本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类具有多靶点抗肿瘤活性的吴茱萸碱衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
当前，癌症已经成为一种严重威胁人类健康和生命的疾病。目前临床上治疗恶性肿瘤主要采用联合用药的方法，但是这种方法存在很多缺陷，比如需要确证药物配伍合理性、可能发生的药物-药物相互作用和复杂的药代动力学性质等。多靶点药物作用于肿瘤疾病网络中的多个关键环节或位点，发挥协同抗肿瘤的效果，其对肿瘤的治疗效果优于单一药物的疗效。此外，多靶点药物拥有相对简单的吸收、分布，代谢和排泄过程，减少药物-药物相互作用的发生，具有更低的副作用和更好的安全性，并使治疗方案大大简化，极大提高病人的依从性。多靶点药物研究已经成为现今抗肿瘤药物研发的一个热点领域。
多靶点药物可以同时调节肿瘤疾病网络系统中的多个环节，不易产生抗药性，对各靶点作用的总效应大于单个效应之和，达到最佳的治疗效果。此外，单个分子拥有相对简单的吸收、分布、代谢和排泄过程，大大减少药物-药物相互作用(peters,ju.,polypharmacology–foeorfriend,jmedchem,2013,56(22):8955-8971)。fda先后批准了多个多靶点酪氨酸激酶抑制剂上市，包括索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)和拉帕替尼(lapatinib)等，标志着多靶点药物已经成为肿瘤治疗和药物研发的新方向。
组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases,hdacs)是当前抗肿瘤药物研究的热门靶点之一。组蛋白的乙酰化/去乙酰化是染色体结构改变和基因表达的重要调节方式，在细胞凋亡、能量代谢、转录和翻译等生命过程中发挥重要作用。hdacs水解组蛋白中赖氨酸侧链上n-端乙酰基，使得核小体变得更加紧密，从而抑制基因的转录。它能调控细胞的多种功能和过程，例如基因表达，染色体改造，细胞增殖、分化、凋亡等。
典型的hdac抑制剂包含一个帽子结构(capgroup,cap)，一个锌离子结合区(zincbindinggroup,zbr)，和一个合适的连接基团(linker)。研究表明，hdac与p53、热休克蛋白(hsp90)、拓扑异构酶(topisomerase,top)和微管蛋白(tubulin)等多个抗肿瘤靶点表现出抗肿瘤的协同效应，针对hdac和协同靶点的多靶点药物研究已经成为克服肿瘤耐药性，增强抗肿瘤疗效的有效手段，目前已有数个hdac多靶点抑制剂进入临床或临床前研究。
在前期研究中，发明人所在的课题组发现新型top1抑制剂吴茱萸碱(evodiamine)，我们对吴茱萸碱进行了系统的结构优化和构效关系研究，使其抗肿瘤活性显著提高，我们合成了一批吴茱萸碱类的衍生物，已经申请的专利如下：中国专利cn201010117531.0，发明名称为“取代吴茱萸碱类抗肿瘤和抗真菌化合物及其制备方法”，授权公布号为cn101787025b；中国专利cn201110188588.4，发明名称为“吴茱萸碱类化合物及其制备方法与应用”，授权公布号为cn102311434b；中国专利申请cn201410209588.1，发明名称为“氧杂或硫杂吴茱萸碱类抗肿瘤衍生物及其制备方法”，公开号为cn103992336a等。进一步地，本发明人通过深入的抗肿瘤作用机制研究发现，吴茱萸碱衍生物是top1和top2双重抑制剂，能够有效诱导肿瘤细胞凋亡，阻滞肿瘤细胞周期于g2/m期。其中，代表化合物10-羟基吴茱萸碱表现出优秀的体外和体内抗肿瘤活性。本发明在前期研究的基础上，发明人继续开展新型top1/top2/hdac三靶点抑制剂的设计、合成和抗肿瘤活性研究。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是，提供一类多靶点抗肿瘤活性的吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐。
本发明的另一目的是，提供如上所述吴茱萸碱衍生物的制药用途。
本发明的第三个目的是，提供如上所述吴茱萸碱衍生物的制备方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一类具有多靶点抗肿瘤活性的吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐，该类吴茱萸碱衍生物具备多靶点抗肿瘤活性，多靶点为top1、top2和hdac三个靶点，该化合物的结构通式如式(i)所示：
其中：
r1为1至4个碳原子的烷基、1至4个碳原子的烷氧基、羟基；
r2为氢、卤素、氨基、硝基、羟基、氰基、1至4个碳原子的烷基、1至4个碳原子的烷氧基、1至4个碳原子的烷基氨基、1至4个碳原子的氨基烷基、2至4个碳原子的酰基、2至4个碳原子的酰胺基、1至4个碳原子的硫代烷基、三氟甲基、1至4个碳原子的羧基，1至4个碳原子的烷氧基羰基、苯基或杂环；
x为苯基、杂环、1至6个碳原子的烷基、1至6个碳原子的烷基与苯基连接的基团、1至6个碳原子的烷基与杂环连接的基团，1至6个碳原子的饱和或不饱和直链烃基、苯基；
a为羟基或2-氨基苯基。
优选地，上述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐中，通式中所述的x为正丙基、正丁基、苯基、苯乙烯基。
优选地，上述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐中，通式中所述的卤素为氟或氯。
优选地，上述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐中，通式中所述的1至4个碳原子的烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
其中，上述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐中，所述的药学上可接受的盐为其有机酸盐或无机酸盐。
优选地，上述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐中，所述的无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸；所述的有机酸为乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸、草酸、鞣酸、枸橼酸、三氟醋酸、苹果酸或苯磺酸盐。
优选地，上述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐中，所述的药学上可接受的盐不含结晶水，或含一个或一个以上结晶水。
优选地，上述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐中，具体的衍生物为：
化合物10a：(7s,13bs)-n-(6-(羟氨基)-6-氧代己基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺；
化合物10b：(7s,13bs)-n-(7-(羟氨基)-7-氧代庚基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺；
化合物10c：(7s,13bs)-n-(5-(羟基氨基)-5-氧代戊基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺；
化合物15a：(7s,13bs)-n-(4-((e)-3-羟基氨基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺；
化合物15b：(7s,13bs)-n-(3-((e)-3-羟基氨基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺；
化合物22：(7s,13bs)-n-(4-(羟基氨基甲酰基)苯基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺；
化合物20a：(7s,13bs)-n-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苯基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺；
化合物20b：(7s,13bs)-n-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苯基)-3-氟-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺、
化合物25：(e)-10-羟基-n-(4-(-3-羟基氨基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺。
它们的结构式和核磁质谱数据如下表1所示：
表1.本发明优选化合物的结构式和核磁质谱数据
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，上述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述的肿瘤为肠癌、肺癌、乳腺癌等。
优选地，上述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物应用中，所述的抗肿瘤药物是多靶点抗肿瘤药物，所述靶点是top1/top2/hdac三靶点。
本发明的另一方面，提供如上所述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐在制备抑制剂中的应用，所述抑制剂为：
a)top1抑制剂、或
b)top2抑制剂、或
c)hdac抑制剂、或
d)top1、top2和hdac的三靶点抑制剂。
本发明的另一方面，提供如上所述吴茱萸碱衍生物及其药学上可接受的盐在制备药物中的应用，所述药物作为top1/top2/hdac三靶点抑制剂用于治疗恶性肿瘤或与分化增值相关疾病。
本发明的另一个方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的一种或多种如上所述的吴茱萸碱衍生物或其药学上可接受的盐、赋形剂、载体或稀释剂。该药物组合物可以有效预防或治疗肿瘤疾病(包括肺癌、肠癌、乳腺癌等)。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述吴茱萸碱衍生物10a-c、15a-b、20a-b、22、25的制备方法，反应流程如下：
一、化合物10a-c的合成
reagentsandconditions:(a)pyridine,nahco3,12h,44-57％；(b)hcooh,(ac)2o,thf,2h,56-76％；(c)dioxane,hcl,6h；(d)pyridine,reflux,8h,78-86％,overtwosteps；(e)lioh,thf,h2o,reflux,4h,88-95％；(f)dipea,hatu,dmf,4h,66-79％,(g)nh2ok,anhydrousch3oh,4h,56-85％.
l-色氨酸乙酯盐酸盐1在吡啶体系中与取代n-甲基靛红酸酐2羧合得到中间体3，中间体3经过环合脱羧反应得到关键中间体7-羧基吴茱萸碱7，中间体7和不同链长的氨基甲酯化合物8在hatu/dipea中发生缩合反应，最后在羟胺溶液中经过氨化反应得到产物10a-c；
二、化合物15a-b的合成
reagentsandconditions:(a)dipea,hatu,dmf,52-64％；(b)50％tfaindrych2cl2,rt,2h,53-65％；(c)nh2ocph3,dipea,hatu,dmf,4h,46-68％；(d)bf3.et2o,drych2cl2,rt,2h,38-56％.
7-羧基吴茱萸碱7a与不同取代位置的氨基肉桂酸叔丁酯在hatu/dipea催化缩合，得到中间体12，随后经过脱叔丁酯再缩合，然后在bf3乙醚溶液中脱三苯甲基保护得到目标产物15a-b；
三、化合物20a-b,22的合成
reagentsandconditions:(a)dipea,hatu,dmf,45-64％；(b)50％tfaindrych2cl2,rt,53-64％；(c)nh2ocph3,dipea,hatu,dmf,4h,46-68％；(d)bf3.et2o,drych2cl2,rt,2h,38-56％.
化合物7与对氨基苯甲酸叔丁酯经过缩合，脱叔丁基，得到中间体18，中间体18在hatu/dipea条件下与邻苯二胺缩合得到目标产物20a-b；中间体18与o-三苯甲基羟胺反应得到中间体21，再脱保护得到目标产物22；
四、化合物25的合成
reagentsandconditions:(a)dipea,hatu,dmf,46-64％；(b)bbr3,ch2cl2,-78℃,5h,34-48％；(c)nh2ok,anhydrousch3oh,4h,46-78％.
10-甲氧基7-羧基吴茱萸碱7c在经过类似于路线二的反应后得到中间体23，在低温下bbr3作用下脱甲基得到10-羟基中间体24，最后经过胺化反应得到目标产物25。
本发明优点在于：
1、化合物经酶抑制活性和体外抗肿瘤活性试验，发现本发明的优选化合物对拓扑异构酶1，拓扑异构酶2和组蛋白去乙酰化酶均具有很强的抑制活性，而且具有较强的体外抗肿瘤活性，部分化合物对hct116、mcf-7、a549细胞表现出优于阳性药saha的抑制活性。
2、本发明的化合物在体内抗肿瘤试验中，对肿瘤生长的抑制效果显著高于相同剂量下阳性药saha，表明本发明中多靶点抗肿瘤活性的吴茱萸碱衍生物较单靶点抑制剂具有明显的优势，表现出高效低毒的特点，是一种优越的抗肿瘤药物。
3、本发明为深入研究和开发新结构类型抗肿瘤药物开辟了新的途径，提供了新的策略。
附图说明
图1是目标化合物在100μm时对top1的抑制实验。条带1，超螺旋质粒dnapbr322；条带2，dna+top1；条带3，dna+top1+cpt；条带4-12，dna+top1+目标化合物(10a-c，15a-b，20a-b，22，25)。
图2是目标化合物在100μm时对top2的抑制实验。条带1，超螺旋质粒dnapbr322；条带2，dna+top1；条带3，dna+top1+ept；条带4-12，dna+top1+目标化合物(7a，10a-c，15a-b，20a-b，22)。
图3是人体肠癌hct116裸鼠肿瘤变化：(a)肿瘤体积折线图；(b)给药结束后肿瘤重量图；(c)给药结束后肿瘤对比图；(d)给药过程中小鼠体重变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明公开的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。实施例中所述的百分比出特别说明外，均为重量百分比。
实施例1(7s,13bs)-n-(7-(羟氨基)-6-氧代己基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺的制备
(1)制备中间体3：(s)-3-(1h-吲哚-3-基)-2-(2-(甲基氨基)苯甲酰氨基)丙酸乙酯
将l-色氨酸乙酯盐酸盐(1g,7mmol)溶于吡啶溶液中(30ml)，加入n-甲基靛红酸酐(1.3g,7.3mmol)，室温反应12小时。反应完后蒸干反应液，残留物经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)分离纯化，得到黄色固体710mg，收率为52％。1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ:10.83(s,1h),8.52(d,j＝7.88hz,1h),7.57(t,j＝7.88hz,2h),7.48(d,j＝4.73hz,1h),7.34(d,j＝7.88hz,1h),7.30(t,j＝7.88hz,1h),7.22(s,1h),7.08(t,j＝7.88hz,1h),7.00(t,j＝7.88hz,1h),6.62(d,j＝7.88hz,1h),6.56(t,j＝7.88hz,1h),4.59-4.63(m,1h),4.03-4.11(m,2h),3.23-3.28(m,2h),2.74(d,j＝4.73hz,3h),1.11(t,j＝7.08hz,3h).
(2)制备中间体4：(s)-3-(1h-吲哚-3-基)-2-(2-(n-甲基甲酰氨基)苯甲酰氨基)丙酸乙酯
甲酸(10ml)与醋酸酐(12ml)室温搅拌10分钟。将该混合溶液滴加至中间体3(500mg，1.4mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液中，室温搅拌8小时。反应完后蒸干反应液，滴加饱和碳酸氢钠溶液至残留物中，调节ph为弱碱性，固体析出，过滤，滤饼水洗(5ml×2)，得到灰白色固体0.4g，收率为74％。1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ:10.84(s,1h),8.87(d,j＝7.26hz,1h),8.05(s,1h),7.49-7.52(m,2h),7.37(t,j＝7.43hz,1h),7.31-7.34(m,3h),7.17(s,1h),7.05(t,j＝7.43hz,1h),4.59-4.69(m,1h),4.04-4.08(m,2h),3.20-3.21(m,1h),3.10(t,j＝7.43hz,1h),2.90(t,3h),1.22(s,3h).
(3)制备中间体6：(7s,13bs)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-羧酸乙酯
中间体4(300mg,0.76mmol)溶于1,4-二氧六环(10ml)，滴加4m盐酸(1,4-二氧六环)溶液，室温条件下反应12小时，反应完后蒸干溶剂黄色油状物。不经纯化直接投下一步。将残留物溶于吡啶溶液中(20ml)，回流反应4小时，蒸干溶剂，粗品经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)得到白色固体260mg，收率85％。
1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ:11.41(s,1h),7.93(d,j＝7.46hz,1h),7.54(d,j＝8.14hz,2h),7.55-7.60(m,2h),7.32-7.38(m,3h),7.26(d,j＝7.54hz,1h),7.18(t,j＝7.54hz,1h),7.14(t,j＝6.60hz,1h),7.03(t,j＝7.46hz,1h),6.66(d,j＝8.45hz,1h),6.53(t,j＝6.76hz,1h),6.02(s,1h),5.50(d,j＝5.08hz,1h),3.91-3.99(m,2h),3.38(d,j＝15.23hz,1h),3.16-3.32(m,2h),2.82(s,4h),2.52(s,3h),0.97(t,j＝7.18hz,3h).
(4)制备中间体7a：(7s,13bs)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-羧酸
中间体6(100mg,0.27mmol)溶于四氢呋喃/水(1:1,20ml)中，加入氢氧化锂(5mg,1.1mmol)，回流反应4小时，蒸干溶剂，加入1m盐酸溶液调节ph为2，析出固体，过滤，滤饼水洗，得到白色固体90mg，收率95％。1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ:12.87(s,1h),11.44(s,1h),7.94(d,j＝7.41hz,1h),7.57-7.60(m,2h),7.39(d,j＝8.03hz,1h),7.28(d,j＝8.03hz,1h),7.20(t,j＝8.03hz,1h),7.16(t,j＝8.03hz,1h),7.05(t,j＝7.41hz,1h),6.02(s,1h),5.42(d,j＝6.18hz,1h),3.41(d,j＝14.82hz,1h),3.12-3.16(m,1h),2.52(s,3h),1.23(s,3h).
(5)制备中间体9a：6-((7s,13bs)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺基)己酸甲酯
中间体7a(100mg,0.29mmol)溶于干燥dmf(5ml)中，加入5-氨基戊酸甲酯(40mg,0.32mmol)、hatu(120mg,0.32mmol)、dipea(70mg,0.58mmol)室温反应4小时。反应后将反应液倒入水中(40ml)，乙酸乙酯(50mlx3)，合并有机相，蒸干溶剂，残留物经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝2：1)得到黄色固体90mg，收率67％。1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ:11.33(s,1h),8.00(t,j＝5.79hz,1h),7.91(dd,j＝1.16hz,7.53hz,1h),7.55(t,j＝7.53hz,1h),7.49(d,j＝7.53hz,1h),7.35(d,j＝8.69hz,1h),7.23(d,j＝8.21hz,1h),7.16(t,j＝7.63hz,1h),7.12(t,j＝7.63hz,1h),7.01(t,j＝7.63hz,1h),6.17(s,1h),5.33(d,j＝5.87hz,1h),3.53(s,3h),3.36(d,j＝15.25hz,1h),2.88-2.91(m,2h),2.68(s,10h),2.51(s,3h),2.06(t,j＝7.38hz,2h).
(6)制备目标产物10a
新鲜羟胺溶液的制备：将氢氧化钾(5.61g)溶于甲醇(14ml)中，将盐酸羟胺(4.67g)溶于甲醇(24ml)中，将前者滴加至后者，室温反应30分钟，过滤，滤液为新鲜制备的羟胺溶液。
将中间体9a(70mg,0.15mmol)溶于羟胺溶液(5ml)，室温反应4小时。反应结束后蒸干溶剂，滴加1m盐酸溶液调节ph为7-8，出现沉淀，过滤，滤饼水洗，得到黄色固体30mg，收率42％。1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ:11.34(s,1h),10.25(s,1h),7.98(t,j＝5.70hz,1h),7.91(dd,j＝1.36hz,7.88hz,1h),7.55(t,j＝7.61hz,1h),7.49(d,j＝8.15hz,1h),7.36(d,j＝8.15hz,1h),7.23(d,j＝8.15hz,1h),7.18(t,j＝7.61hz,1h),7.12(t,j＝7.61hz,1h),7.02(t,j＝7.61hz,1h),6.17(s,1h),5.33(d,j＝4.89hz,1h),3.09-3.11(m,1h),2.85-2.91(m,2h),2.50(s,3h),1.78(t,j＝7.49hz,1h),1.27-1.32(m,2h),1.18-1.23(m,2h),0.98-1.02(m,2h).13c-nmr(150mhz,dmso-d6,tms):δ＝170.50,169.21,164.27,150.44,136.68,133.24,128.36,127.93,125.57,122.27,121.99,121.84,120.57,118.90,118.26,108.72,67.81,52.92,38.51,35.51,32.06,28.60,25.68,24.66,23.65.ms(esipositive):m/z[m+h]+:476.49.
化合物10b-c制备方法参照实施例1。
实施例2(7s,13bs)-n-(4-((e)-3-羟基氨基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺的制备
(1)制备中间体12a：(e)-3-(4-((7s,13bs)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰氨基)苯基)丙烯酸乙酯
操作与投料与实施例1制备中间体9a相同，柱层析得到黄色固体80mg，收率54％。
(2)制备中间体13a：(e)-3-(4-((7s,13bs)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰氨基)苯基)丙烯酸
中间体12a(80mg,0.315mmol)溶于三氟乙酸：二氯甲烷为1:1(10ml)的混合溶剂中，室温条件下反应4小时。反应完后蒸干溶剂，饱和碳酸氢钠溶液滴加至残余物中，调节ph为弱酸性，析出沉淀，过滤，滤饼干燥得到黄色固体60mg，收率88％。1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ:12.30(s,1h),11.48(s,1h),10.62(s,1h),7.95(d,j＝7.94hz,1h),7.61(t,j＝8.14hz,1h),7.58(s,3h),7.54(d,j＝8.59hz,1h),7.49(d,j＝16.22hz,1h),7.40(d,j＝7.63hz,1h),7.31(d,j＝8.59hz,1h),7.21(t,j＝7.63hz,1h),7.15(t,j＝7.63hz,1h),7.03(t,j＝7.63hz,1h),6.39(d,j＝16.22hz,1h),6.26(s,1h),5.62(d,j＝6.56hz,1h),2.59(s,3h).
(3)制备中间体14a：(7s,13bs)-14-甲基-5-氧代-n-(3-((e)-3-氧代-3-((三苯甲基氧基)氨基)丙-1-烯-1-基)苯基)-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺
操作与投料与实施例1制备中间体9a相同，柱层析得到黄色固体40mg，收率53％。
(4)制备目标产物15a
中间体14a(40mg,0.053mmol)溶于二氯甲烷(5ml)中，滴加bf3(100μl)，然后室温搅拌反应4小时。待反应完全后，蒸干溶剂，加入水(10ml)析出固体，过滤，干燥得到黄色固体20mg，收率74％。1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ:11.45(s,1h),10.67(s,1h),10.46(s,1h),7.95(d,j＝6.31hz,1h),7.61(t,j＝7.84hz,1h),7.55(d,j＝8.68hz,3h),7.46(d,j＝8.68hz,2h),7.41(d,j＝8.13hz,1h),7.36(d,j＝15.35hz,1h),7.31(d,j＝7.86hz,1h),7.22(t,j＝7.31hz,1h),7.04(t,j＝7.31hz,1h),6.34(d,j＝15.35hz,1h),6.27(s,1h),5.61(d,j＝6.58hz,1h),2.59(s,3h).13c-nmr(150mhz,dmso-d6,tms):δ＝170.35,164.71,150.81,139.79,137.86,136.83,133.49,129.75,128.29,128.11,127.99,127.69,127.50,125.50,122.46,122.09,121.61,120.94,119.05,118.93,118.32,117.35,111.59,107.95,68.02,53.43,35.48,23.64.ms(esipositive):m/z[m+h]+:508.56.
化合物15b,22制备方法参照实施例2。
实施例3(7s,13bs)-n-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苯基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺的制备
(1)制备中间体17：叔丁基-(4-((7s,13bs)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰氨基)苯甲酸甲酯
操作与投料与实施例1制备中间体12a相同，柱层析得到黄色固体110mg，收率62％。
(2)制备中间体18a：4-((7s,13bs)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢-[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰氨基)苯甲酸
操作与投料与实施例1制备中间体13a相同，柱层析得到黄色固体60mg，收率80％。
(3)制备目标产物20a
中间体18a(70mg,0.15mmol)、邻苯二胺(20mg,0.18mmol)、hatu(70mg,0.18mmol)溶于dmf(5ml)中，滴加dipea(52μl,0.3mmol)，室温搅拌反应4小时。待反应完全后，将反应液倒入水中(40ml)，乙酸乙酯萃取(40ml×3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶液，残余物经柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100:2)得到淡黄色粉末固体33mg，收率35％。1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ:11.45(s,1h),10.57(s,1h),9.54(s,1h),7.92(d,j＝7.56hz,1h),7.87(d,j＝8.69hz,1h),7.59(d,j＝8.95hz,3h),7.52(d,j＝7.83hz,1h),7.38(d,j＝7.83hz,1h),7.28(d,j＝7.83hz,1h),7.19(t,j＝7.22hz,1h),7.10-7.14(m,2h),7.01(t,j＝7.58hz,1h),6.93(t,j＝7.45hz,1h),6.74(d,j＝7.94hz,1h),6.56(t,j＝7.94hz,1h),6.24(s,1h),5.61(d,j＝6.45hz,1h),4.82(s,2h),2.56(s,3h),0.84(t,j＝6.62hz,2h).13c-nmr(150mhz,dmso-d6,tms):δ＝170.66,164.64,150.92,142.98,141.53,136.96,133.59,129.00,128.63,128.33,127.99,126.61,126.39,125.52,123.37,122.50,122.11,121.58,120.93,119.00,118.35,118.17,116.34,116.16,111.63,107.92,68.04,64.95,35.45,28.93,23.64,15.16.ms(esipositive):m/z[m+h]+:557.38.
化合物20b制备方法参照实施例3。
实施例4(e)-10-羟基-n-(4-(3-羟基氨基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰胺的制备
(1)制备中间体23：(e)-3-(4-(10-甲氧基-14-甲基-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰氨基)苯基)丙烯酸甲酯
操作与投料与实施例1制备中间体12a相同，柱层析得到黄色固体41mg，收率85％。
(2)制备中间体24：(e)-3-(4-(10-羟基-14-甲基-14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b,14-六氢[2',3':3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-7-甲酰氨基)苯基)丙烯酸甲酯
中间体23(40mg,0.075mmol)溶于二氯甲烷中(10ml)，n2保护，-78℃下注入bbr3溶液反应30分钟，然后升温至室温反应4小时。待反应完全后，加入饱和nahco3(10ml)，反应液减压旋干，析出固体，过滤，干燥得到黄色固体20mg，收率52％。1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ:11.07(s,1h),10.44(s,1h),8.68(s,1h),7.92(dd,j＝1.65hz,7.85hz,1h),7.60(d,j＝9.09hz,2h),7.56(d,j＝3.72hz,2h),7.53(d,j＝3.31hz,1h),7.27(d,j＝7.76hz,1h),7.15-7.18(m,2h),6.79(d,j＝2.82hz,1h),6.64(dd,j＝2.32hz,8.76hz,1h),6.48(d,j＝15.45hz,1h),6.18(s,1h),5.55(d,j＝6.18hz,1h),3.69(s,3h),3.23-3.26(m,1h),2.56(s,3h).
(3)制备目标产物25
操作与投料与实施例1制备10a相同，柱层析得到黄色固体80mg，收率55％。1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ:11.07(s,1h),10.65(s,1h),10.40(s,1h),8.97(s,1h),8.71(s,1h),7.91(d,j＝7.50hz,1h),7.57(t,j＝7.97hz,1h),7.53(d,j＝8.63hz,2h),7.43(d,j＝7.97hz,1h),7.35(t,j＝8.63hz,1h),7.26(d,j＝7.97hz,1h),7.17(t,j＝8.63hz,2h),6.80(d,j＝2.15hz,1h),6.65(dd,j＝2.15hz,8.62hz,1h),6.32(d,j＝15.62hz,1h),6.18(s,1h),5.55(d,j＝6.55hz,1h),2.56(s,3h),1.96-2.02(m,1h).ms(esinegative):m/z[m-h]+:522.43.
实施例5目标化合物酶抑制活性和体外抗肿瘤活性
1.目标化合物hdac1酶抑制测试
1.1实验材料：
hdac1酶，缓冲液(137mm氯化钠，2.7mm氯化钾，1mm氯化镁，0.1mg/mlbsa，ph＝8的tris-hcl25mm)，hdacsubstrate3，胰蛋白酶，96孔黑色板。
1.2实验方法：
(1)96孔黑色板平衡至室温；
(2)用含有10％的dmso的缓冲液稀释待测化合物，化合物的浓度依次为100μm，30μm，10μm，3μm，1μm，0.3μm，0.1μm，0.03μm，0.01μm，0.003μm；
(3)将11μl的hdac1加入到400μl的缓冲液中，摇匀；
(4)向96孔板上第2-11孔加入35μl刚刚配好的含有hdac1酶的缓冲液，并依次加入5μl稀释好的不同浓度的化合物到对应的反应孔中，对于阴性对照(第一个孔)和空白对照孔(第十一个孔)，分别加入40μl和5μlassaybuffer；
(5)向所有反应孔中加入100μm的hdacsubstrate5μl和0.5mg/ml的胰蛋白酶5μl，37℃孵化30分钟后读数。
(6)依据公式计算抑制率：抑制率＝(100％活性孔-样品孔)/100％活性孔*100，在graphpad软件中将酶活性对化合物浓度的曲线进行拟合，求出化合物的ic50值；
实验结果表明这些杂交化合物都表现出良好的hdac1抑制活性，均在纳摩尔级，其中的两个化合物10c(ic50＝0.011μm)和22(ic50＝0.025μm)表现出优于阳性对照药saha(ic50＝0.039μm)的hdac1抑制活性。
表2.目标化合物hdac1抑制活性
2.top1介导的dna解螺旋实验
2.1实验材料：
小牛胸腺dna拓扑异构酶ⅰ、负超螺旋dna质粒pbr322、琼脂糖、dmso、10xbuffer缓冲液、0.1％bsa和etbr。
2.2实验仪器
凝胶电泳采用biorad公司powerpac电泳仪和sub-cellmodel96电泳槽，凝胶扫描定量采用biorad公司的geldocez全自动凝胶成像系统。
2.3实验方法
先将1xtae溶液配置成浓度为0.8％的琼脂糖凝胶。依次向1.5ml样品管中加入10ml水，2mlbuffer,2ml0.1％bsa，top10.5u，dna0.5ml，不同的药物0.2ml，定容到20ml。然后将样品管放入37℃水浴中，孵化15分钟。加入2ml6xloadingbuffer至样品管中。110v电泳40-50分钟，用0.5mg/mletbr染色15分钟，凝胶成像系统观察电泳结果。
实验结果表明(如图1)，除了化合物25在100μm的浓度下表现出微弱的top1抑制活性，其他化合物在该浓度下均没有top1抑制活性。
3.top2介导的dna解螺旋实验
3.1实验材料：
小牛胸腺dna拓扑异构酶ⅱ、负超螺旋dna质粒pbr322、琼脂糖、dmso、10xbuffer缓冲液、0.1％bsa和etbr。
3.2实验仪器
凝胶电泳采用biorad公司powerpac电泳仪和sub-cellmodel96电泳槽，凝胶扫描定量采用biorad公司的geldocez全自动凝胶成像系统。
3.3实验方法
先将1xtae溶液配置成浓度为0.8％的琼脂糖凝胶。依次向1.5ml样品管中加入10ml水，2mlbuffer,2ml0.1％bsa，top10.5u，dna0.5ml，不同的药物0.2ml，定容到20ml。然后将样品管放入37℃水浴中，孵化15分钟。加入2ml6xloadingbuffer至样品管中。110v电泳40-50分钟，用0.5mg/mletbr染色15分钟，凝胶成像系统观察电泳结果。
实验结果表明(如图2)，大部分化合物在100μm浓度下表现出良好的top2抑制活性。构效关系研究发现，吴茱萸碱母核连接链状的连接子时无top2抑制活性，而连接芳香性的连接子时则有top2抑制活性。
4.目标化合物体外抗肿瘤活性测试
4.1样品配制
用dmso(merck)溶解成后，加入pbs(-)配成1000μm的溶液或均匀的混悬液，然后用含dmso的pbs(-)稀释。样品终浓度100、10、1、0.1、0.01、0.001μm。
4.2细胞株
hct116(人肠癌细胞)、mcf-7(人乳腺癌细胞)、a549(人肺癌细胞)，均由本实验室冻存和传代。
4.3培养液
dmem或prmi1640+10％fbs+双抗
4.4试验方法
cck-8法。96孔板每孔加入浓度为6-10×104个/ml的细胞悬液100μl，置37℃，5％co2培养箱内。24小时后，加入样品液，10ml/孔，设三复孔，37℃，5％co2作用48小时。每孔加入10mlcck-8溶液，然后37℃下避光孵育1-4小时后，用全波长多功能酶标仪测450nmod值
实验结果显示这些多靶点化合物具有光谱抗肿瘤活性，其ic50值在0.15-50μm之间，其中化合物15a-b，20a-b，22对hct116细胞均表现出优于阳性药saha的抑制活性。
表3.目标化合物酶抑制活性和体外活性结果(μm)
实施例6目标化合物体内抗肿瘤效果
根据体外抗肿瘤实验结果及化合物的结构特点，我们选择人结肠癌hct116作为裸鼠移植瘤模型，以化合物20a作为研究对象，saha和evo及两者联合用药作为阳性对照药。
给药剂量剂量设置化合物20a为100mg/kg或者150mg/kg，一天两次；阳性药saha和evo剂量为150mg/kg，一天两次；以及联合给药组(saha+evo)剂量为150mg/kg+150mg/kg；连续口服给药(p.o)15天。结果显示(图3a，表4)化合物20a在剂量100mg/kg剂量下抑瘤率为65.42％；在剂量150mg/kg下，抑瘤率为75.19％，呈现剂量依赖性(图3b-c)。两种给药剂量的实验结果(表4)均显著优于相同剂量下的阳性对照组(saha抑瘤率为40.81％，evo为45.53％)和联合给药组(抑瘤率为54.5％)，且具有统计学意义(p<0.001)。此外，在给药期间并未发现小鼠体重明显变化(p>0.05，图3d)，说明化合物20a的体内毒性较低。
表4.目标化合物对人体肠癌hct116裸鼠移植瘤的疗效
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。