一种提高白酒原酒中乙酸乙酯含量的方法与流程

本发明涉及白酒酿造领域，具体涉及一种提高白酒原酒中乙酸乙酯含量的方法。

背景技术

中国白酒中的微量成分主要有酸类、酯类、醛类、醇类及极少量的含硫有机化合物。酯类是中国白酒香味的重要组分。在白酒中，除乙醇和水之外，酯的含量占第三位。清香型白酒中，乙酸乙酯和乳酸乙酯含量总和占总酯含量的90%以上，其中乙酸乙酯含量最高，乳酸乙酯含量次之。乙酸乙酯和乳酸乙酯的绝对含量以及它们的量比关系对清香型白酒的风格特征有很大的影响。乙酸乙酯呈现水果香，气味特征明显，且易挥发，它在酒中含量高，阈值低；而乳酸乙酯沸点较高，如果其含量过高或超过乙酸乙酯含量，使得乙酸乙酯的挥发性降低，酒体中乙酸乙酯香气突出的特征会受到抑制，且酒的后味会带有一定程度的涩苦感。但是在生产中，由于受到多方面的因素影响，蒸馏出的原酒往往存在乙酸乙酯含量偏低的问题，直接影响了原酒的质量。

酒糟，作为白酒酿造过程中的副产物，同时也是废弃物，目前多做为动物饲料使用。但酒糟中还含有大量的残余的淀粉、蛋白质和由微生物发酵而来的多种代谢产物，这些成分没有得到充分的利用。部分清香型酒厂将酒糟添加酒曲后再次发酵酿酒，但该方法耗时费力，且蒸馏出的酒质量和产量较差，得不偿失。

综上所述，迫切需要一种简单快捷的方法来解决清香型白酒酿造过程中蒸馏出的原酒乙酸乙酯含量偏低的问题，进而提高原酒中的香味和品质。

技术实现要素：

基于上述技术问题，本发明目的提供一种提高白酒原酒中乙酸乙酯含量的方法。从实际生产为出发点，以丢弃酒糟为培养基质，接入纯种产酯酵母来生产高乙酸乙酯含量的香糟，通过蒸馏得到含有高浓度乙酸乙酯的调香液，再将该调香溶液均匀喷洒在酒醅中进行蒸馏，使调香液中的乙酸乙酯自然融入到原酒中，来解决白酒中乙酸乙酯含量偏低、乙乳比例失衡的问题，达到提高白酒品质的目的。

一种提高白酒原酒中乙酸乙酯含量的方法，包括如下步骤：

（1）酵母菌的分离

称取5g牛栏山清香型酒醅，置于装有45ml无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，20℃，140r/min条件下摇床振荡20min，制成含有微生物的菌悬液，此菌悬液浓度为10^-1；

吸取1ml上述①中菌悬液置于盛装9ml无菌水的试管中，配置成浓度为10^-2的菌悬液，按此法依次稀释成浓度为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌悬液。分别吸取0.1ml浓度梯度为10^-5、10^-6的菌悬液至含有ypd培养基的平板中进行涂布培养，于30℃条件培养72h，待生长出独立的酵母菌落即可；

用接种针挑取上述②平板中菌落形态不同的酵母菌菌落分别划线转接在新的ypd平板中，置于30℃条件下培养72h形成酵母菌单菌落。

（2）产酯酵母的筛选：

①8°bx麦芽汁液体培养基的制备：取啤酒厂新鲜麦芽汁，利用糖度仪降至8°bx，分装于500ml三角瓶中，每瓶装300ml，115℃灭菌30min，晾凉备用；

②接种环挑取1～2环上述步骤（1）中的形态不同的酵母菌单菌落，并分别编号为y001、y002、y003，并将其接种于装有上述8°bx麦芽汁液体培养基中，30℃静置培养72h，制成酵母菌发酵液；

③吸取200ml上述步骤（2）②中的酵母菌发酵液，加入200ml水，蒸馏得到200ml蒸馏液，利用气相色谱测定蒸馏液中乙酸乙酯含量；

④根据乙酸乙酯含量筛选出产酯能力最高的一株酵母菌，筛选出产酯能力最强的酵母菌为y002，产酯能力为478.51mg/l。

（3）产酯酵母菌生产乙酸乙酯香糟；

①产酯酵母菌液体种子培养基的配制：将鲜酒糟与水按质量比1:5混合，静置24h，过滤得滤液，加0.5%酵母浸粉，1%葡萄糖，1%蛋白胨，ph5.5，115℃灭菌30min，晾凉备用；

②挑取两环步骤（2）④筛选的产酯酵母菌纯菌落，接种于上述步骤（3）①的产酯酵母液体种子培养基中，30℃条件下摇床（140r/min）培养72h，制作成液体种子悬液；

取新鲜清蒸清茬的丢弃酒糟送入摊凉机摊凉20～30℃，在摊凉机摊凉的过程中均匀喷洒上述步骤（3）②中制备的产酯酵母液体种子悬液和酒精浓度为95%vol的食用乙醇，然后将丟弃酒糟松散的倒入地缸中培养，中间留有通气孔，入缸温度20～30℃，培养时间72～96h，待酒糟产生浓郁的乙酸乙酯香气时即为产酯香糟培养成熟；

（4）产酯香糟应用于白酒酿造

将上述步骤（3）培养成熟的产酯香糟，松散均匀的装入甑桶进行蒸汽蒸馏，经冷凝器冷凝后收集得到含有高浓度乙酸乙酯的调香液，将该调香液均匀喷洒到正常出池的酒醅中，再将出池酒醅均匀松散的装入甑桶中蒸馏，蒸馏的原酒中乙酸乙酯含量明显增加，且酯香自然浓郁，酒体丰满。

本发明酿酒工艺中，酵母菌喜在偏酸潮湿的环境下生长。而牛栏山清香型白酒的酒糟ph<5.0，水分>65%，含有满足酵母菌生长的丰富营养物质，产酯酵母能够将乙酸和乙醇通过酯化作用生成乙酸乙酯，酒糟中含有适量的乙酸、乳酸等有机酸，为产酯酵母提供了合成的前体物质。

本发明的优点为：本发明中制备香糟所用原料是白酒酿造后的废弃产物，该原料无需资金二次投入，易得到，是培养酵母菌的上好培养基质；本发明充分利用丟糟生产纯生物发酵的乙酸乙酯调香液，再将该调味液添加到出池酒醅中进行蒸馏，从而达到提高原酒中乙酸乙酯含量的目的，该方法操作简单，生产周期短，且丢弃酒糟在使用前已经处于无菌状态，减少了再次灭菌的环节，节约了能源；应用本发明生产的原酒，乙酸乙酯香气自然浓郁，酒体干净协调，质量得到明显改善；本发明可以实现对废弃物的再利用，且生产过程不产生额外的废水，符合节能环保要求。

附图说明

图1通过blast软件将模式菌株和产酯酵母菌y002对比结果图。

具体实施方式

实施例1

为了提高原酒中的乙酸乙酯含量，提升原酒质量，实验利用丢弃酒糟培养产酯酵母y002，通过微生物代谢制备含有乙酸乙酯的香糟，再将香糟蒸馏，得到高浓度的乙酸乙酯调香液，然后该调香液均匀喷洒在酒醅上进行蒸馏，使得调香液中的乙酸乙酯融合到原酒中。具体方法如下：

（1）酵母菌的分离

称取5g牛栏山清香型酒醅，置于装有45ml无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，20℃，140r/min条件下摇床振荡20min，制成含有微生物的菌悬液，此菌悬液浓度为10^-1；吸取1ml浓度为10^-1菌悬液置于盛装9ml无菌水的试管中，配置成浓度为10^-2的菌悬液，按此法依次稀释成浓度为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌悬液，分别吸取0.1ml浓度梯度为10^-5、10^-6的菌悬液至含有ypd培养基的平板中进行涂布培养，于30℃条件培养72h，待生长出独立的酵母菌落即可；用接种针挑取上述ypd平板中菌落形态不同的酵母菌菌落分别划线转接在新的ypd平板中，置于30℃条件下培养72h形成酵母菌单菌落。

（2）产酯酵母的筛选

8°bx麦芽汁液体培养基的制备：取啤酒厂新鲜麦芽汁，利用糖度仪降至8°bx，分装于500ml三角瓶中，每瓶装300ml，115℃灭菌30min，晾凉备用；接种环挑取1～2环上述步骤（1）分离的形态不同的酵母菌单菌落，接种于装有上述8°bx麦芽汁液体培养基中，30℃静置培养72h，制成酵母菌发酵液；吸取200ml上述制成的酵母菌发酵液，加入200ml水，蒸馏得到200ml蒸馏液，利用气相色谱测定蒸馏液中乙酸乙酯含量；根据乙酸乙酯含量筛选出编号为y002的产酯酵母菌为产酯能力最高的一株酵母菌；

（3）产酯酵母菌生产乙酸乙酯香糟

产酯酵母菌液体种子培养基的配制：将鲜酒糟与水按质量比1:5混合，静置24h，过滤得滤液，加0.5%酵母浸粉，1%葡萄糖，1%蛋白胨，ph5.5，115℃灭菌30min，晾凉备用；挑取两环步骤（2）筛选的产酯酵母菌y002纯菌落，接种于上述配置好的产酯酵母液体种子培养基中，30℃条件下摇床（140r/min）培养72h，制作成产酯酵母液体种子悬液；取新鲜清蒸清茬的丢弃酒糟送入摊凉机摊凉20℃，在摊凉机摊凉的过程中均匀喷洒上述步骤制备的产酯酵母y002液体种子悬液和酒精浓度为95%vol的食用乙醇，其中，产酯酵母y002液体种子悬液的添加量为丟糟质量的2%；95%vol的食用乙醇的使用量为丟糟质量的4%；然后将丟弃酒糟松散的倒入地缸中培养，中间留有通气孔，入缸温度20℃，培养时间96h，待酒糟产生浓郁的乙酸乙酯香气时即为产酯香糟培养成熟；

（4）产酯香糟应用于白酒酿造

将步骤（3）培养成熟的产酯香糟，松散均匀的装入甑桶进行蒸汽蒸馏，经冷凝器冷凝后收集得到含有高浓度乙酸乙酯的调香液，将该调香液均匀喷洒到正常出池的酒醅中，再将出池酒醅均匀松散的装入甑桶中蒸馏，蒸馏的原酒中乙酸乙酯含量明显增加，且酯香自然浓郁，酒体丰满。

实施例1进行了2次，分别是实验1和实验2，并设立对照组。从表1中可以很明显的看出，实验组原酒中的乙酸乙酯含量与对照组相比有很大程度的提高，这说明调香液的作用明显。

实施例2

为了提高原酒中的乙酸乙酯含量，提升原酒质量，实验利用丢弃酒糟培养产酯酵母y002，通过微生物代谢制备含有乙酸乙酯的香糟，再将香糟蒸馏，得到高浓度的乙酸乙酯调香液，然后该调香液均匀喷洒在酒醅上进行蒸馏，使得调香液中的乙酸乙酯融合到原酒中。具体方法如下：

（1）酵母菌的分离

称取5g牛栏山清香型酒醅，置于装有45ml无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，20℃，140r/min条件下摇床振荡20min，制成含有微生物的菌悬液，此菌悬液浓度为10^-1；吸取1ml浓度为10^-1菌悬液置于盛装9ml无菌水的试管中，配置成浓度为10^-2的菌悬液，按此法依次稀释成浓度为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌悬液，分别吸取0.1ml浓度梯度为10^-5、10^-6的菌悬液至含有ypd培养基的平板中进行涂布培养，于30℃条件培养72h，待生长出独立的酵母菌落即可；用接种针挑取上述ypd平板中菌落形态不同的酵母菌菌落分别划线转接在新的ypd平板中，置于30℃条件下培养72h形成酵母菌单菌落。

（2）产酯酵母的筛选

8°bx麦芽汁液体培养基的制备：取啤酒厂新鲜麦芽汁，利用糖度仪降至8°bx，分装于500ml三角瓶中，每瓶装300ml，115℃灭菌30min，晾凉备用；接种环挑取1～2环上述步骤（1）分离的形态不同的酵母菌单菌落，接种于装有上述8°bx麦芽汁液体培养基中，30℃静置培养72h，制成酵母菌发酵液；吸取200ml上述制成的酵母菌发酵液，加入200ml水，蒸馏得到200ml蒸馏液，利用气相色谱测定蒸馏液中乙酸乙酯含量；根据乙酸乙酯含量筛选出编号为y002的产酯酵母菌为产酯能力最高的一株酵母菌；

（3）产酯酵母菌生产乙酸乙酯香糟

产酯酵母菌液体种子培养基的配制：将鲜酒糟与水按质量比1:5混合，静置24h，过滤得滤液，加0.5%酵母浸粉，1%葡萄糖，1%蛋白胨，ph5.5，115℃灭菌30min，晾凉备用；挑取两环步骤（2）筛选的产酯酵母菌y002纯菌落，接种于上述配置好的产酯酵母液体种子培养基中，30℃条件下摇床（140r/min）培养72h，制作成产酯酵母液体种子悬液；取新鲜清蒸清茬的丢弃酒糟送入摊凉机摊凉26℃，在摊凉机摊凉的过程中均匀喷洒上述步骤制备的产酯酵母y002液体种子悬液和酒精浓度为95%vol的食用乙醇，其中，产酯酵母y002液体种子悬液的添加量为丟糟质量的2%；95%vol的食用乙醇的使用量为丟糟质量的4%；然后将丟弃酒糟松散的倒入地缸中培养，中间留有通气孔，入缸温度26℃，培养时间72h，待酒糟产生浓郁的乙酸乙酯香气时即为产酯香糟培养成熟；

（4）产酯香糟应用于白酒酿造

将步骤（3）培养成熟的产酯香糟，松散均匀的装入甑桶进行蒸汽蒸馏，经冷凝器冷凝后收集得到含有高浓度乙酸乙酯的调香液，将该调香液均匀喷洒到正常出池的酒醅中，再将出池酒醅均匀松散的装入甑桶中蒸馏，蒸馏的原酒中乙酸乙酯含量明显增加，且酯香自然浓郁，酒体丰满。

实施例2进行了2次，分别是实验3和实验4，并设立对照组。从表1中可以很明显的看出，实验组原酒中的乙酸乙酯含量与对照组相比有很大程度的提高，这说明调香液的作用明显。

实施例3

为了提高原酒中的乙酸乙酯含量，提升原酒质量，实验利用丢弃酒糟培养产酯酵母y002，通过微生物代谢制备含有乙酸乙酯的香糟，再将香糟蒸馏，得到高浓度的乙酸乙酯调香液，然后该调香液均匀喷洒在酒醅上进行蒸馏，使得调香液中的乙酸乙酯融合到原酒中。具体方法如下：

（1）酵母菌的分离

称取5g牛栏山清香型酒醅，置于装有45ml无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，20℃，140r/min条件下摇床振荡20min，制成含有微生物的菌悬液，此菌悬液浓度为10^-1；吸取1ml浓度为10^-1菌悬液置于盛装9ml无菌水的试管中，配置成浓度为10^-2的菌悬液，按此法依次稀释成浓度为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌悬液，分别吸取0.1ml浓度梯度为10^-5、10^-6的菌悬液至含有ypd培养基的平板中进行涂布培养，于30℃条件培养72h，待生长出独立的酵母菌落即可；用接种针挑取上述ypd平板中菌落形态不同的酵母菌菌落分别划线转接在新的ypd平板中，置于30℃条件下培养72h形成酵母菌单菌落。

（2）产酯酵母的筛选

8°bx麦芽汁液体培养基的制备：取啤酒厂新鲜麦芽汁，利用糖度仪降至8°bx，分装于500ml三角瓶中，每瓶装300ml，115℃灭菌30min，晾凉备用；接种环挑取1～2环上述步骤（1）分离的形态不同的酵母菌单菌落，接种于装有上述8°bx麦芽汁液体培养基中，30℃静置培养72h，制成酵母菌发酵液；吸取200ml上述制成的酵母菌发酵液，加入200ml水，蒸馏得到200ml蒸馏液，利用气相色谱测定蒸馏液中乙酸乙酯含量；根据乙酸乙酯含量筛选出编号为y002的产酯酵母菌为产酯能力最高的一株酵母菌；

（3）产酯酵母菌生产乙酸乙酯香糟

产酯酵母菌液体种子培养基的配制：将鲜酒糟与水按质量比1:5混合，静置24h，过滤得滤液，加0.5%酵母浸粉，1%葡萄糖，1%蛋白胨，ph5.5，115℃灭菌30min，晾凉备用；挑取两环步骤（2）筛选的产酯酵母菌y002纯菌落，接种于上述配置好的产酯酵母液体种子培养基中，30℃条件下摇床（140r/min）培养72h，制作成产酯酵母液体种子悬液；取新鲜清蒸清茬的丢弃酒糟送入摊凉机摊凉30℃，在摊凉机摊凉的过程中均匀喷洒上述步骤制备的产酯酵母y002液体种子悬液和酒精浓度为95%vol的食用乙醇，其中，产酯酵母y002液体种子悬液的添加量为丟糟质量的2%；95%vol的食用乙醇的使用量为丟糟质量的4%；然后将丟弃酒糟松散的倒入地缸中培养，中间留有通气孔，入缸温度30℃，培养时间48h，待酒糟产生浓郁的乙酸乙酯香气时即为产酯香糟培养成熟；

（4）产酯香糟应用于白酒酿造

将步骤（3）培养成熟的产酯香糟，松散均匀的装入甑桶进行蒸汽蒸馏，经冷凝器冷凝后收集得到含有高浓度乙酸乙酯的调香液，将该调香液均匀喷洒到正常出池的酒醅中，再将出池酒醅均匀松散的装入甑桶中蒸馏，蒸馏的原酒中乙酸乙酯含量明显增加，且酯香自然浓郁，酒体丰满。

实施例3进行了2次，分别是实验5和实验6，并设立对照组。从表1中可以很明显的看出，实验组原酒中的乙酸乙酯含量与对照组相比有很大程度的提高，这说明调香液的作用明显。

实施例4

原酒的感官品评

本发明方法制备的原酒感官评价，是由多名高级品酒师分别对实验组和对照组原酒样进行暗评，最后汇总得到表2中的综合评语，原酒定级好次顺序：-1级＞1级＞2级＞+2级＞。

由表2可以看出，实验组原酒乙酸乙酯香明显，入口甜，余味长，质量皆好于对照组，尤其实验2和实验3，出现明显的回甜感，定为-1级；而对照组中，乙酸乙酯香程度弱于实验组，且酒体杂且尾味微显苦；对比发现，实验组原酒的感官评语好于对照组，说明使用乙酯调香液，可以提升原酒质量。

实施例5

产酯酵母y002的分子生物学鉴定

（1）用接种环自新活化的y002酵母菌株的ypd斜面上挑取少量菌落（一环），置于已灭菌的1.5ml的离心管内；

（2）向该离心管内加入100μl裂解液（100mmtris，30mmedta，0.5%sds，ph8.0，15p灭菌30分钟备用），100℃水浴15分钟；

（3）再加入100μl2.5m的醋酸钾后，置于冰上30分钟至一个小时；在4℃下13000rpm离心5分钟后，吸取上清液移至一新1.5ml离心管内；

（6）向装有上清液的离心管内加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），剧烈震荡后，13000rpm，离心15分钟，再次移取上清液至另一灭菌的1.5ml的离心管内；

（7）重复上一步，直到两相之间没有沉淀，将上清液移至另一灭菌的0.5ml的离心管内；

（8）加入等体积的冷的异丙醇，放置在-20℃下静置15分钟，13000rpm离心15分钟；

（9）用100μl70%的乙醇洗涤沉淀，用100μl100%的乙醇再次洗涤沉淀；

（10）将沉淀置于真空干燥器中抽干或自然干燥；

（11）加入50μl已灭菌的mili-q水，在4℃下溶解两小时；

（12）将所得的pcr扩增原液送交测序公司，经过pcrpurificationkit（biomed公司）纯化回收后，通过自动测序仪（abiprism377dnasequencer，abiprism3100geneticanalyzer）得到供试菌株pcr扩增片段的原始序列。

（13）用dnastar软件并结合dna正反向序列图谱对dna序列进行手工校正。

（14）将校正后的序列在国际核酸数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）、酵母基因组数据库（http://www.cbs.knaw.nl/collections/）和在线序列分析工具

ztaxon中进行同源序列的搜索比对，可以获得与待鉴定菌株在这段序列上亲缘关系相近的已知种的相关信息，包括与已知种模式菌株在这段序列上的碱基差异，已知种模式菌株的mbl/ddbj/genbank序列号。

第一个序列为模式菌株wickerhamomycesanomalusdq-21的部分6s核糖体序列；第二个序列为本发明方法制得的产酯酵母菌y002的部分26s核糖体序列，图中的序列是通过blast软件将两个序列进行了比较，以便确认我们这株菌是wickerhamomycesanomalus

模式菌株wickerhamomycesanomalusdq-21的部分6s核糖体序列wickerhamomycesanomalusstraindq-2126sribosomalrnagene,partialsequencetcaaagggcattgctcagtacggcgagtgagcggcaaaagctcaaatttgaaatctagcaccttcggtgttcgagttgtaatttgaagatggtaaccttgggtttggctcttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtctgatgagatgcccattcctatgtaaggtgctatcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcattagatcagacttggtgttttacgattatcttctcttcttgagttgtgcactcgtatttcactgggccagcatcgattcggatggcaagataatggcagttgaatgtggcttcacttcggtggagtgttatagcttctgctgatattgcctgtctggatcgagggctgcgtcttttgactaggatgctggcgtaatgatctaatgccgcccgtcttgaaccacggacca

产酯酵母菌y002的部分26s核糖体序列y002strain

gctcagtacggcgagtgagcggcaaaagctcaaatttgaaatctagcaccttcggtgttcgagttgtaatttgaagatggtaaccttgggtttggctcttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtctgatgagatgcccattcctatgtaaggtgctatcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcattagatcagacttggtgttttacgattatcttctcttcttgagctgtgcactcgtatttcactgggccagcatcgattcggatggcaagataatggcagttgaatgtggcttcacttcggtggagtgttatagcttctgctgatattgcctgtctggatcgagggctgcgtcttttgactaggatgctggcgtaatgatctaatgccgcccgtcttga

通过blast软件将模式菌株和产酯酵母菌y002的基因序列进行对比，结果显示，二者的详细对为99%。