本发明属于环境友好型生防制剂，涉及一株短尾噬菌体nn-p42及其应用，专用于防治土传青枯病问题。
背景技术：
番茄青枯病是由茄科劳尔氏菌(ralstoniasolanacearum)引起的一种细菌性维管束病害)，对茄科作物具有毁灭性的灾害。青枯菌寄主范围广，环境适应能力强，变异大，具有复杂的种内遗传。目前在我国大部分地区都有青枯病发生，但南方地区发病严重。传统的防控措施如抗性品种、嫁接轮作、化学农药等具有研发困难、效果不稳定、破坏土壤生态以及食品安全的问题，亟需开发环境友好型的防控措施。
植物根际的微生物群落具备“本能”抵御土传病害的能力，构筑了病原菌入侵植物的第一道防线。土壤微生物主要通过资源竞争、拮抗竞争、诱导植物抗性、捕食及寄生等途径防控病害。但根际有一类更微小但数量丰富的群体-细菌病毒的生防潜力被忽视了。细菌病毒又称之为噬菌体，广泛存在于环境中，其数量是细菌的10倍以上。其中裂解性噬菌体依赖宿主复制并裂解宿主细菌，是主要的生防“后备军”。
噬菌体具有宿主特异性和高效裂解及快速增殖的能力，相比细菌抗生素抗性的单向进化，噬菌体与宿主细菌协同进化更具有生防应用的优势。随着对噬菌体的生物学特性、噬菌体与宿主菌的相互作用关系的研究，对噬菌体安全性和可控性的掌握，噬菌体基因组研究的深入以及通过生物技术对噬菌体的改造研究，噬菌体在生物防控方面将发挥其巨大的应用潜力。针对以上技术问题需要筛选一株裂解性青枯菌的专性噬菌体。
技术实现要素：
针对目前番茄青枯病的生物防治提供一种新的思路和手段，减少病害的发生。利用病原菌特异性噬菌体进行生物防治，能够高效裂解细菌使其死亡，且对环境没有毒性；特异性强，不会破坏其他正常菌群，可保持土壤微生物平衡。本申请人在青枯病发病严重的根际土壤中分离筛选到一株裂解性青枯菌专性噬菌体，并对其生物学特性及裂解性能进行研究。
本发明的另一目的在于提供一种利用此噬菌体快速有效抑制青枯菌的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一株茄科劳尔氏菌专性噬菌体nn-p42，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno:m2018102，分类命名为podoviridaephage。
该茄科劳尔氏菌(ralstoniasolanancearum)专性噬菌体nn-p42分离自青枯病发病严重的根际土壤中，为有尾噬菌体目短尾噬菌体科，基因组大小约为42.28kb。噬菌体培养液过滤除菌后于4℃下可以保存2个月以上，于-70℃下保存于甘油管中可以保存2年以上；所述噬菌体培养液储液浓度为1011pfu/ml。在25℃下7天内可以保持较高活性；37℃下通过添加30％甘油或sm缓冲液可以保持较高的活性。在低资源水平下噬菌体具有稳定的裂解能力。
该茄科劳尔氏菌专性噬菌体nn-p42在防治土传青枯病或制备防治土传青枯病噬菌体制剂的应用中效果显著。
一种防治土传青枯病的噬菌体制剂，该噬菌体制剂中包含上述的茄科劳尔氏菌专性噬菌体nn-p42。作为一种优选技术方案，该噬菌体制剂中噬菌体的含量≥106pfu/ml，进一步优选的，该噬菌体制剂中噬菌体的含量106～1011pfu/ml。该噬菌体制剂可以为噬菌体培养液，该噬菌体制剂中还添加有sm缓冲液或30％甘油。
上述的噬菌体制剂可以长时间的保持较高的活性且在防治土传青枯病的应用中效果显著。
一种防治作物土传青枯病的方法，噬菌体培养液或噬菌体制剂直接以灌根的方式接种到作物的植株根际，添加量约为≥106pfu/g干土，防病率达到60％。
本发明的有益效果：
本发明的噬菌体能够特异性裂解青枯病病原菌，可用于番茄土传青枯病的防治。
附图说明
图1双层琼脂平板上的噬菌斑。
图2噬菌体nn-p42电镜下的形态。
图3噬菌体nn-p42蛋白的sds-page分析。
图4噬菌体nn-p42基因的系统发育树。
图5不同温度对噬菌体nn-p42效价的影响。
图6不同温度下噬菌体nn-p42在不同溶剂中的效价变化。
图7噬菌体在不同营养条件下的抑菌能力。
图8接种噬菌体nn-p42后青枯病发病率(a)和根际病原菌数量(b)。
具体实施方式
(一)噬菌体的分离和鉴定
1.噬菌体的分离纯化
宿主细菌：青枯菌，本实验室从南京市麒麟镇发病番茄植株中分离获得的具有强致病力的青枯菌ql-rs1115(weietal.2011)，简称rs。
噬菌体nn-p42是从广西南宁(108°21′e,22°49′n)长期种植番茄，青枯病发病较为严重的蔬菜大棚的根际土壤中筛选得到的。其分离纯化的过程如下：
培养基：
na液体培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏3g、酵母膏0.5g、去离子水1000ml，调节ph7.2-7.4，115℃高压灭菌30min。
na固体培养基：na液体培养基中加入1.8％(g/100ml)的琼脂粉。
na半固体培养基：na液体培养基中加入0.8％(g/100ml)的琼脂粉。
sm缓冲液：取mgso4·7h2o2.0g，nacl5.8g，1mol/ltris-hcl(ph7.5)50ml，2％明胶5ml，加去离子水，定容至1000ml，分装后于121℃高压灭菌20min，4℃保存，sm缓冲液用于噬菌体的稀释及保存。
将采集的土样按每90mlsm缓冲液加10g土样的比例加入三角瓶中振荡过夜，取出后静置。将土壤悬浮液经0.22μm滤膜过滤后取5ml加入对数期的r.solanacearum菌液中振荡培养12h，将共培养液用0.22μm滤膜过滤后即为噬菌体原液。取0.5ml对数生长期的r.solanacearum菌液与6ml冷却至50℃左右的na半固体培养基混匀，立即倒入已凝固的na固体培养基平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后将平板分区，分别点接2μl的梯度稀释的噬菌体原液(10，102，103，104，105，106，107，108)，30℃倒置培养24h～48h，观察有无噬菌斑(图1)。
当有噬菌斑出现后，挑取单个最大的噬菌斑接入对数生长期的r.solanacearum菌液中，摇匀并静置15min后放入摇床，在30℃条件下，120r/min振荡培养12h使噬菌体增殖，增殖培养后将共培养液用0.22μm滤膜过滤，通过上述双层琼脂培养法得到噬菌斑。重复3～5次即可得到较纯的噬菌体。
将得到的无宿主菌噬菌体溶液直接保存4℃，或与宿主菌一起和30％甘油(v/v)混合后保存于-70℃。
该噬菌体nn-p42，分类命名为podoviridaephage，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno:m2018102。
2.噬菌体的形态观察
取20μl新鲜的噬菌体悬液滴在铜网上，静置使其自然沉淀15min后用滤纸在侧面将多余的液体吸去，然后滴一滴2％的pta(磷钨酸)在铜网上对噬菌体颗粒进行染色，继续静置10min后用滤纸在侧面将多余的染色液吸走，继续静置大概5min左右使样品干燥，最后通过电子显微镜观察噬菌体的形态并拍照记录。
透射电镜观察到噬菌体nn-p42的形态为蝌蚪状，头部是二十面体的立体对称，直径大约为100nm，有一短尾，如图2所示。经过同国际病毒分类委员会的分类标准进行比对，噬菌体nn-p42属于有尾噬菌体目(caudovirales)，短尾噬菌体科(podoviridae)。
3.噬菌体蛋白的sds-page分析
取浓缩后的噬菌体nn-p42颗粒液15μl，同3μl的6×上样缓冲液混均匀，在100℃煮沸5min来达到使蛋白变性的目的，经过高温处理后的样品、蛋白marker各自加入凝胶加样孔(两个孔道不能相邻)，做好标记后接通电源，在90v的电压下大约120min后，待测样品会电泳至浓缩胶与分离胶的交界处，此时将电压升高至150v，直至样品电泳至分离胶下缘，关闭电泳仪，取出凝胶，裁去浓缩胶，将分离胶放在玻璃平皿中，按照常规蛋白银染的方法进行染色，待蛋白条带显色清晰后取出进行扫描。
如图3所示，经蛋白银然后，可观察到至少6个蛋白条带，说明该噬菌体颗粒至少含有6个结构蛋白，相对分子质量在25kda～100kda之间。
4.噬菌体的基因组信息
利用试剂盒(λ噬菌体dna提取试剂盒，abigen)按操作步骤提取噬菌体基因组dna，利用nanodrop2000超微量分光光度计(美国nanodrop公司)检测基因组dna的纯度和浓度，送至上海美吉生物公司进行测序。
测序结果表明噬菌体nn-p42基因组大小约为42.28kb，gc含量约为62.10％。将噬菌体nn-p42的基因组序列与选定的一些标准噬菌体进行blast分析并构建系统发育树。如图4所示，我们分离的噬菌体nn-p42与pelagibacter_phage_htvc010p的同源性最高，从而可以确定噬菌体nn-p4属于有尾噬菌体目(caudovirales)，短尾噬菌体科(podoviridae)。
(二)噬菌体的货架期评价
开发噬菌体产品应用到实际生产中，中间可能经过长途的运输，所以我们必须考虑到噬菌体的货架期，即噬菌体保存的有效条件。
1.保存温度
将活化的噬菌体nn-p42悬浮液(约为1011pfu/ml)分装多管保存，置于4、25、37℃下静止培养一周，记录不同时间(1、2、4、7天)噬菌体效价变化，每个处理设有3个平行重复。结果发现高温37℃对噬菌体的效价影响较大，而低温(4℃)和常温(25℃)下，7天内噬菌体仍能保持较高的数量级，略微降低(图5)。
2.保存溶剂
将活化的噬菌体nn-p42悬浮液(约为1011pfu/ml)分装多管，分别与30％甘油、无菌水、0.85％生理盐水、sm缓冲液四种溶剂按照1：1比例混匀，置于4、25、37℃下静止培养培养一周，记录不同时间(1、2、4、7天)噬菌体效价变化，每个处理设有3个平行重复。相同温度下，不同溶剂对噬菌体的效价的影响不同，其中以生理盐水为溶剂的处理效果最差，噬菌体的数量随时间下降最快。4℃下30％甘油、sm缓冲液和ddh2o处理之间差异不显著(图6-a)；25℃下ddh2o和sm缓冲液处理较好(图6-b)；37℃下sm缓冲液和30％甘油效果较好(图6-c)。说明即使在高温条件下，我们可以通过这两种溶剂来延长噬菌体保存的时间和活性。
(三)噬菌体防控青枯病效果
1.噬菌体在不同资源水平条件下对青枯菌ql-rs1115的抑制效果
配制5个资源水平：na、1/2na、1/10na、1/20na、1/100na培养基，利用微孔板系统，该系统由4个环节组成：培养基、接种细菌、震荡培养以及酶标仪测定od600。青枯菌的接种量为107cfu/ml，噬菌体的接种量为106pfu/ml。30℃震荡培养96h，分别测定不同时间的od600。
结果如图7所示，不同的营养条件对青枯菌的生长及噬菌体的抑菌效果均有影响。在低营养水平下(1/20na)，噬菌体能稳定抑制青枯菌的生长；在高营养水平下，在接种噬菌体后的35h左右能抑制青枯菌的生长，随着培养时间的延长，噬菌体的抑制作用会减弱。这可能是由于后期青枯菌对噬菌体产生抗性，但在低资源水平下青枯菌难以产生抗性，这对实际生产如何调控植物根际资源从而提高噬菌体的防控效率具有一定的指导意义。
2.温室盆栽实验
在宜兴有机固体废弃物资源化协同创新中心的温室大棚考察噬菌体nn-p42防治番茄土传青枯病的效果。
供试土壤为没有青枯菌的水稻土。番茄品种为micro-tom(矮化品种)。
试验设置2个处理，具体如下：
对照，ck：只接种病原菌；
处理，nn-p42：接种病原菌和噬菌体nn-p42。
micro-tom番茄种子经表面消毒后：用70％的酒精浸泡1min，无菌水洗涤1次，用3％的naclo溶液浸泡5min，无菌水漂洗6次。将消毒好的种子放入垫有无菌双蒸水浸湿滤纸的无菌平板中，30℃催芽两天。发芽的种子移植到9孔育苗盘中(装有土壤)。每处理3盘(9个重复，共27棵番茄苗)，3叶期番茄苗接种青枯菌，浓度5.0×107cfu/g干土；接种青枯菌5天后接种噬菌体悬液，浓度5.0×106pfu/g干土。完成接种后每天统计发病率，最后试验结束时每个处理随机采3棵健康的番茄苗，采集根际土壤。
采用定量pcr测定番茄根际青枯菌总量。采集根际土后，用试剂盒提取土壤dna。青枯菌特异性引物为flicf：5′-gaacgccaacggtgcgaact-3′，flicr：5′-ggcggccttcagggaggtc-3′(schonfeldetal.2003)(由南京金斯瑞生物有限公司合成)。病原菌的荧光定量pcr采用
将1g根际土壤与9ml无菌去离子水混合，170rpm震荡30min，制备的土壤悬液用0.22μm滤膜过滤后即为噬菌体原液。取0.5ml对数生长期的rs菌液与6ml冷却至50℃左右的na半固体培养基混匀，立即倒入已凝固的na固体培养基平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后将平板分区，分别点接50μl的梯度稀释的噬菌体原液，30℃培养24～48h，统计噬菌斑的数量即可得到噬菌体的数量。
噬菌体nn-p42的防治效果如图8所示，接种噬菌体nn-p42表现出很好的防治效果。对照组发病率高达83.33％，而nn-p42处理的发病率为33.33％，显著低于对照组。根际病原菌的数量处理组也低于对照组(如图8b所示)。试验结果说明噬菌体nn-p42能够显著降低青枯病的发病率。本发明对筛选得到的一株青枯菌专性噬菌体进行了生物学特性的分析、货架期评价及防病效果的检测。
schonfeld,j.,heuer,h.,vanelsas,j.d.&smalla,k.(2003).specificandsensitivedetectionofralstoniasolanacearuminsoilonthebasisofpcramplificationofflicfragments.appl.environ.microbiol.,69,7248-7256.
wei,z.,yang,x.m.,yin,s.x.,shen,q.r.,ran,w.&xu,y.c.(2011).efficacyofbacillus-fortifiedorganicfertiliserincontrollingbacterialwiltoftomatointhefield.appl.soilecol.,48,152-159。