些方法已有许多文献报道，如josephsambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。也可用本领域已知的其它方法来构建基因突变的酵母菌株。
本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述低分泌蛋白酶a酿酒酵母菌株的基因序列，该基因序列是以所述低分泌蛋白酶a酿酒酵母菌株基因组为模板扩增的特异性片段，该特异性片段的核苷酸序列如序列表中seqidno:2所示。
本发明所获得的过表达菌株，在氮源缺乏麦芽汁中发酵，发酵液中蛋白酶a的酶活与出发菌株相比明显降低，且其他发酵性能未受影响。
有益效果：
1、本发明通过啤酒发酵实验验证vps10敲除和过表达对蛋白酶a内外分泌及发酵特性的影响，确定了vps10在蛋白酶a从反面高尔基体向液泡运输过程中起着重要的分选作用，为该领域的研究奠定了理论基础。
2、过表达vps10基因测定胞内外酶活，在发酵结束时，胞内酶活提高了1.47倍；而胞外酶活降低到出发菌株的61％，同时发酵特性跟出发菌株相比基本没有明显影响，为指导啤酒产业减低胞外蛋白酶a酶活，提高泡沫稳定性提供了新的思路和方法。
附图说明
图1重组质粒puc-vabk的构建流程示意图；
图2重组质粒puc-vabk的验证电泳图；
其中泳道m为5000bpdnaladdermarker；泳道1为以puc-vabk为模板，va-u和vb-d为引物，pcr验证966bp上同源臂va；泳道2为以puc-vabk为模板，vb-u和vb-d为引物，pcr验证1050bp下同源臂vb；泳道3为以puc-vabk为模板，kan-u和kan-d为引物，pcr验证1613bpkanmx标记基因；泳道4为以puc-vabk为模板，va-u和vb-d为引物，扩增到的3629bp重组盒va-loxp-kanmx-loxp-vb。
图3基因盒va-kanmx-vb片段与酵母基因组的同源重组示意图；
图4vps10缺失重组菌株验证；
其中泳道m为5000bpdnaladdermarker；泳道1,2以va-s和kv-x为引物进行验证；泳道3,4以kv-s和vb-x为引物进行验证；其中，泳道1,3的模板为出发菌株w303-1a，均不能扩增出条带；泳道2,4的模板为缺失突变菌株wδvps10，可以分别扩增出1835bp，2498bp大小的条带。
图5重组质粒yep-pvk的构建流程示意图；
图6重组质粒yep-pvk的验证电泳图；
其中泳道m为5000bpdnaladdermarker；泳道1为以yep-pvk为模板，vps10-u和vps10-d为引物，pcr验证4740bp的vps10基因片段；泳道2为以yep-pvk为模板，kan-u和kan-d为引物，pcr验证1613bp的kanmx基因片段；泳道3为以yep-pvk为模板，pg-s和vp-x为引物，pcr验证vps10的连接方向，产物大小为1681bp；
图7vps10游离过表达菌株提酵母质粒验证图
其中泳道m为5000bpdnaladdermarker；泳道1，2以pg-s和vp-x为引物进行验证；其中泳道1的模板为出发菌株w303-1a，不能扩增出条带；泳道2的模板为过表达菌株wgv10，可扩增出1681bp大小的特异性条带。
图8缺失突变菌株和出发菌株胞内、外酶活变化趋势；
图9过表达菌株和出发菌株胞内、外酶活趋势；
图10发酵过程中过表达菌株和出发菌株α-氨基氮和好糖速率变化趋势。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所使用的实验室酵母菌体是可以采用任何来源的酿酒酵母单倍体菌株。
实施例1：缺失突变菌株的构建
(1)puc-vabk质粒的构建
重组质粒puc-vabk的构建流程如图1所示。
①以酵母出发菌株w303-1a总dna为模板，pcr扩增出vps10基因的上游序列va；
上游引物va-u：ccggaattcgagtttatgagaaggttggagg(seqidno:3)
下游引物va-d：cggggtaccaaagacccgagtagttggag(seqidno:4)
划线部分为酶切位点；
pcr反应条件：95℃5min；94℃45s；63℃1min；72℃60s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
pcr反应体系(20μl)
将pcr产物连接到含有amp抗性的puc19质粒载体上，获得重组质粒puc-va。
②以酵母出发菌株w303-1a总dna为模板，pcr扩增出vps10基因的下游序列vb；
上游引物vb-u：cgcggatccagaataagaaaaggcagata(seqidno:5)
下游引物vb-d：cgctgcagacaagttcccataccaaaat(seqidno:6)
划线部分为酶切位点
pcr反应条件：95℃5min；94℃45s；60℃1min；72℃60s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
将pcr产物连接到重组质粒puc-va上，得到重组质粒puc-vab。
③以puc6质粒为模板，pcr扩增出kanmx抗性基因；
上游引物kan-u：ggggtacccagctgaagcttcgtacgc(seqidno:7)
下游引物kan-d：cgggatccgcataggccactagtggatctg(seqidno:8)
划线部分为酶切位点
pcr反应条件：95℃5min；94℃45s；61℃1min；72℃90s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
将pcr产物连接到重组质粒puc-vab上，得到重组质粒puc-vabk，图2为重组质粒pcr验证图。
(2)vps10缺失菌株的构建
基因盒va-kanmx-vb片段与酵母基因组重组过程如图3所示。
以重组质粒puc-vabk为模板，pcr扩增获得长达3629bp重组盒va-kanmx-vb，用醋酸锂转化法分别将其转化入酿酒酵母w303-1a中，得到同源重组后的酿酒酵母vps10缺失菌株wδvps10，并保存菌株。
将重组菌株wδvps10进行pcr验证，以缺失重组菌株wδvps10的基因组为模板，va-s/kv-x为引物进行pcr扩增。pcr反应条件：95℃5min；94℃45s；52℃1min；72℃100s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，可得到1835bp的特异性条带(seqidno:19)，而出发菌株基因组不能扩增出片段。以缺失重组菌株wδvps10的基因组为模板，kv-s/vb-x为引物进行pcr扩增。pcr反应条件：95℃5min；94℃45s；50℃1min；72℃150s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，可得到2498bp的特异性条带(seqidno:20)，而以出发菌株基因组为对照不能扩增出片段。结果表明，在酵母基因组中实现了vps10基因的替换。图4为vps10缺失重组菌株验证。
缺失菌株wδvps10的两对特异性验证引物：
上游引物va-s：cctccttagcagtaatcctc(seqidno:9)
下游引物kv-x：agaacctcagtggcaaatcc(seqidno:10)
上游引物kv-s：tctcacatcacatccgaaca(seqidno:11)
下游引物vb-x：gattcacttttaccagacgc(seqidno:12)
实施例2：过表达菌株的构建
(1)yep-pvk质粒的构建
重组质粒yep-pvk的构建流程如图5所示。
①以ppgk1质粒为模板，pcr扩增出强启动子pgk1p-pgk1t基因片段；
上游引物pgk-u：cgcggatcctctaactgatctatccaaaactga(seqidno:13)
下游引物pgk-d：cgcgtcgactaacgaacgcagaattttc(seqidno:14)
划线部分为酶切位点
pcr反应条件：95℃5min；94℃45s；61℃1min；72℃100s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
将pcr产物连接到表达载体yep352上，获得重组质粒yep-p。
②以酵母出发菌株w303-1a总dna为模板，pcr扩增出vps10基因；
上游引物vps10-u：tccagatctcctcgagatgatattacttcattttgtctattc(seqidno:15)
下游引物vps10-d：tcgcagatccctcgagctactggttttcgttagatggcgc(seqidno:16)
划线部分为酶切位点
pcr反应条件：95℃5min；94℃45s；60℃1min；72℃5min，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
将pcr产物连接到重组质粒yep-p上，得到重组质粒yep-pv。
③以puc6质粒为模板，pcr扩增出kanmx抗性基因；
上游引物kan-u：ggggtacccagctgaagcttcgtacgc(seqidno:7)
下游引物kan-d：cgggatccgcataggccactagtggatctg(seqidno:8)
划线部分为酶切位点
pcr反应条件：95℃5min；94℃45s；61℃1min；72℃90s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
将pcr产物连接到重组质粒yep-pv上，得到重组质粒yep-pvk，图6为重组质粒pcr验证图。
(2)vps10过表达菌株的构建
将游离过表达质粒yep-pvk通过醋酸锂转化法导入到出发菌株w303-1a中，得到vps10游离过表达重组菌株wgv10，并保存菌种。
将重组菌株wgv10进行pcr验证，提取重组菌株wgv10的质粒为模板，pg-s/vp-x为引物进行pcr扩增。pcr反应条件：95℃5min；94℃45s；48℃1min；72℃100s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，可得到1681bp的特异性条带，而出发菌株不能扩增出片段。图7为过表达重组菌株wgv10的验证电泳图。
过表达菌株wgv10的一对特异性验证引物：
上游引物pg-s：taactgatctatccaaaactgaa(seqidno:17)
下游引物vp-x：gcttatagtaacggaggtgtctt(seqidno:18)
实施例3：啤酒发酵实验
以实施例1、2获得的重组菌株以及出发菌株w303-1a为实验对象，
(1)种子培养
1)菌种活化：保存菌种转接至yepd斜面试管30℃活化培养两天。
2)一级种子培养：取斜面菌种一环，接种于盛有5ml麦汁培养基的试管中，在30℃、180rpm条件下培养14h。
3)二级种子培养：一级种子液按10％的接种量接入盛有50ml麦汁的150ml三角瓶内，16℃静置培养36h。
(2)啤酒发酵
发酵实验：二级种子液按10％的接种量接入盛有150ml10brix氮缺乏的麦汁的250ml三角瓶内，盖上发酵栓，使其保持瓶内压力，16℃静置发酵。从发酵旺盛期第5天起测pra活力(胞内和胞外)，每隔2-3天取一次样(为保持瓶内压力不变，通过设置多组平行来取样)。按上述发酵条件对缺失菌株，过表达菌株和出发菌株分别进行啤酒发酵实验。发酵结束之后，测定发酵液的残糖浓度、酒精体积分数表征其综合发酵性能。
(3)敲除vps10对蛋白酶a内外分泌的影响
对于胞内酶活来说(图8)，整个发酵期间，我们发现缺失菌株wδvps10跟出发菌株w303-1a相比，酶活均有降低；在13天发酵结束时，缺失菌株wδvps10的胞内酶活为出发菌株的53％；对于胞外酶活，缺失菌株wδvps10的酶活比出发菌株高出2.2倍。数据结果表明胁迫条件下，在不改变蛋白酶a表达量的同时，敲除vps10基因，会降低蛋白酶a向液泡分选的效率，同时会使分泌到发酵液里的蛋白酶a含量升高。说明胁迫条件下，vps10基因在蛋白酶a从高尔基体向液泡定向运输的过程中起到重要的分选作用。
(4)过表达vps10对蛋白酶a内外分泌的影响
对于胞内酶活来说(图9)，整个发酵期间过表达菌株wgv10跟出发菌株w303-1a相比酶活均有提高，在发酵结束时，提高了1.47倍；而胞外酶活降低到出发菌株的61％。数据结果进一步表明，胁迫条件下，在不改变蛋白酶a表达量的同时，过表达vps10基因，使蛋白酶a由反面高尔基体向液泡运输的效率升高，同时使分泌到发酵液里的蛋白酶a活力降低。我们继续比较了过表达菌株和出发菌株的发酵液中α-氨基氮，表观糖度的变化趋势，来观测过表达菌株的发酵特性的改变。
如图10所示，在发酵过程中，过表达菌株的α-氨基氮浓度表及观糖度和出发菌株相比并没有明显的变化，但是在发酵末期，过表达菌株的α-氨基氮浓度要低于出发菌株，这是由于，发酵末期是氮源相对缺乏的时期，也是酵母在胁迫条件下大量分泌蛋白酶a的时期，过表达菌株发酵液的蛋白酶a含量偏低，蛋白酶a分解发酵液内蛋白为氨基酸的能力减弱，故而其发酵液里的α-氨基氮含量也比较低。为避免末期大量分泌的蛋白酶a影响泡沫稳定性，会在耗糖结束时及时分离酵母，因此过表达菌株发酵液中的较低α-氨基氮含量并不会影响发酵。
发酵结束之后我们比较了两株菌的残糖和酒精度(结果见表1)，发现基本没有明显的差异。综合上述指标，过表达菌株的发酵特性基本没有改变。
表1过表达菌株和出发菌株酒精度和残糖的比较
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
序列表
<110>天津科技大学
<120>vps10基因在酿酒酵母菌株低分泌蛋白a中的应用
<130>1
<141>2018-08-30
<160>20
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>4740
<212>dna
<213>酿酒酵母w303-1a()
<400>1
atgatattacttcattttgtctattctctttgggccttacttctcattcctttaactaat60
gccgaagaattcacccccaaagtgacaaagactatcgcgcaagattcatttgatatatta120
agctttgatgattccaacactttaattagaaaacaagacacctccgttactataagcttt180
gacgatggtgaaacatgggaaaaagttgaaggcattgaaggcgaaatcacttggatatac240
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