本发明涉及药物化学领域，具体地说是涉及一种苝酰亚胺-野尻毒素衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
糖尿病(diabetesmellitus)是严重威胁人类健康的疾病。世界卫生组织(who)调查显示目前全球有超过4.2亿人患有糖尿病，预计到2040年患病人数将达到6.42亿(jama2017,317,1015-1016.)。糖尿病主要分为i型和ii型糖尿病，其中ii型糖尿病约占所有患者的90～95％。口服降糖药物是治疗ii型糖尿病的主要方法，其中α-糖苷酶抑制剂显示了好的疗效和低的副作用。
目前上市的用于治疗ii型糖尿病的α-糖苷酶抑制剂有三种：伏格列波糖、阿卡波糖和米格列醇等(j.med.chem.2012,55,10345-10346.)。其中米格列醇作为第三代糖苷酶抑制剂显示了更好的疗效和更低的副作用。米格列醇是1-脱氧野尻毒素的衍生物，而1-脱氧野尻毒素是从桑叶中提取的分子，显示了强效的糖苷酶抑制活性。
近年来，人们研究发现多效价的1-脱氧野尻毒素分子显示了更好的糖苷酶抑制活性(chembiochem2014,15,1239-1251；org.biomol.chem.2015,13,9894-9906；j.mater.chem.b2017,5,6428-6436.)。目前，人们通过共价键方法合成了大量基于1-脱氧野尻毒素分子修饰的富勒烯衍生物(chem.eur.j.2018,24,2483-2492.)、环糊精衍生物(chem.eur.j.2011,17,13825-13831)、糖衍生物(chem.eur.j.2017,23,9022-9025.)和聚合物(bioconjugatechem.2015,26,766-772.)等的多效价糖苷酶抑制剂，显示了增强的糖苷酶抑制活性，如1-脱氧野尻毒素分子修饰的环糊精衍生物，其糖苷酶抑制活性的ki值为0.022μm，好于其单体分子效果的610倍(chembiochem2013,14,2038-2049.)。1-脱氧野尻毒素分子修饰的富勒烯衍生物(chem.eur.j.2018,24,2483-2492.)的多效价糖苷酶抑制活性的ki值为0.0018μm，好于其单体分子效果的944倍。而1-脱氧野尻毒素分子修饰的环肽分子，其多效价糖苷酶抑制活性的ki值更是达到了0.0011μm，好于其单体分子效果的4747倍(chem.eur.j.2016,22,5151-5155.)。
尽管基于野尻毒素分子构筑的多效价糖苷酶抑制剂已经取得了丰硕的成果，然而，关于超分子多效价糖苷酶抑制剂的研究较少。已知的基于野尻毒素分子的化合物，如胆酸修饰的野尻毒素分子、脂肪链修饰的野尻毒素分子、萘酰亚胺修饰的野尻毒素分子以及主客体调控的离子型的苝酰亚胺-野尻毒素分子等，由于其溶解度低或者糖苷酶作用较弱等原因，不适于作为超分子多效价糖苷酶抑制剂。因此，开发并合成新型、高活性的超分子多效价糖苷酶抑制剂成为最大的挑战。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种苝酰亚胺-野尻毒素衍生物。
本发明的目的之二是提供一种苝酰亚胺-野尻毒素衍生物的制备方法。
本发明的目的之三是提供一种苝酰亚胺-野尻毒素衍生物的应用。
本发明的目的之四是提供一种自组装糖苷酶抑制剂。
本发明的目的之一是这样实现的：
一种苝酰亚胺-野尻毒素衍生物，其化学结构式如式(i)所示：
在本申请中，还将其表示为pbi-a-6dnj化合物，其可在水溶液中形成稳定的超分子组装体，可作为自组装糖苷酶抑制剂。
本发明的目的之二是这样实现的：
一种苝酰亚胺-野尻毒素衍生物的制备方法，包括如下步骤：
(a)将苝酐溶于吡啶中，再向其中加入醋酸锌和甘氨酸修饰炔基衍生物a，苝酐、醋酸锌和甘氨酸修饰炔基衍生物a的摩尔比为1∶3∶3，混匀，加热至115℃，保持24～48h，将反应液冷至室温，蒸除吡啶，用二氯甲烷溶解固体，洗涤，干燥，过滤，洗脱分离得固体化合物b；
(b)将步骤(a)所得化合物b与野尻毒素化合物c溶解于四氢呋喃中，向其中加入硫酸铜水溶液和抗坏血酸钠的水溶液，化合物b、野尻毒素化合物c、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶6∶6∶6，混匀，加热至55℃，反应8～12h，将反应液冷至室温，蒸除四氢呋喃，向其中加入二氯甲烷，分液，将下层二氯甲烷相干燥，柱层析分离，得到固体化合物d；
(c)将步骤(b)所得化合物d与甲醇钠按摩尔比为1∶20溶于无水甲醇中，室温下反应10～12h，将反应液冷至室温，将反应液在水中透析，得到式(i)化合物。
其反应式如下：
步骤(a)中，所述甘氨酸修饰炔基衍生物a可采用现有技术中已知的方法制备，如按照文献(macromol.rapidcommun.2014,35,727-734.)中报道的方法制备。
步骤(a)中，所述洗涤包括采用1mol/l盐酸溶液洗涤两次。
步骤(a)中，所述干燥是指采用无水硫酸钠干燥。
步骤(a)中，所述洗脱分离是指过硅胶柱，采用体积比45∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱剂洗脱分离。
步骤(b)中，野尻毒素化合物c可采用现有技术中已知的方法制备，如按照文献(chem.eur.j.2013,19,16791-16803.)中报道的方法制备。
步骤(b)中，将下层二氯甲烷相采用无水硫酸钠干燥，采用体积比25∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱剂进行柱层析分离。
步骤(c)中，用透析袋将反应液在水中透析2天。
本发明的制备方法中，采用旋转蒸发仪蒸除步骤(a)中的吡啶、步骤(b)中的四氢呋喃。
本发明的制备方法中，所得化合物b呈红色；化合物d，即pbi-a-ac6dnj，呈暗红色；式(i)目标化合物，即pbi-a-6dnj，呈黑红色。
本发明的制备方法中，所用溶剂的量可根据本领域技术人员已知的化学合成反应常识取适量即可。
本发明的目的之三是这样实现的：
前述苝酰亚胺-野尻毒素衍生物在制备糖苷酶抑制剂方面的应用，特别是在制备α-糖苷酶抑制剂方面的应用，其对α-甘露糖苷酶和α-半乳糖苷酶等α-糖苷酶具有抑制活性。
本发明的目的之四是这样实现的：
一种自组装糖苷酶抑制剂，其包括前述的苝酰亚胺-野尻毒素衍生物，其可在水溶液中形成稳定的超分子组装体，其化学结构式如式(i)所示：
本发明以苝酐为原料，经缩合反应、click反应和脱乙酰化反应制备式(i)化合物pbi-a-6dnj，该化合物可在水溶液中形成稳定的超分子组装体，可作为自组装糖苷酶抑制剂，其对α-糖苷酶，特别是α-甘露糖苷酶具有良好的抑制活性，且选择性强，在小鼠体内显示了优异的降糖效果，在超分子多效价糖苷酶抑制剂方面具有应用前景。
附图说明
图1是化合物pbi-a-6dnj不同ph条件下的uv-vis谱图。
图2是化合物pbi-a-6dnj的动态光散射图。
图3是化合物pbi-a-6dnj的小鼠体内降糖活性。
图4是不同剂量米格列醇的小鼠体内降糖活性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，下述实施例仅作为说明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用试剂均为分析纯或化学纯，且均可市购或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。下述实施例均实现了本发明的目的。
实施例1
(1)化合物b的合成
室温下，将苝酐(345mg,0.88mmol)、醋酸锌(323mg，2.64mmol)、甘氨酸修饰的炔基化合物a(770mg,2.64mmol)加入到200ml吡啶溶液中；反应体系加热到90-115℃，保持反应24-48h。停止反应，冷却到室温，旋转蒸发仪蒸干吡啶溶剂，用20ml二氯甲烷溶解固体，用5ml浓度为1mol/l盐酸溶液洗涤两次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩二氯甲烷，经硅胶柱分离，用体积比45∶1的二氯甲烷-甲醇洗脱剂洗脱，得到产物(化合物b)400mg，产率为48.4％。
该化合物的表征结果如下：
红色固体，m.p.>250℃.1hnmr(cdcl3,600mhz):δ(ppm)2.44(t,j＝2.4hz,6h,c≡ch),3.90(s,12h,-ch2),4.18(d,j＝1.8hz,12h,-ch2-c≡c),4.88(s,4h,-ch2-c＝o),6.07(s,2h,-nh),8.65(d,j＝8.4hz,4h,ar-h),8.71(d,j＝7.8hz,4h,ar-h)；13cnmr(cdcl3,100mhz):δ(ppm)42.79,58.74,60.07,68.42,77.76,80.73,121.67,123.84,124.59,127.55,130.61,133.41,162.34,166.95；hrms:calcd.forc54h45n4o12,941.3034,found941.3036.
(2)化合物d(pbi-a-ac6dnj)的合成
室温下，将中间体b(50mg，0.053mmol)、野尻毒素化合物c(264mg，0.32mmol)溶解在10ml四氢呋喃溶液中；加入溶解在5ml水中的五水硫酸铜(80mg，0.32mmol)，溶解在5ml水中的抗坏血酸钠(63mg，0.32mmol)；反应体系加热到40-55℃，保持反应8-12h。停止反应，冷却到室温，旋转蒸发仪除去四氢呋喃，加入二氯甲烷分液，下层二氯甲烷相用无水硫酸钠干燥，柱层析分离，用体积比25∶1的二氯甲烷-甲醇洗脱剂洗脱，得到产物55mg，产率为30.0％。
该化合物的表征结果如下：
暗红色固体，m.p.111.8～113.1℃.1hnmr(cdcl3,600mhz):δ(ppm)1.99(s,18h,-ch3),2.00(s,18h,-ch3),2.01(s,18h,-ch3),2.05(s,18h,-ch3),2.11(m,12h,-ch2),2.26(t,j＝11.4hz,-ch),2.57(m,6h,-ch),2.63(m,6h,-ch),2.88(m,6h,-ch),3.21(dd,j＝4.8hz,11.4hz,6h,-ch),3.84(s,12h,-ch2),4.13(s,12h,-ch2),4.44(m,12h,-ch2),4.63(s,12h,-ch2),4.93(m,10h),5.04(m,12h),6.59(s,2h,-nh),7.73(s,6h,trizole-h),8.70(d,j＝7.8hz,4h,ar-h),8.74(d,j＝8.4hz,4h,ar-h)；13cnmr(cdcl3,100mhz):δ(ppm)20.67,20.72,20.84,26.80,29.40,29.68,40.93,43.09,47.89,48.45,52.67,59.71,60.21,61.07,62.08,64.85,68.99,69.05,69.11,69.32,74.33,122.89,122.92,123.12,123.42,123.49,129.41,131.60,131.63,134.75,144.96,163.16,166.70,169.78,170.10,170.23,170.73,181.28；hrms:calcd.forc156h201n28o60,3427.3571,found3427.3706.
(3)式(i)化合物(pbi-a-6dnj)的合成
室温下，将化合物d(100mg，0.29mmol)、甲醇钠(9.0mg，5.8mmol)溶解在10ml无水甲醇中，反应体系室温下反应10-12h，停止反应，冷至室温，用透析袋在2l水中透析2天，水溶液冻干，得到产物66mg，产率为92.0％。
该化合物的表征结果如下：
黑红色固体，m.p.139.6～140.8℃.1hnmr(cdcl3,600mhz):δ(ppm)1.72(s,2h),1.91(m,24h),2.36(t,j＝6.6hz,6h),2.69-2.76(12h),2.92(t,j＝9.0hz,6h),3.06(t,j＝9.0hz,6h),3.23(m,6h),3.51(d,j＝9.6hz,6h),3.63-3.64(16h),4.29-4.30(12h),4.49(s,12h),4.70(s,4h),4.90(s,2h),8.01(s,6h),8.12-8.37(8h)；13cnmr(cdcl3,100mhz):δ(ppm)25.92,48.30,49.21,56.90,58.95,60.37,64.53,66.81,69.49,70.77,79.18,121.82,124.29,125.10,127.99,131.27,131.36,133.93,133.98,144.44,162.71,166.75；hrms:calcd.forc108h154n28o36,2419.1070(1209.5535×2),found2419.1092(1209.5546×2).
实施例2化合物pbi-a-6dnj在水溶液中形成稳定超分子组装体
将1×10-5m的化合物pbi-a-6dnj溶解在不同ph值(1～10)的水溶液中，通过紫外-可见吸收光谱研究了化合物pbi-a-6dnj在不同ph值溶液中的聚集特征，进而通过动态光散射实验研究了1×10-4m的化合物pbi-a-6dnj在水溶液中的粒径分布，其结果如图1、2所示。
通过图1示出的uv-vis谱可知，538nm处的紫外吸收强度低于500nm处的强度。
图2示出的动态光散射实验结果显示，化合物pbi-a-6dnj在1×10-4m的溶液中，其平均粒径为168nm。
以上结果说明，苝酰亚胺-野尻毒素衍生物pbi-a-6dnj在水溶液中形成稳定的超分子组装体。
实施例3超分子多效价糖苷酶抑制活性实验
分别测试了苝酰亚胺-野尻毒素衍生物pbi-a-6dnj对α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶等的糖苷酶抑制活性，以上市的降糖药物米格列醇为阳性对照。
实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，各反应物按一定剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行。依次加入柠檬酸-磷酸缓冲溶液、抑制剂溶液(pbi-a-6dnj和阳性对照米格列醇)和酶(α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶)溶液，混合均匀3min，于37℃保温10min，结束后，取出，加入不同浓度底物(对硝基苯-α-甘露糖、对硝基苯-β-甘露糖、对硝基苯-α-半乳糖和对硝基苯-β-半乳糖)，充分混匀3min，于37℃恒温20min，结束后加入100μl浓度为1mol/l的碳酸钠溶液中止反应。
由于底物(对硝基苯-α-甘露糖、对硝基苯-β-甘露糖、对硝基苯-α-半乳糖和对硝基苯-β-半乳糖)在不同糖苷酶(α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶)作用下能水解产生对硝基苯酚，其在405nm处有最大吸收，测定其吸光度，计算其糖苷酶抑制活性，其结果如表1所示。
表1
由表1可知，苝酰亚胺-野尻毒素衍生物pbi-a-6dnj对α-甘露糖苷酶和α-半乳糖苷酶显示了好的抑制活性，其ki值分别为0.038和14.2μm，尤其是对α-甘露糖苷酶。苝酰亚胺-野尻毒素衍生物pbi-a-6dnj对α-甘露糖苷酶的活性是阳性对照米格列醇活性(96μm)的2526倍，折合每个1-脱氧野尻毒素分子之后的活性效果为421倍。苝酰亚胺-野尻毒素衍生物pbi-a-6dnj对β-甘露糖苷酶和β-半乳糖苷酶没有活性，说明其对α-糖苷酶具有选择性。
实施例4超分子多效价糖苷酶抑制剂的小鼠体内降糖效果
测试了苝酰亚胺-野尻毒素衍生物pbi-a-6dnj在小鼠体内的降糖效果，以上市的降糖药物(阿卡波糖和米格列醇)为阳性对照。
实验小鼠周龄：4～5周龄；重量：18～22g；昆明小鼠(购于北京维通利华)，雄性。
将42只小鼠随机分成六组，每组7只，分别为空白组，阿卡波糖组，米格列醇组，和抑制剂(苝酰亚胺-野尻毒素衍生物pbi-a-6dnj)低剂量组，中剂量组，以及高剂量组；按体重计算给药。空白组：2g/kg麦芽糖；阿卡波糖组：5mg/kg阿卡波糖+2g/kg麦芽糖；米格列醇组：5mg/kg米格列醇+2g/kg麦芽糖；低剂量药物组：0.2mg/kg药物+2g/kg麦芽糖；中剂量药物组：0.6mg/kg药物+2g/kg麦芽糖；高剂量药物组：1mg/kg药物+2g/kg麦芽糖。小鼠禁食1h以上，进药方式为灌胃，分别在进药0h、0.5h、1h、2h和3h后尾静脉取血测量血糖水平，其结果如图3所示。
对比例1不同浓度米格列醇的小鼠体内降糖效果
实验小鼠周龄：4～5周龄；重量：18～22g；昆明小鼠(购于北京维通利华)，雄性。
将42只小鼠随机分成六组，每组7只，分别为空白组，不同剂量米格列醇组；按体重计算给药。空白组：2g/kg麦芽糖；米格列醇组：0.5mg/kg米格列醇+2g/kg麦芽糖组、1.0mg/kg米格列醇+2g/kg麦芽糖组、3.0mg/kg米格列醇+2g/kg麦芽糖组和5.0mg/kg米格列醇+2g/kg麦芽糖组。小鼠禁食1h以上，进药方式为灌胃，分别在进药0h、0.5h、1h、2h和3h后尾静脉取血测量血糖水平，其结果如图4所示。
由图3和图4可知，苝酰亚胺-野尻毒素衍生物pbi-a-6dnj对小鼠体内降血糖效果具有浓度依赖性，随着浓度增大，降血糖效果增强。米格列醇在低剂量(0.5mg/kg和1.0mg/kg)和中剂量(3.0mg/kg)时没有降糖效果，而在高剂量(5.0mg/kg)显示了好的降糖效果。在剂量为(1mg/kg)下，苝酰亚胺-野尻毒素衍生物pbi-a-6dnj对小鼠体内降糖效果优于阿卡波糖(5mg/kg)。在相同剂量(1.0mg/kg)下，化合物pbi-a-6dnj的降糖效果优于米格列醇的降糖效果。