一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法以及Her2全长蛋白的应用与流程

本发明涉及酶联免疫技术领域，具体涉及一种表达和纯化her2全长蛋白的方法以及her2全长蛋白的应用。

背景技术：

乳腺癌细胞有三种重要受体：雌激素受体(er)，孕激素受体(pr)和her2。er+癌细胞(即具有雌激素受体的癌细胞)依赖于雌激素的生长，可以用药物治疗以阻断雌激素效应(例如他莫昔芬)，且预后较好。her2+癌细胞用单克隆抗体曲妥珠单抗(联合常规化疗)的药物有一定的疗效，并改善了预后。不含任何这三种受体类型的乳腺癌细胞(雌激素受体，孕激素受体或her2)被称为三重阴性，对上述治疗不敏感且预后较差。

her2是跨膜蛋白有膜外膜中和膜内3部分组成。癌细胞裂解her2可释放到血清中，膜外部分可从肿瘤细胞表面脱落进入循环，这使得在血清中队her2的检测可行。通过酶联免疫吸附测定(elisa)检测血清中的her2被广泛研究。

曲妥珠单抗是抗her2的单克隆抗体，它通过将自己附着在her2上来阻止人体表皮生长因子在her2上的附着，从而阻断癌细胞的生长。它可将1-3期her2阳性乳腺癌的5年无病生存率提高到87％(总生存率95％)。通过测血清中her2含量作为筛查乳腺癌的一种方式，不仅对身体无副作用，还能有助于预测对曲妥珠单抗治疗的反应对是否采取曲妥珠单抗治疗方案以直观的指示，但曲妥珠单抗不仅昂贵且对心脏毒性有关。

her2全长蛋白由于其特殊性，难以成功的在常规细胞中表达并纯化出可用的her2全长蛋白，目前仅有的表达her2全长蛋白普遍是采用乳腺癌细胞株，但是采用乳腺癌细胞株表达her2全长蛋白，只适用于一般的功能检测和课题研究，只有纳克级，而能够表达并纯化出her2全长蛋白至少需要达到毫克级别。因此，能够成功表达并纯化出her2全长蛋白将对检测血清中her2含量有很重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达和纯化her2全长蛋白的方法，使得所述方法能够成功表达并纯化出her2全长蛋白，具备较佳的抗原性，并能够和抗her2单抗特异性结合；

本发明的另外一个目的在于提供以上述her2全长蛋白为基础的乳腺癌检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种表达和纯化her2全长蛋白的方法，包括：

步骤1、合成her2全基因，并在全基因两端设计酶切位点，通过酶切连接至昆虫细胞表达载体，获得重组载体；

步骤2、将所述重组载体转染至果蝇卵细胞中，通过筛选获得稳定表达her2全长蛋白的果蝇卵细胞；

步骤3、将所述果蝇卵细胞传代扩增至细胞浓度为2*10⁶个/ml时，离心去掉上清液，留存细胞；

步骤4、用含500um硫酸铜诱导剂的无血清培养基重悬细胞，并诱导表达72小时，收集上清表达液；

步骤5、上清表达液进行ni-nta蛋白纯化，获得her2全长蛋白。

针对目前缺少表达并纯化出her2全长蛋白的方法，本发明选择果蝇卵细胞为表达载体，并制定了一套与之相适宜的表达载体和表达方法，最终表达并纯化出可以直接用于elisa检测中的毫克级以上的her2全长蛋白。

在本发明步骤1中，全基因两端酶切位点的设计需要和后续连接的昆虫细胞表达载体相一致，在本发明具体实施方式中，本发明的酶切位点选择为ncoi和xhoi，昆虫细胞表达载体选择市售的pmt/bip/v5-a。其上，同样具备ncoi和xhoi酶切位点，可顺利连接。

在本发明步骤2中，通过筛选获得稳定表达her2全长蛋白的果蝇卵细胞，根据所选择的昆虫细胞表达载体所具备的筛选标记进行筛选。例如本发明所选择的pmt/bip/v5-a，其上pucori是表达抗药基因，可采用对应的purimycin筛选。

同时，本发明在选择昆虫细胞表达载体上同样兼顾了后续的蛋白纯化步骤，本发明所选择的pmt/bip/v5-a，其还具备his标签，可采用ni-nta蛋白纯化，其中步骤5的ni-nta蛋白纯化具体如下：

步骤5.1、平衡ni-nta柱；

步骤5.2、在上清表达液里混合tris-buffersaline并一同加入柱子，控制流速为0.5ml/min；

步骤5.3、收集滤下的样品，重复上一步骤1次或多次；

步骤5.4、tris-buffersaline洗涤，同时测定od280nm，直到没有蛋白流出为止；

步骤5.5、tris-buffersaline洗杂，收集滤液，直至od280nm测定没有蛋白流出为止；

步骤5.6、tris-buffersaline洗脱，收集每管洗脱液，测定od280nm并电泳检测所收集的洗脱液，检测出目标蛋白，然后透析获得her2全长蛋白。

相对于大肠杆菌等表达宿主，果蝇卵细胞并不是本领域常规表达细胞，故本发明所述果蝇卵细胞传代扩增采用schneider果蝇培养基培养传代扩增。

作为优选，含500um硫酸铜诱导剂的无血清培养基同样采用schneider果蝇培养基。

本发明以果蝇卵细胞(s2)、大肠杆菌感受态细胞(e.coli)、人肾细胞(hkcells)、人类永生化表皮细胞(hacatcells)和小鼠胃癌细胞(mfccells)为her2全长蛋白的表达细胞进行对比试验，结果显示，在参照本发明表达方法的基础上，只有果蝇卵细胞能够表达出her2全长蛋白，而其余常规细胞无法表达出her2全长蛋白。

采用本发明方法获得的her2全长蛋白经westernblot检测her2的抗原性，结果显示0.1μg、0.05μg和0.025μg的her2全长蛋白均能够与hrp标记的抗her2膜外部分的单克隆抗体结合并显色，条带清晰；同时，采用免疫沉淀的方法对her2膜外部分单克隆抗体进行特异性验证，结果显示，乳腺癌细胞裂解液，用igg沉淀后无条带；本发明纯化后的her2全长蛋白以及乳腺癌细胞裂解液，用her2抗体沉淀后可结合显示出条带；上皮细胞裂解液，用her2抗体沉淀后无条带。

基于上述较佳的抗原性和与her2抗体结合的特异性，本发明提供了一种乳腺癌夹心elisa法检测试剂盒，包括本发明所述方法制备的her2全长蛋白。

作为优选，还包括如下组分的一种或两种以上：

包被有抗her2单克隆抗体1的载体、pbs-t、连接酶hrp的抗her2的单克隆抗体2和tmb。

此外，本发明还提供了一种检测her2含量的方法，包括：

步骤1、将本发明所述方法制备的her2全长蛋白分别稀释为100ng/100ul、80ng/100ul、60ng/100ul、40ng/100ul梯度浓度，0ng/100ul作为阴性对照，包被有抗her2单克隆抗体1的载体上每个孔加入梯度浓度样本100ul，做复孔，室温2小时孵育；

步骤2、用pbs-t洗涤，加连接酶hrp的抗her2的单克隆抗体2，室温1小时孵育；

步骤3、用pbs-t洗涤，加酶底物tmb显色10分钟，测od450nm值，绘制标准曲线，待用；

步骤4、加待测血清至包被有抗her2单克隆抗体1的载体上，室温2小时孵育；

步骤5、用pbs-t洗涤，加连接酶hrp的抗her2的单克隆抗体2，室温1小时孵育；

步骤6、用pbs-t洗涤，加酶底物tmb显色10分钟，测od450nm值，代入到步骤3中的标准曲线，获得待测血清中her2含量。

上述检测方法在0-100ng/100ulher2里有良好的线性区间，同时可有效识别血清中her2的含量，对乳腺癌患者的预后有重要指导作用。

由以上技术方案可知，本发明以果蝇卵细胞作为表达her2全长蛋白的宿主细胞，联合适宜的昆虫细胞表达载体、筛选方法、细胞传代扩增方法以及蛋白纯化方法组成系统的her2全长蛋白表达纯化方法，获得了毫克级以上的目标蛋白，并具备较佳的抗原性和与抗her2单抗结合的特异性，可通过夹心elisa法有效识别血清中her2的含量，对乳腺癌患者的诊断分型和预后有重要指导作用。

附图说明

图1所示为不同表达宿主细胞表达her2全长蛋白的电泳结果；其中，泳道1为marker，由上至下依次为250kd、155kd、100kd、75kd、50kd；泳道2-7依次为s2细胞、s2细胞、e.coli细胞、hkcells、hacatcells和mfccells；箭头所指为175kdher2全长蛋白条带；

图2所示为westernblot检测her2全长蛋白抗原性的结果；其中，泳道1-4依次表示0、0.1、0.05、0.025μgher2全长蛋白的结果；

图3所示为免疫沉淀法检测her2全长蛋白特异性结合抗her2单抗的结果；其中，泳道1为igg免疫沉淀乳腺癌细胞裂解液，泳道2为her2膜外部分单克隆抗体免疫沉淀her2全长蛋白，泳道3为her2膜外部分单克隆抗体免疫沉淀乳腺癌细胞裂解液，泳道4为her2膜外部分单克隆抗体免疫沉淀上皮细胞裂解液；

图4所示为本发明夹心elisa法标准曲线；其中，1-5依次表示100ng/100ul、80ng/100ul、60ng/100ul、40ng/100ul、0ng/100ul梯度浓度的her2全长蛋白；

图5所示为检测实际血清样本的od值柱形图；其中，1为乳腺癌阴性血清样本；2为乳腺癌血清样本，病理活检her2阴性；3-5为乳腺癌血清样本，病理活检her2阳性。

具体实施方式

本发明公开了一种表达和纯化her2全长蛋白的方法以及her2全长蛋白的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种表达和纯化her2全长蛋白的方法以及her2全长蛋白的应用做进一步说明。

实施例1：表达纯化her2全长蛋白

1、蛋白表达

在ncbi上找到目的序列，ncbireferencesequence:nm_004448.3。在目的序列前后分别添加ncoi和xhoi，全基因合成her2序列，并构建到pmt/bip/v5-a中；

将her2/pmt/bip/v5-a重组质粒转染进果蝇卵细胞(s2细胞)，转染后48小时用purimycin筛选(purimycin终浓度为2ug/ml)，经过3周的筛选，得到稳定表达her2蛋白的果蝇卵细胞；

将稳定表达her2蛋白的果蝇卵细胞采用schneider果蝇培养基培养传代扩增；

经过一周扩增，使细胞浓度为2*10⁶个/ml时，离心去掉上清液，留存细胞。

用一升由无血清培养液加入500um的硫酸铜诱导剂的表达液重悬细胞，并用225rpm37℃摇晃72小时。诱导表达72小时后，收集上清表达液。

2、蛋白纯化

装柱：将ni-nta装入柱中(也可以是预装柱)；

平衡：待柱中的保存液流干，加入5-10倍柱床体积的tris-buffersaline(ph7.2)-0平衡柱子，控制流速约1ml/min；

上样：将在上清表达液里混合tris-buffersaline(ph7.2)一同加入柱子，控制流速约0.5ml/min；

重复上样：收集滤下的样品，重复上样步骤1次；

洗涤：用约10倍柱床体积的tris-buffersaline(ph7.2)洗涤，测定od280nm，直到没有蛋白流出为止；

洗杂：用约10倍柱床体积的tris-buffersaline(ph7.2)洗杂，收集滤液，直至od280nm测定没有蛋白流出为止；

洗脱：用约15-20倍柱床体积的tris-buffersaline(ph7.2)洗脱，收集每管洗脱液，测定od280nm并电泳检测所收集的洗脱液，检测出目标蛋白，然后透析获得her2全长蛋白。经过多次表达纯化，每升表达液可以拿到5-10毫克的her2全长蛋白。

实施例2：不同表达宿主细胞表达her2全长蛋白的对比试验

以果蝇卵细胞(s2)、大肠杆菌感受态细胞(e.coli)、人肾细胞(hkcells)、人类永生化表皮细胞(hacatcells)和小鼠胃癌细胞(mfccells)为表达宿主细胞，按照实施例1中蛋白表达的方法进行蛋白表达，将上清表达液进行sds-page(各组点样浓度30微升)，结果见图1。

her2全长蛋白大小为175kd，由图1可以明显看出，只有以果蝇卵细胞为表达宿主细胞才能够表达出目标蛋白，而其余几种表达宿主细胞并无目标条带。

实施例3：westernblot检测her2的抗原性

分别将0、0.1、0.05、0.025μgher2全长蛋白跑sds-page电泳。将电泳好的sds-page转印到硝酸纤维膜上；用5％的脱脂奶粉室温封闭1h，用pbst洗膜3次，每次1min；

用hrp标记的抗her2膜外部分的单克隆抗体孵育硝酸纤维膜，室温孵育1h；用pbst洗膜5次，每次1min；加tmb显色，结果见图2。

由图2可以看出，0.1μg、0.05μg和0.025μg的her2全长蛋白均能够与hrp标记的抗her2膜外部分的单克隆抗体结合并显色，条带清晰，表明本发明制备的her2全长蛋白有很好的抗原性。

实施例4：免疫沉淀法对her2膜外部分单克隆抗体进行特异性验证

收获细胞(乳腺癌细胞或上皮细胞)，加入适量细胞ip裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)免疫沉淀，冰上或者4℃裂解30min，12000g离心30min后取上清；

取少量裂解液以备westernblot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50μlproteina/g-beads加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜；

免疫沉淀反应后，在4℃以3000g速度离心5min,将proteina/g-beads离心至管底；将上清小心吸去，proteina/g-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入5μl的5×sds加样缓冲液，沸水煮10分钟；用各免疫沉淀裂解液sds-page电泳；

将电泳好的sds-page转印到硝酸纤维膜上；用5％的脱脂奶粉室温封闭1h，用pbst洗膜3次，每次1min；

用hrp标记的抗her2膜外部分的单克隆抗体孵育硝酸纤维膜，室温孵育1h；用pbst洗膜5次，每次1min；加tmb显色；

根据图3结果可知，乳腺癌细胞裂解液，用igg沉淀后无条带；本发明纯化后的her2全长蛋白以及乳腺癌细胞裂解液，用her2抗体沉淀后可结合显示出条带；上皮细胞裂解液，用her2抗体沉淀后无条带。结果表明，本发明制备的全长her2全长蛋白能够特异性的结合抗her2膜外部分的单克隆抗体以及乳腺癌的裂解液。

实施例5：乳腺癌夹心elisa法检测试剂盒及其检测方法

1、试剂盒

本发明制备的her2全长蛋白、包被抗her2单克隆抗体1的96孔板、pbs-t和连接酶hrp的抗her2的单可隆抗体2；

2、检测方法

将her2全长蛋白分别稀释为100ng/100ul、80ng/100ul、60ng/100ul、40ng/100ul梯度浓度，0ng/100ul作为阴性对照，包被有抗her2单克隆抗体1的96孔板上每个孔加入梯度浓度样本100ul，做复孔，室温2小时孵育；

用pbs-t洗涤，加连接酶hrp的抗her2的单克隆抗体2，室温1小时孵育；

用pbs-t洗涤，加酶底物tmb显色10分钟，测od450nm值，绘制标准曲线(见图4)，待用；

加100微升待测血清至包被有抗her2单克隆抗体1的96孔板上，室温2小时孵育；

用pbs-t洗涤，加连接酶hrp的抗her2的单克隆抗体2，室温1小时孵育；

用pbs-t洗涤，加酶底物tmb显色10分钟，测od450nm值，代入到标准曲线，获得待测血清中her2含量。

3、临床血清样本检测

选取临床血清样本5份，一份为乳腺癌阴性血清，一份为乳腺癌阳性血清，但病理活检her2阴性；剩余血清为乳腺癌阳性血清，病理活检her2阳性；

根据图5的检测结果可以看出，本发明试剂盒以及检测方法能够有效识别血清中her2的含量，对乳腺癌患者的预后有重要指导作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。