预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码RNALINC01728及试剂盒的制作方法

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码rnalinc01728及试剂盒。
背景技术：
结肠癌是常见的起源于肠粘膜的恶性肿瘤，然而，随着生存环境的改变、中国逐渐西式化的饮食和生活方式，发病率逐年增加结肠癌已经发展成为位居我国第3位的恶性肿瘤。结肠癌多发于中老年人，发病高峰年龄约50岁左右，但随着社会环境的改变，结肠癌发病模式也在逐渐改变，青年发病率越来越高。青年结肠癌区别于老年结肠癌并具有独特的分子病理特征，具有早期临床症状不典型，淋巴结及远处转移早，病情发展迅速，确诊时多属进展期或晚期，预后差的特点。虽然目前采用手术、化疗、放疗等综合治疗措施，但大多数青年结肠癌患者预后仍然很差，目前，临床上还没有理想的分子指标来评估预后及发生转移的风险。因此，寻找新的预后生物标志物是目前急需解决的问题。在测序技术尚未成熟的时期，人们对基因组的探索还不完全，当时的主流观点是真核生物的基因组主要由蛋白质编码基因组成，非编码区域并不具有功能。随着对基因组研究的不断深入，人们发现人类基因组中仅有2％的区域和已注释的蛋白质编码基因外显子相关。对人类基因组的1％基因进行研究，发现基因组中的序列普遍可表达并产生大量非蛋白质编码转录本。这些发现推翻了原有关于基因组结构的推断，揭示了基因组中含有大量的非编码区段的现象，非编码区域的转录产物，即非编码rna。为什么人类基因组中含有如此大量的非编码rna，这些非编码rna是否真的没有功能以及它们在别的物种中是否也广泛存在，这些问题掀起了非编码rna研究的热潮。在对非编码rna的研究过程中，长链非编码rna作为非编码rna家族的重要成员，也引起了广泛的关注。linc01728是一种新发现的非编码rna，其转录本长度大于200个核苷酸。目前，linc01728在正常细胞发育或肿瘤发生发展的过程中发挥的重要作用还在进一步研究中。linc01728是否可以作为一种新的肿瘤标志物用于预测结肠癌患者预后尚未有报道。因此，我们首次阐明了以linc01728为新的结肠癌标志物来预测患者预后的可行性。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码rnalinc01728及试剂盒，用于预测结肠癌患者的预后生存期。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：预测结肠癌预后用的生物标记物为长链非编码rnalinc01728，该长链非编码rnalinc01728的核酸序列如seqno:1所示。长链非编码rnalinc01728生物标记物在制备预测结肠癌预后的制剂中的应用。所述预测结肠癌预后的制剂为实时荧光定量pcr检测试剂盒。用于预测结肠癌预后的实时荧光定量pcr检测试剂盒，包含用于检测目的基因linc01728表达的特异性引物，引物序列为seqno:2和seqno:3。用于预测结肠癌预后的实时荧光定量pcr检测试剂盒，包含内参基因tuba1a表达的特异性引物，引物序列为seqno:4和seqno:5。所述的用于预测结肠癌预后的实时荧光定量pcr检测试剂盒包含实时荧光定量sybr染料、无rna酶的水。所述的用于预测结肠癌预后的实时荧光定量pcr检测试剂盒中实时荧光定量sybr染料、目的基因linc01728特异性引物、内参基因tuba1a特异性引物、无rna酶的水的体积比为10:1:1:6。本发明的有益效果在于：本发明通过荧光定量pcr与生存曲线分析发现结肠癌组织来源的linc01728与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高。此法为预测结肠癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高结肠癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。附图说明图1为实时荧光定量pcr分析linc01728在正常组织与结肠癌中的表达差异。图2为生存曲线分析结肠癌组织来源的linc01728表达高低对结肠癌患者的预后影响。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。实施例1预测结肠癌预后用的生物标记物为长链非编码rnalinc01728，该长链非编码rnalinc01728的核酸序列如seqno:1所示。预测结肠癌预后的制剂为实时荧光定量pcr检测试剂盒，实时荧光定量pcr检测试剂盒，包含用于检测目的基因linc01728表达的特异性引物，引物序列为seqno:2和seqno:3，实时荧光定量pcr检测试剂盒还包含内参基因tuba1a表达的特异性引物，引物序列为seqno:4和seqno:5。制备检测linc01728表达量的试剂用于制备结肠癌患者预后的试剂盒(用于50次反应)，所需的试剂包括：sybrgreenqpcrmix500μl、3μm目的基因linc01728特异性引物50μl、3μm内参基因tuba1a特异性引物50μl、无rna酶的水300μl。从结肠癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总rna所用试剂，包括：trizoll20ml、抑制rna降解溶剂40ml、氯仿80ml、异丙醇80ml、depc水10ml。以总rna为模板将linc01728逆转录为cdna所用试剂，包括：10×随机引物和oligodt引物的混合物100μl、5×逆转录反应缓冲液150μl、10mm含mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dntp100μl、200u/μlm-mlv逆转录酶50μl。实施例2组织样本linc01728的检测1、收集待测结肠癌肿瘤组织或正常对照组织，生理盐水清洗干净后，放入盛有抑制rna降解溶剂的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。2、组织中rna的抽提（1）先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取100mg组织粉末加入已盛有1ml的trizol液的ep管中。组织粉末总体积不能超过所用trizol体积的10%，充分混合均匀。（2）室温放置5分钟，然后加入200μl的氯仿，盖紧ep管并剧烈摇荡0.5分钟。12000转/分钟离心10分钟。（3）取上层水相于一新的ep管中，加入500μl异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10分钟，12000转/分钟离心10分钟。（4）小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000转/分钟离心5分钟。重复操作一次。（5）弃去上清液，尽量将残余液体除去，室温或真空干燥5～10分钟。用50μldepc处理过的水将rna溶解。（6）rna浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸1μlrna样品加至样品孔，根据读数直接确定rna的浓度。核酸浓度测定仪的测定的od260/od280比值，比值在1.8-2.0之间认为rna纯度很好。最后，rna贮存于-80℃冰箱备用。3、linc01728rna的逆转录使用上海碧云天生物技术有限公司的逆转录试剂盒（d7170s）。具体步骤如下：（1）去除基因组dna：将模板totalrna，5×gdnaeraserbuffer在冰上解冻，5×rtbuffer、10×rtprimermix、depc-treatedwater在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液混匀并短暂离心以使所有液体沉降至管底。rna的变性，把rna样品在65℃条件下热变性5分钟后，立即置于冰水中冷却。按下表成分于冰上配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入rna样品。反应体系及条件如表1所示。表1（2）在pcr仪上或水浴中，37℃孵育2分钟。迅速置于冰上放置备用。（3）逆转录体系配制：在冰上进行反应液配制，轻柔混匀后立即进行逆转录反应。按照下表的逆转录反应体系配制混合液。反应体系及条件如表2所示。表2（4）42℃孵育60分钟以进行逆转录反应，随后80℃孵育10分钟失活逆转录酶后放于冰上。对于二级结构复杂或高gc含量的模板，可以提高逆转录温度至50℃，以增强逆转录效率。（5）得到的cdna可立即或-80℃冻存后用于后续实时荧光定量pcr，cdna宜避免过多的反复冻融。4、利用linc01728的特异性引物进行实时定量pcr特异性引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，包括用于检测linc01728表达的特异性引物，引物序列为seqno:2和seqno:3，以及内参基因tuba1a表达的特异性引物，引物序列为seqno:4和seqno:5。实时定量pcr其它试剂利用上海碧云天生物技术有限公司的beyofast™sybrgreenqpcrmix(2×)，具体步骤如下：（1）融解并混匀pcr反应所需的各种溶液，beyofast™sybrgreenqpcrmix完全融解并混匀后置于冰盒内。（2）冰浴上设置pcr反应体系(以96孔板为例)，如表3所示。表3试剂使用量beyofast™sybrgreenqpcrmix(2x,lowrox)10μl特异性引物(浓度3μm)2μl模板dna2μl无rna酶的水6μl总体积20μl(3)通常dna模板的量以1-10ngcdna为参考用量，引物的终浓度为0.2-0.5μm时可获得良好的检测效果，也可根据情况调整引物的终浓度。如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。逆转录pcr反应得到的cdna直接作为模板时，其添加量不要超过pcr反应总体积的10%。96孔板的推荐反应体系为20μl，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。(4)用移液器轻轻吹打混匀或轻微vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。(5)将设置好的pcr反应管或pcr反应板置于荧光定量pcr仪上，开始pcr反应。(6)pcr反应程序：在实时荧光定量pcr反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃2分钟。采用如下的pcr程序，本程序是以abi7900ht荧光定量pcr仪为例：a.预变性：95℃2min；b.变性：95℃15sec；c.退火/延伸：60℃15-30sec；d.重复步骤b和步骤c，总共40个循环；e.熔解曲线分析(可选)：95℃15sec,60℃15sec,95℃15sec；f.使用荧光定量pcr仪提供的软件分析结果。三步法只需在退火/延伸后加一步72℃30sec，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。5、linc01728表达量的数据分析本实验数据纳入60例结肠癌患者及其正常对照组织。实时定量pcr的结果分析采用相对定量方法即2^-△△ct法。具体如下：首先，将一次实验的所有基因ct值整理好，之后用每一组肿瘤样本中的目的基因linc01728的ct值减去自身内参基因tuba1a的ct值，得到的数就是△ct；换成公式就是：△ct=ct（目的基因linc01728）-ct（内参基因tuba1a）；然后，将每一组肿瘤样本每一个目的基因linc01728的△ct都算好。用本次实验中肿瘤组织样本的△ct减去正常对照组织组样本的△ct，并同时对所有结果取相反数，该步运算得到的结果就是-△△ct。最后，对-△△ct进行2的幂运算，即2^-△△ct就得出表达量的倍数改变。重复三次，利用非参数t-检验进行统计分析。结果如图1所示，结肠癌的肿瘤组织中linc01728的表达量比正常对照组织高，差异具有统计学差异(p＜0.05)。通过对上述实验所纳入的60例结肠癌患者随访统计资料，包括患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为至少12个月。在所选取的结肠癌患者中，选取荧光实时定量pcr分析的表达值为参考标准，所得结果与其对应的正常组织相比较，结果如图2所示。肿瘤组织中linc01728表达高于正常对照组织的患者定义为linc01728高表达组，其余为低表达组。通过kaplan-meier生存分析，linc01728高表达患者的生存期比linc01728低表达组的患者明显降低，预后更差，差异具有有统计学意义(p＜0.05)。因此，linc01728可作为结肠癌患者预后的特异性分子标志物。以上所述为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明整体构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。sequencelisting<110>郑州大学第一附属医院<120>预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码rnalinc01728及试剂盒<130>1<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>579<212>dna<213>人<400>1ggactactctgtggatgtatgaaaaaccactgaattgcagtttaaggccacattccaatc60tcatgagagaagagcccctagttctcaggactttaaccctcttcctgccagcacccccag120gccagtgctgagggctgacaagttgtctaaaagggcaggaggacttactcctgacatgca180tctgccacccaaaccatcacaatagccttccgccttctcagtgggagtacgagtgaccct240gcagcagaaggcagcaggaggtggtgacaagaatacacgtctggccctaaaacctgggtc300agtcacatcctggctgccattcaccagctatatgattttaggaaagtggattcacctctg360agctgcagattcctcatcaataaaatgaagacaagaacacccacccttagtatttgggta420tttagactgtttccatgttttttttatttcttttatcatattcttggcattacgagttta480gcattcaaggttctgaccaataagtgatcccaggggtgttcatgaaaatccccggggaaa540gcttttacaaaataaagaacggagtctattgagctggaa579<210>2<211>21<212>dna<213>人工合成<400>2gcagtttaaggccacattcca21<210>3<211>20<212>dna<213>人工合成<400>3gtaaaagctttccccgggga20<210>4<211>20<212>dna<213>人工合成<400>4cttctctgggcagattgggg20<210>5<211>20<212>dna<213>人工合成<400>5ccccaacgtaccagtgaaca20当前第1页12