本发明属于制药技术领域，具体涉及铂类药物与开环葫芦脲的包合物及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病之一，2008年全球有1240万人被新检查出患有癌症，760万人死于癌症，2010年，癌症已超过心脑血管疾病认为人类的头号杀手。顺铂以及其它铂类抗肿瘤药物在临床使用中获得了极大的成功，目前在化疗或者联合化疗治疗恶性肿瘤的方案中，70％～80％都要用到铂类药物。经典铂类药物的抗癌机制国内外有过不少研究，比较一致的观点认为铂配合物直接作用于细胞的dna，与dna形成加合物，限制dna的解旋从而抑制dna的复制。
顺铂作为第一代铂类抗肿瘤药物，其中抗肿瘤活性强，与其他非铂类抗癌药物不存在交叉耐药。顺铂对生殖系统癌症和头颈癌等非常有效，但顺铂也存在许多缺点，诸如水溶性差，对肾神经系统产生毒副反应。为了解决顺铂临床中的弊端，开发了第二代铂类抗癌药物卡铂，其水溶性是顺铂的17倍，其肾毒性和胃肠道毒性均低于顺铂，其主要的副作用为骨髓抑制。奥沙利铂作为第三代铂类抗肿瘤药物的代表，是第一个上市的手性抗肿瘤铂配合物，经过10多年的临床治疗和研究，奥沙利铂已经成为治疗结直肠癌的一线用药。
铂类药物除毒副作用大外，在体内容易被降解失活，铂单元容易受到亲核物质的进攻，例如谷胱甘肽，半胱氨酸，蛋氨酸等，从而导致大量铂单元无法与肿瘤细胞dna结合。常用的环糊精载体与铂类药物包合物的结合常数较小，且环糊精对强酸强碱不稳定，对铂类药物的包合物包合不紧密，可能会在非病灶部位释放药物，不能减少或掩蔽对正常组织细胞的毒副作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种溶解性好、结合常数高的铂类药物与开环葫芦脲的包合物，该包合物含有铂类药物与开环葫芦脲，其中铂类药物与开环葫芦脲的摩尔比为1:1～3:1，采用溶剂包合法制得。
所述铂类药物为顺铂、卡铂、奥沙利铂中的一种，具有如下所示结构：
所述开环葫芦脲，溶解性能好可使不溶性的药物分子增溶，其是非环状结构，由于其结构的特殊性，使其具有良好的柔性，可以适应药物分子的大小来调整空腔的尺寸；其结构式为：
本发明所述的开环葫芦脲的合成方法可参照已有的文献方法进行(dam,natchem,2012,4:503-510)，分为三步反应，首先从单体合成二聚体，从二聚体到四聚体后再到六聚体。
本发明另一目的是提供铂类药物与开环葫芦脲的包合物的制备方法，将开环葫芦脲溶解于水中制得水溶液；然后将铂类药物与有机溶剂的混合物加入到开环葫芦脲的水溶液中，在20～60℃条件下避光搅拌反应25～72h后，过滤，减压干燥后即得铂类药物与开环葫芦脲的包合物，其中铂类药物与开环葫芦脲的摩尔比为1:1～3:1。
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜、dmf中的一种。
由于开环葫芦脲本身具有荧光特性，激发波长为295nm时有荧光吸收，基于此性质，使用荧光法测定铂类药物与开环葫芦脲的结合常数。
本发明包合物的制备方法简便易行，条件温和，适合工业化生产。
开环葫芦脲是由甘脲低聚物聚合而成，易溶于水；具有疏水性的空腔，因此有分子识别基本性质，可作为铂类药物的增溶剂，且包合后的铂类药物的毒副作用可能被掩蔽，既降低了对正常细胞的毒副作用。
本发明利用开环葫芦脲具有c型空腔，可与铂类药物形成包合作用，由于开环葫芦脲是柔性分子可以根据药物大小改变空腔尺寸，与药物形成很好的空腔匹配，进而大大增强了铂类系列药物的水溶性；开环葫芦脲与药物相结合的结合常数较高，使水不溶性药物显著增溶；制得的包合物溶解性好，稳定性好，安全性高，可有效克服铂类系列药物本身水溶性差和生物利用度低的缺点。
附图说明
图1是开环葫芦脲1的核磁共振氢谱(1hnmr)图；
图2是开环葫芦脲2的核磁共振氢谱(1hnmr)图；
图3是顺铂与开环葫芦脲1包合物的核磁共振氢谱(1hnmr)图；
图4是顺铂与开环葫芦脲2包合物的核磁共振氢谱(1hnmr)图；
图5是卡铂与开环葫芦脲1包合物的核磁共振氢谱(1hnmr)图；
图6是卡铂与开环葫芦脲2包合物的核磁共振氢谱(1hnmr)图；
图7是奥沙利铂与开环葫芦脲1包合物的核磁共振氢谱(1hnmr)图；
图8是奥沙利铂与开环葫芦脲2包合物的核磁共振氢谱(1hnmr)图；
图9是开环葫芦脲1在不同激发光波长下的荧光图；
图10是开环葫芦脲2在不同激发光波长下的荧光图；
图11是顺铂滴定开环葫芦脲1的荧光图；
图12是顺铂滴定开环葫芦脲2的荧光图；
图13是卡铂滴定开环葫芦脲1的荧光图；
图14是卡铂滴定开环葫芦脲2的荧光图；
图15是奥沙利铂滴定开环葫芦脲1的荧光图；
图16是奥沙利铂滴定开环葫芦脲2的荧光图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步对本发明中所述方法进行描述，但本发明保护范围不受实施例限制，本实施例中使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂，使用的方法如无特殊说明均为常规方法。
实施例1：四聚体的合成制备
参照文献mad,etal.naturechemistry,2012,4(6):503中的方法进行：
(1)二聚体的合成：将甘脲(500g，3.51mol)和多聚甲醛(105g，3.51mol)混合均匀后加入hcl溶液(8m，700ml)中，反应液在50℃下加热48小时；反应结束后将反应液冷却后真空抽滤，得到粗产物；再将粗产物用水(500ml)洗涤，然后用tfa(1.5l)重结晶，得到二聚体，为白色固体(334g，62％)；
(2)四聚体的合成：将二聚体(304g，1.20mol)加入到无水meso3h(600ml)中，待二聚体完全溶解后，溶液呈透明状态，再加入醚化甲基化甘脲(84g，0.27mol)；将反应液在50℃下反应3小时；反应结束后将反应液倒入水(6.0l)中；真空抽滤后，将粗产物在真空中干燥；将干燥后的粗产物加到tfa(350ml)和水(1.4l)的混合溶液中进行重结晶，最终得到四聚体白色固体(76g，36％)；
(3)磺酸钠盐的苯环侧臂的合成：在对二苯酚(100g,0.91mol)的naoh溶液(2.5m，1.4l)中加入丙磺酸内酯(275g，2.25mol)的1，4-二氧六环(1.8l)溶液，反应液在室温条件下搅拌12h，反应液过滤后得到的沉淀是粗产物；粗产物用2l丙酮洗2次，真空抽滤后干燥得到四聚体白色固体(294g，81％)；
(4)磺酸钠盐的萘环侧臂的合成：在1,4-萘醌(150mg，948μmol)的乙醚(20ml)溶液中加入10％的硫代硫酸钠(20ml)溶液，反应液在30℃氩气保护条件下剧烈搅拌1h，在黄色乙醚层的颜色退去后，反应液用乙酸乙酯(50ml，3次)萃取，有机层用饱和食盐水洗(50ml，3次)，硫酸镁干燥得到1,4-萘二酚粗产物。1,4-萘二酚(2.0g,12.5mmol)的naoh溶液(10wt％，16ml)中加入丙磺酸内酯(3.8g，31.2mmol)的1,4-二氧六环(24ml)溶液，反应液室温条件下搅拌12h后过滤，得到的固体溶于10ml水，60ml乙腈沉淀得到蓝色固体(1.5g，3.3mmol，27％)。
(5)开环葫芦脲1的合成：四聚体(76g，97mmol)和磺酸钠盐苯环侧臂(154g，387mmol)加入到三氟乙酸(700ml)溶液中，反应液在70℃反应条件下搅拌3h，倒入1.5l甲醇中析出沉淀，得到的固体在真空干燥箱中干燥，干燥后的固体丙酮/水(1:1，1.5l，2次)混合溶液洗，洗过的固体溶于水(500ml)，用1m的氢氧化钠调节ph为7，旋蒸除去溶剂，在真空干燥箱中干燥得到白色固体(60g，40％)。1hnmr(400mhz,d2o):6.72(s,4h),5.50(d,2h),5.38(d,4h),5.31(d,2h),5.25(d,2h),5.19(d,4h),4.10(d,4h),4.06(d,4h),3.97(d,2h),3.91(m,4h),3.79(m,4h),2.98(m,8h),2.06(m,8h),1.64(m,6h),1.61(s,6h)，见图1。
(6)开环葫芦脲2的合成：四聚体(2.67g,3.42mmol)和磺酸钠盐萘环(6.13g，13.7mmol)加入到三氟乙酸(25ml)溶液中，反应液在70℃反应条件下搅拌3h，倒入1.5l甲醇中析出沉淀，得到的固体在真空干燥箱中干燥，干燥完后溶于少量的水中，用1m的氢氧化钠调节ph为7，溶液冷却到室温，过滤得到白色固体(1.7g，30％)。1hnmr(600mhz,d2o):7.72(m,4h),7.27(m,4h),5.48(d,2h),5.42(d,4h),5.31(d,2h),5.25(d,2h),5.12(d,4h),4.30(d,4h),4.12(d,4h),4.00(m,4h),3.96(d,2h),3.74(m,4h),3.08(m,8h),2.13(m,8h),1.66(s,6h),1.61(s,6h)，见图2。
实施例2：顺铂与两种开环葫芦脲包合物的制备
(1)顺铂与开环葫芦脲1的包合物的制备
将0.172g(0.1mmol)的开环葫芦脲溶于15ml蒸馏水中，25℃下搅拌至溶解，将0.091g(0.3mmol)的顺铂与甲醇的混合物加入开环葫芦脲1的水溶液中，避光搅拌72h后，使用滤纸和微孔滤膜过滤，滤液减压蒸干后得到顺铂包合物，图3可见，在d2oδ2.7ppm出现顺铂的峰，证明顺铂已经被开环葫芦脲1包封进腔内。
(2)顺铂与开环葫芦脲2的包合物的制备
将0.1868g(0.1mmol)的开环葫芦脲溶于15ml蒸馏水中，25℃下搅拌至溶解，将0.091g(0.3mmol)的顺铂与甲醇的混合物加入开环葫芦脲2的水溶液中，避光搅拌72h后，使用滤纸和微孔滤膜过滤，滤液减压蒸干后得到顺铂包合物，图4可见，在d2oδ2.75ppm出现顺铂的峰，证明顺铂已经被开环葫芦脲2包封进腔内。
实施例3：卡铂与两种开环葫芦脲包合物的制备
(1)：卡铂与开环葫芦脲1的包合物的制备
将0.1mmol的开环葫芦脲溶于15ml蒸馏水中，30℃下搅拌至溶解，将0.1mmol卡铂与dmso的混合物加入到开环葫芦脲1的水溶液中，避光搅拌50h后，使用滤纸和微孔滤膜过滤，滤液减压蒸干后得到卡铂包合物，图5可见，在d2oδ0～1.5ppm出现卡铂的峰，且有一定的峰位移，证明卡铂已经被开环葫芦脲1包封进腔内。
(2)卡铂与开环葫芦脲2的包合物的制备
将0.1mmol的开环葫芦脲溶于15ml蒸馏水中，30℃下搅拌至溶解，将0.1mmol卡铂与dmso的混合物加入到开环葫芦脲2的水溶液中，避光搅拌50h后，使用滤纸和微孔滤膜过滤，滤液减压蒸干后得到卡铂包合物，图6可见，在d2oδ0～1.5ppm出现卡铂的峰，且有一定的峰位移，证明卡铂已经被开环葫芦脲2包封进腔内。
实施例4：奥沙利铂与两种开环葫芦脲包合物的制备
(1)奥沙利铂与开环葫芦脲1的包合物的制备
将0.1mmol的开环葫芦脲溶于15ml蒸馏水中，40℃下搅拌至溶解，将0.1mmol的奥沙利铂与dmf的混合物加入到开环葫芦脲1的水溶液中，避光搅拌40h后，使用滤纸和微孔滤膜过滤，过滤蒸干后得到奥沙利铂包合物，图7可见，在d2oδ0～1.25ppm出现奥沙利铂的峰且奥沙利铂的峰位移发生了偏移，证明奥沙利铂已经被开环葫芦脲1包封进腔内。
(2)奥沙利铂与开环葫芦脲2的包合物的制备
将0.1mmol的开环葫芦脲溶于15ml蒸馏水中，40℃下搅拌至溶解，将0.1mmol的奥沙利铂与dmf的混合物加入到开环葫芦脲2的水溶液中，，避光搅拌45h后，使用滤纸和微孔滤膜过滤，过滤蒸干后得到奥沙利铂包合物，图8可见，在d2oδ-0.75～0.75ppm出现奥沙利铂的峰且奥沙利铂的峰位移发生了偏移，证明奥沙利铂已经被开环葫芦脲2包封进腔内。
实施例5：开环葫芦脲1和2的最佳荧光激发波长的测定
使用ph7.4的缓冲溶液，配制2×10-7mol/l的开环葫芦脲1和开环葫芦脲2的溶液，使用移液枪准确量取2.5ml于比色皿中，使用荧光光谱仪在270-450nm范围内扫最佳激发波长，最终确定在290-300nm范围内荧光效果最好，如图9、10所示，最终选定295nm为开环葫芦脲的最佳激发波长。
实施例6：顺铂与开环葫芦脲1和开环葫芦脲2的包合常数
(1)荧光法测定顺铂与开环葫芦脲1的包合常数
使用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液配制2×10-7mol/l的开环葫芦脲1溶液100ml，取25ml配好的开环葫芦脲1溶液配制成1×10-5mol/l的顺铂溶液。用移液枪准确称取2.5ml的开环葫芦脲1溶液于比色皿中，再以此加入0、2、7、10、13、18、25、35、55、85、130μl的顺铂溶液，设置荧光的激发波长为295nm，记录其荧光强度，再使用micromathscientist软件计算出ks＝6.13±0.62×106，图11可知，随着顺铂的加入，荧光变化趋于稳定，即开环葫芦脲1达到滴定终点。
(2)荧光法测定顺铂与开环葫芦脲2的包合常数
使用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液配制2×10-7mol/l的开环葫芦脲2溶液100ml，取25ml配好的开环葫芦脲2溶液配制成1×10-5mol/l的顺铂溶液。用移液枪准确称取2.5ml的开环葫芦脲2溶液于比色皿中，再以此加入0、2、7、17、30、50、80、130、210、310、410、510μl的顺铂溶液，设置荧光的激发波长为295nm，记录其荧光强度，再使用micromathscientist软件计算出ks＝2.13±0.65×105，图12可知，随着顺铂的加入，荧光变化趋于稳定，即开环葫芦脲2达到滴定终点。
实施例7：卡铂与开环葫芦脲1和开环葫芦脲2的包合常数
(1)荧光法测定卡铂与开环葫芦脲1的包合常数
使用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液配制2×10-7mol/l的开环葫芦脲1溶液100ml，取25ml配好的开环葫芦脲1溶液配制成5×10-4mol/l的卡铂溶液。用移液枪准确称取2.5ml的开环葫芦脲1溶液于比色皿中，再以此加入0、5、15、35、75、115、160、220、300、400、500、700、900μl的卡铂溶液，设置荧光的激发波长为295nm，记录其荧光强度，再使用micromathscientist软件计算出ks＝5.83±1.02×104，图13可知，随着卡铂的加入，荧光变化趋于稳定，即开环葫芦脲1达到滴定终点。
(2)荧光法测定卡铂与开环葫芦脲2的包合常数
使用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液配制2×10-7mol/l的开环葫芦脲2溶液100ml，取25ml配好的开环葫芦脲2溶液配制成5×10-4mol/l的卡铂溶液。用移液枪准确称取2.5ml的开环葫芦脲2溶液于比色皿中，再以此加入0、2、7、20、40、70、120、200、300、400、500、600、700μl的卡铂溶液，设置荧光的激发波长为295nm，记录其荧光强度，再使用micromathscientist软件计算出ks＝1.53±0.24×104，图14可知，随着卡铂的加入，荧光变化趋于稳定，即开环葫芦脲2达到滴定终点。
实施例8：奥沙利铂与开环葫芦脲1和2的包合常数
(1)荧光法测定奥沙利铂与开环葫芦脲1的包合常数
使用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液配制2×10-7mol/l的开环葫芦脲1溶液100ml，取25ml配好的开环葫芦脲1溶液配制成1×10-4mol/l的奥沙利铂溶液。用移液枪准确称取2.5ml的开环葫芦脲1溶液于比色皿中，再以此加入0、2、5、11、16、21、28、38、58、108、160、260μl的奥沙利铂溶液，设置荧光的激发波长为295nm，记录其荧光强度，再使用micromathscientist软件计算出ks＝2.18±0.12×107，图15可知，随着奥沙利铂的加入，荧光变化趋于稳定，即开环葫芦脲1达到滴定终点。
(2)荧光法测定奥沙利铂与开环葫芦脲2的包合常数
使用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液配制2×10-7mol/l的开环葫芦脲2溶液100ml，取25ml配好的开环葫芦脲2溶液配制成5×10-5mol/l的奥沙利铂溶液。用移液枪准确称取2.5ml的开环葫芦脲2溶液于比色皿中，再以此加入0、2、7、17、27、47、80、130、210、310、400、500μl的奥沙利铂溶液，设置荧光的激发波长为295nm，记录其荧光强度，再使用micromathscientist软件计算出ks＝1.06±0.21×106，图16可知，随着奥沙利铂的加入，荧光变化趋于稳定，即开环葫芦脲2达到滴定终点。
实施例9：铂类药物与开环葫芦脲的包合物的水溶性实验
铂类药物中顺铂几乎不溶于水，卡铂、奥沙利铂有一定水溶性；测定开环葫芦脲与铂类药包合物，可以发现水溶性明显提高了。故开环葫芦脲可以用作药物载体使用，且可以明显改善难溶性药物的水溶性，结果见表1；
表1：铂类药物包合前后水溶性的比较