本发明属于动物病毒学技术领域。具体涉及一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法。所述的猪肠道冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪δ冠状病毒(pdcov)和猪传染性胃肠炎病毒(tgev)。
背景技术：
猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,pedv)、猪δ冠状病毒(porcinedeltacoronavirus,pdcov)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus,tgev)均属于套式病毒目、冠状病毒科，是引起猪肠道感染，导致腹泻的三种主要病毒，尤其是pedv和pdcov近年来在临床上感染严重，给养猪业造成了巨大的经济损失。
病毒分离是疾病诊断的重要依据，也是疫苗研制的关键和诊断方法建立的前提，但猪肠道冠状病毒存在分离难度大、分离率低、分离率不稳定的问题，低的分离率为3％-5％，高的也只有10％左右(zhangjianqiang.porcinedeltacoronavirus:overviewofinfectiondynamics,diagnosticmethods,prevalenceandgeneticevolution.virusresearch.2016,226:71–84.)。由于获得病毒的难度大，从而严重影响了猪肠道冠状病毒预防措施的制订、利用和相关基础研究的发展，当前急需建立一种稳定、高效的猪肠道冠状病毒分离方法。传统的分离猪肠道冠状病毒的方法为：采集发病猪的粪便或小肠内容物，加入一定量的pbs或dmem或其它细胞培养液，混合均匀后反复冻融3次，在5000r/min下离心15min，取上清至另一无菌离心管中，在10000r/min下离心1h，取上清，加入双抗，于2～8℃下作用4h以上，再用滤器过滤除菌，取滤液接种敏感细胞。由于粪便和小肠内容物均对细胞的毒性较大，接种量大时往往导致细胞不能正常生长，甚至裂解死亡，因此病毒也不能有效增殖；接种量小时，由于病毒的含量低，很难分离到病毒。
技术实现要素：
本发明的目的就是针对上述现有技术存在的缺陷，采用差速离心去杂质、利用聚乙二醇(peg)6000沉淀浓缩病毒，再通过蔗糖梯度离心纯化病毒等步骤，最大限度降低了猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪δ冠状病毒(pdcov)和猪传染性胃肠炎病毒(tgev)病毒样品中的杂质含量，浓缩了病毒。本发明制备的病毒样品尤其适用于接种细胞，分离病毒。相对于现有技术制备的病毒样品，对细胞的毒性大幅度下降，病毒分离率显著提高，分离率可由传统方法的10％左右提高到40％以上。
实现本发明目的的技术方案如下所述：
一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法，其步骤包括：病料检测、阳性小肠内容物收集与稀释、冻融、离心、取上清加抗生素处理、过滤除菌和接种细胞；其特征在于，在过滤除菌之后和接种细胞之前增加了聚乙二醇沉淀浓缩病毒和蔗糖梯度离心纯化病毒的步骤，具体步骤如下所述；
(1)取16ml阳性仔猪小肠内容物的滤液，加入4ml浓度为2.5mol/l的nacl溶液，混匀后加入等体积的浓度为10％的聚乙二醇6000溶液，于2～8℃下搅拌沉淀24h，在12000r/min下离心1h，吸弃上清，得沉淀；
(2)向沉淀中加入2ml无血清dmem培养液，于2～8℃下重悬过夜；
(3)将3种不同浓度的蔗糖溶液加入到无菌的超速离心管中：先加3.5ml30％的蔗糖溶液，再用加样针伸到超速离心管底部注入3.5ml45％的蔗糖溶液，最后用加样针伸到超离管底部注入3.5ml60％的蔗糖溶；取2ml重悬的样品加到30％蔗糖垫层的上面，在30000r/min离心3h,离心后在30％蔗糖与45％蔗糖之间可见乳白色的猪流行性腹泻病毒(pedv)病毒带或猪δ冠状病毒(pdcov)病毒带或猪传染性胃肠炎病毒(tgev)病毒带；
(4)用加样针分别吸取pedv病毒带或pdcov病毒带或tgev病毒带转移至另一个无菌超速离心管中，补加无血清dmem培养液至12.5ml，在30000r/min下离心4h，吸弃上清，沉淀用1ml无血清dmem培养液于2～8℃重悬过夜。
上述高效分离猪肠道冠状病毒的方法中所述的猪肠道冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒。
本发明的具体顺序步骤如下所述：
(1)在超净台上分别无菌收集经rt-pcr检测为猪流行性腹泻病毒(pedv)或猪δ冠状病毒(pdcov)或猪传染性胃肠炎病毒(tgev)为阳性的仔猪小肠内容物，加入等体积的无血清dmem培养液(购自gibco公司，下同)，混匀后置于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心15min，取上清至另一无菌离心管中，10000r/min离心1h，取上清，加入终浓度为500u/ml的青霉素和500μg/ml的链霉素，于2～8℃下作用过夜，再用0.45μm滤膜过滤除菌；
(2)取16ml滤液，加入4ml浓度为2.5mol/l的nacl溶液，混匀后加入等体积的浓度为10％的聚乙二醇(peg)6000溶液，于2～8℃下搅拌沉淀24h，12000r/min离心1h，吸弃上清，得沉淀；
(3)向沉淀中加入2ml无血清dmem培养液，于2～8℃下重悬过夜；
(4)将3种不同浓度的蔗糖溶液依次加入到无菌的超速离心管中：即，先加3.5ml30％的蔗糖溶液，再用加样针伸到超速离心管底部注入3.5ml45％的蔗糖溶液，最后用加样针伸到超离管底部注入3.5ml60％的蔗糖溶液。取2ml重悬的样品加到30％蔗糖垫层的上面，30000r/min离心3h,离心后在30％蔗糖溶液与45％蔗糖溶液之间可见乳白色的病毒带；
(5)用加样针吸取病毒带到一新的无菌的超速离心管中，补加无血清dmem培养液至12.5ml，30000r/min离心4h，吸弃上清，沉淀用1ml无血清dmem培养液于2～8℃重悬过夜；
(6)根据分离病毒的不同，将重悬的病毒液按下列方法之一接种至细胞：
1)分离pedv：将6孔细胞培养板中的vero细胞单层用无血清dmem培养液洗2次，取200μl重悬的样品接种一孔，在37℃，5％co2培养箱中吸附1h，吸弃所述的pedv病毒液，加入2ml含7.5μg/ml胰酶的无血清dmem培养液，于37℃，5％co2培养箱中继续培养，每日于显微镜下观察两次，出现细胞病变后及时收毒，对接种后96h仍无病变者，收集样品于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清按同样方法再接种vero细胞，按上述步骤共盲传5代，对仍无病变者经灭菌处理后丢弃。
2)分离pdcov：将6孔细胞培养板中的llc-pk1细胞单层用无血清mem培养液洗2次，取200μl重悬的样品接种一孔，在37℃，5％co2培养箱中吸附1h，吸弃所述的pdcov病毒液，加入2ml含7.5μg/ml胰酶的无血清mem培养液，于37℃，5％co2培养箱中继续培养，每日于显微镜下观察两次，出现细胞病变后及时收毒，对接种后96h仍无病变者，收集样品于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清按同样方法再接种llc-pk1细胞，按上述步骤共盲传5代，对仍无病变者经灭菌处理后丢弃。
3)分离tgev：取200μl重悬的样品接种6孔细胞培养板中培养的st细胞单层一孔，37℃5％co2培养箱中吸附1h，吸弃所述的tgev病毒液，加入2ml含2％血清的dmem培养液，于37℃5％co2培养箱中继续培养。每日于显微镜下观察两次，出现细胞病变后及时收毒，对接种后96h仍无病变者，收集样品于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清再接种细胞，如此共盲传5代，对仍无病变者经灭菌处理后丢弃。
本发明的效果如下：
本发明的发明点在于，在过滤除菌步骤之后和接种细胞步骤之前增加了聚乙二醇沉淀浓缩病毒和蔗糖梯度离心纯化病毒的步骤，这种创新性的改进，最大限度地降低了猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪δ冠状病毒(pdcov)和猪传染性胃肠炎病毒(tgev)病毒样品中的杂质含量，浓缩和纯化了病毒。
本发明制备的病毒样品尤其适用于接种细胞，分离病毒。相对于现有技术制备的病毒样品，本发明对细胞的毒性大幅度下降，猪的三种冠状病毒的分离率显著提高，病毒分离率由传统方法的10％左右提高到40％以上。
附图说明
图1：是本发明的总体技术流程图。
具体实施方式
实施例1
采用本发明的方法和传统方法(对照)进行猪流行性腹泻病毒(pedv)分离率比较。同一份样品同时采用两种方法处理后各接种6孔板培养的非洲绿猴肾传代细胞(简称vero细胞)一个孔。
本发明的方法：
试验样品为2016年申请人在湖北省某猪场经rt-pcr检测为猪流行性腹泻病毒(pedv)(实施本发明不限于该病毒)阳性的仔猪小肠43份。具体操作方法如下：在超净台中无菌收集仔猪小肠内容物，加入等体积的无血清dmem培养液(购自gibco公司)，混匀后置于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心15min，取上清至另一无菌离心管中，10000r/min离心1h，取上清，加入终浓度为500u/ml的青霉素和500μg/ml的链霉素，于2～8℃下作用过夜，再用0.45μm滤膜过滤除菌，取16ml滤液，加入4ml浓度为2.5mol/l的nacl溶液(nacl的终浓度为0.5mol/l)，混匀后加入等体积的浓度为10％的聚乙二醇(peg)6000溶液，于2～8℃下搅拌沉淀24h，12000r/min下离心1h，吸弃上清，向沉淀中加入2ml无血清dmem培养液，于2～8℃下重悬过夜；将3种不同浓度的蔗糖加入12.5ml无菌的超速离心管中，具体步骤为：先加3.5ml30％的蔗糖溶液，再用加样针伸到超离管底部注入3.5ml45％的蔗糖溶液，最后用加样针伸到超离管底部注入3.5ml60％的蔗糖溶液。取2ml重悬的样品加到30％蔗糖垫层的上面，30000r/min离心3h,离心后在30％蔗糖与45％蔗糖之间可以看到乳白色的pedv病毒带。用加样针吸取pedv病毒带到一新的无菌的12.5ml超离管中，补加无血清dmem培养液至12.5ml，30000r/min离心4h，吸弃上清，沉淀用1ml无血清dmem培养液于2～8℃重悬过夜。将6孔细胞培养板中的vero细胞单层用无血清dmem培养液洗2次，取200μl重悬的样品接种一孔，在37℃，5％co2培养箱中吸附1h，吸弃pedv病毒液，加入2ml含7.5μg/ml胰酶的无血清dmem培养液，于37℃，5％co2培养箱中继续培养。每日于显微镜下观察两次，出现细胞病变后及时收毒，对接种后96h仍无病变者，收集样品于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清再接种细胞，如此共盲传5代，对仍无病变者经灭菌处理后丢弃。结果从19份实验样品中分离到病毒，病毒分离率为44.18％(表1)。相关溶液的配制见附录。
传统方法(对照)：
试验样品为2016年申请人在湖北省某猪场经rt-pcr检测为猪流行性腹泻病毒(pedv)(实施本发明不限于该病毒)阳性的仔猪小肠43份。具体操作方法如下：在超净台中无菌收集仔猪小肠内容物，加入等体积的无血清dmem培养液(购自gibco公司)，混匀后置-80℃反复冻融3次，5000r/min离心15min，取上清至另一无菌离心管中，10000r/min离心1h，取上清，加入终浓度为500u/ml的青霉素和500μg/ml的链霉素，于2～8℃下作用过夜，用0.45μm滤膜过滤除菌，收集滤液用于接种细胞。将6孔细胞培养板中的vero细胞单层用无血清dmem培养液洗2次，取1ml滤液接种一孔，37℃5％co2培养箱中吸附1h，吸弃病毒液，用无血清dmem培养液洗2次，加入2ml含7.5μg/ml胰酶的无血清dmem培养液，于37℃5％co2培养箱中继续培养。每日于显微镜下观察两次，出现细胞病变后及时收毒，对接种后96h仍无病变者，收集样品于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清再接种细胞，如此共盲传5代，对仍无病变者经灭菌处理后丢弃。结果只从2份实验样品中分离到(pedv)病毒，(pedv)病毒分离率为4.65％(表1)。
表1猪流行性腹泻病毒(pedv)的分离率统计
实施例2
采用本发明的方法和传统方法(对照)对猪δ冠状病毒(pdcov)分离率进行了比较。同一份样品同时采用两种方法处理后各接种6孔板培养的猪肾传代细胞(简称llc-pk1细胞)一个孔。
本发明的方法：
实验样品为2017年申请人在河北省某猪场经rt-pcr检测为pdcov阳性的仔猪小肠40份。具体操作方法如下：在超净台中无菌收集仔猪小肠内容物，加入等体积的无血清mem培养液(购自gibco公司)，混匀后置-80℃反复冻融3次，5000r/min离心15min，取上清至另一无菌离心管中，10000r/min离心1h，取上清，加入终浓度为500u/ml的青霉素和500μg/ml的链霉素于2～8℃下作用过夜，再用0.45μm滤膜过滤除菌，取16ml滤液，加入4ml浓度为2.5mol/l的nacl溶液(nacl的终浓度为0.5mol/l)，混匀后加入等体积的浓度为10％的聚乙二醇(peg)6000溶液，于2～8℃下搅拌沉淀24h，12000r/min下离心1h，吸弃上清，向沉淀中加入2ml无血清mem培养液，于2～8℃下重悬过夜。将3种不同浓度的蔗糖加入12.5ml无菌的超速离心管中，具体为：先加3.5ml30％的蔗糖溶液，再用加样针伸到超离管底部注入3.5ml45％的蔗糖溶液，最后用加样针伸到超离管底部注入3.5ml60％的蔗糖溶液。取2ml重悬的样品加到30％蔗糖垫层的上面，30000r/min离心3h,离心后在30％蔗糖与45％蔗糖梯度之间可以看到乳白色的pdcov病毒带；用加样针吸取pdcov病毒带到一新的无菌的12.5ml超离管中，补加无血清mem培养液至12.5ml，30000r/min离心4h，吸弃上清，沉淀用1ml无血清mem培养液于2～8℃重悬过夜。将6孔细胞培养板中的llc-pk1细胞单层用无血清mem培养液洗2次，取200μl重悬的样品接种一孔，在37℃，5％co2培养箱中吸附1h，吸弃pdcov病毒液，加入2ml含7.5μg/ml胰酶的无血清mem培养液，于37℃5％co2培养箱中继续培养。每日于显微镜下观察两次，出现细胞病变后及时收毒，对接种后96h仍无病变者，收集样品于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清再接种细胞，如此共盲传5代，对仍无病变者经灭菌处理后丢弃。结果从18份实验样品中分离到pdcov病毒，pdcov病毒分离率为45％(表2)。
传统方法(对照)：
实验样品为2017年申请人在河北省某猪场经rt-pcr检测为pdcov阳性的仔猪小肠40份。具体操作方法如下：在超净台中无菌收集仔猪小肠内容物，加入等体积的无血清mem培养液(gibco)，混匀后置-80℃反复冻融3次，5000r/min离心15min，取上清至另一无菌离心管中，10000r/min离心1h，取上清，加入终浓度为500u/ml的青霉素和500μg/ml的链霉素，于2～8℃下作用过夜，用0.45μm滤膜过滤除菌，收集滤液用于接种细胞。将6孔细胞培养板中的llc-pk1细胞单层用无血清mem培养液(gibco)洗2次，取1ml滤液接种一孔，37℃5％co2培养箱中吸附1h，吸弃病毒液，用无血清mem培养液(gibco)洗2次，加入2ml含7.5μg/ml胰酶的无血清mem培养液(gibco)，于37℃5％co2培养箱中继续培养。每日于显微镜下观察两次，出现细胞病变后及时收毒，对接种后96h仍无病变者，收集样品，于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清再接种细胞，如此共盲传5代，对仍无病变者灭菌处理后丢弃。结果40份实验样品只有2份分离到病毒，病毒分离率为5％(表2)。
表2猪δ冠状病毒的分离率统计
实施例3
采用本发明的方法和传统方法(对照)进行猪传染性胃肠炎病毒(tgev)分离率比较。同一份样品同时采用两种方法处理后各接种6孔板培养的猪睾丸传代细胞(st细胞)一个孔。
本发明的方法：
试验样品为2017年申请人在湖北省某猪场经rt-pcr检测为tgev阳性的仔猪小肠50份。具体操作方法如下：在超净台中无菌收集仔猪小肠内容物，加入等体积的无血清dmem培养液(购自gibco公司)，混匀后置-80℃反复冻融3次，5000r/min离心15min，取上清至另一无菌离心管中，10000r/min离心1h，取上清，加入终浓度为500u/ml的青霉素和500μg/ml的链霉素，于2～8℃下作用过夜，用0.45μm滤膜过滤除菌，取16ml滤液，加入4ml浓度为2.5mol/l的nacl溶液(nacl的终浓度为0.5mol/l)，混匀后加入等体积的浓度为10％的聚乙二醇(peg)6000溶液，于2～8℃搅拌沉淀24h，12000r/min离心1h，吸弃上清，向沉淀中加入2ml无血清dmem培养液，于2～8℃重悬过夜；将3种不同浓度的蔗糖加入12.5ml无菌的超速离心管中，先加3.5ml30％的蔗糖溶液，再用加样针伸到超离管底部注入3.5ml45％的蔗糖溶液，最后用加样针伸到超离管底部注入3.5ml60％的蔗糖溶液，取2ml重悬的样品加到30％蔗糖垫层的上面，30000r/min离心3h,离心后在30％蔗糖与45％蔗糖梯度之间可以看到乳白色的病毒带；用加样针吸取tgev病毒带到一新的无菌的12.5ml超离管中，补加无血清dmem培养液至12.5ml，30000r/min离心4h，吸弃上清，沉淀用1ml无血清dmem培养液于2～8℃重悬过夜。取200μl重悬的样品接种6孔细胞培养板中培养的st细胞单层一孔，37℃5％co2培养箱中吸附1h，吸弃病毒液，加入2ml含2％血清的dmem培养液，于37℃5％co2培养箱中继续培养。每日于显微镜下观察两次，出现细胞病变后及时收毒，对接种后96h仍无病变者，收集样品于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清再接种细胞，如此共盲传5代，对仍无病变者经灭菌处理后丢弃。结果从24份实验样品中分离到tgev病毒，tgev病毒分离率为48％(表3)。
传统方法(对照)：
样品为2017年湖北省某猪场经rt-pcr检测为tgev阳性的仔猪小肠50份。具体操作方法如下：在超净台中无菌收集仔猪小肠内容物，加入等体积的无血清dmem培养液(购自gibco公司)，混匀后置-80℃反复冻融3次，5000r/min离心15min，取上清至另一无菌离心管中，10000r/min离心1h，取上清，加入终浓度为500u/ml的青霉素和500μg/ml的链霉素，于2～8℃下作用过夜，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液用于接种细胞。取1ml滤液接种6孔细胞培养板中培养的st细胞单层一孔，于37℃含5％co2的培养箱中吸附1h，吸弃病毒液，用无血清dmem培养液洗2次，加入2ml含2％血清的dmem培养液，于37℃含5％co2的培养箱中继续培养。每日于显微镜下观察两次，出现细胞病变后及时收毒，对接种后96h仍无病变者，收集样品于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清再接种st细胞，如此共盲传5代，对仍无病变者经灭菌处理后丢弃。结果只从3份实验样品中分离到tgev病毒，tgev病毒分离率为6％(表3)。
表3猪传染性胃肠炎病毒的分离率统计
附录：
相关溶液(试剂)的配制：
10％peg6000溶液的配制：称取100gpeg6000加入800ml水中，充分溶解后用蒸馏水定容至1000ml，在121℃高压蒸汽灭菌30min，于4℃下贮藏备用。
2.5mol/lnacl溶液的配制：称取146.25gnacl加入700ml水中，充分溶解后用蒸馏水定容至1000ml，在121℃高压蒸汽灭菌30min，在4℃下贮藏备用。
30％蔗糖溶液的配制：称取300g蔗糖加入600ml水中，充分溶解后用蒸馏水定容至1000ml，用0.22μm滤器过滤后，于4℃下贮藏备用。
45％蔗糖溶液的配制：称取450g蔗糖加入400ml水中，充分溶解后用蒸馏水定容至1000ml，用0.22μm滤器过滤后，4℃贮藏备用
60％蔗糖溶液的配制：称取600g蔗糖加入300ml水中，充分溶解后用蒸馏水定容至1000ml，用0.22μm滤器过滤后，4℃贮藏备用。