一种新型水溶性比率型SO2衍生物荧光探针的制作方法

本发明涉及了一种定位线粒体的比率型so2衍生物荧光探针，具有苯并噻唑-香豆素结构。尤其涉及基于迈克尔加成机理的水溶性定位线粒体的比率型so2衍生物荧光探针的合成及其应用；属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

so2衍生物(hso3^-/so3^2-)因其具有抑制细菌生长和防止霉变的能力而被广泛地用作食品和饮料的防腐剂。然而，过高水平的so2衍生物会引起多种疾病，比如腹泻、低血压、过敏、哮喘等。在现代工业化的进程中，工厂释放出大量的so2衍生物，带来各种严重的环境问题。一些研究表明细胞液和线粒体产生的so2衍生物可以调节心血管结构和功能，具有降低血压，舒张血管，消除心脏肌力等作用；然而，不正常的内源性亚硫酸盐衍生物水平经常会引发神经性疾病和肺癌。由于对亚硫酸盐衍生物监测方法的缺陷，因此了解其在致病生物事件中的形成和功能机理仍然是一项挑战。

荧光探针因其高灵敏性、高分辨率而成为一种强有力的工具，常用于实时监测和生物视觉感知。目前，许多基于选择性的去保护、醛基亲核反应、配位作用等机理检测hso3^-/so3^2-的荧光探针正在不断发展。然而，探针仍然会有不少缺点，比如不满意的检测限、反应时间长、抗干扰能力差等。此外，大多数的亚硫酸盐探针都是基于单波长，会受到各种环境条件（包括温度、仪器、探针浓度等）的影响。相比较而言，比率型探针可以通过两个发射光谱的自校准来消除影响，从而提供更为精确的检测分析。最近，许多基于迈克尔加成反应检测亚硫酸盐的比率型荧光探针正在不断发展。然而，这些探针虽然对亚硫酸盐衍生物具有很好的响应，但是却不能够定位线粒体。另外，许多报道的探针在检测离子时都或多或少的使用了有机溶剂。因此，研究出一种比率型、快速响应、水溶性且线粒体定位的荧光探针用于检测so2衍生物具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足,本发明一是要提供一种新型水溶性比率型so2衍生物荧光探针，具有优良的水溶性，较高的选择性灵敏度。二是提供该探针的制备方法；三是提供该探针在活细胞线粒体内so2衍生物检测方面的应用。

本发明所述的水溶性比率型so2衍生物荧光探针，其化学结构式如下式所示。

本发明还包括so2衍生物荧光探针的应用，式（1）化合物在pbs水溶液中对亚硫酸盐具有独特的荧光选择性。

本发明还包括so2衍生物荧光探针的合成方法，在乙醇溶液中，将香豆素醛和苯并噻唑按照1:1投料比例，在回流条件下反应，得到探针化合物。

配制探针的dmf溶液，分别加入定量的f^-，br^-，i^-，hco3^-，no3^-，clo^-，so4^2-，scn^-，s2o3^2-，s^2-，cys，hcy，gsh，hso3^-，so3^2-的水溶液，通过荧光光谱测试来研究对不同离子的选择性，测其荧光发射光谱强度变化发现：本发明所述的探针即式（1）化合物对hso3^-/so3^2-有独特的选择性，如图1所示。逐渐加入hso3^-/so3^2-，化合物在631nm处的荧光强度明显降低，同时，在478nm处荧光强度明显增强，如图2所示。因此，该探针作为so2衍生物荧光探针具有巨大的应用前景

本发明提供了一种so2衍生物荧光探针，实验证明本发明所述式（1）化合物可以与hso3^-/so3^2-在纯水溶液中发生反应。本发明所述式（1）化合物在pbs纯水溶液中对hso3^-/so3^2-具有独特的荧光选择性、较高的灵敏度及较强的抗干扰能力，具有巨大的应用前景。

附图说明

图1：式（1）化合物（5µm）的pbs溶液中加入等当量的不同离子后的荧光强度变化及比例柱状图（1.vacant;2.f^-;3.br^-;4.i^-;5.hco^3-;6.no^3-;7.clo^-;8.so4^2-;9.scn^-;10.s2o3^2-;11.s^2-;12.cys;13.hcy;14.gsh.15.hso3^-;16.so3^2-）。

图2：式（1）化合物（5µm)）的pbs溶液中进行hso3^-荧光滴定图，图中fluorescenceintensity为荧光强度，wavelength为波长，eq为倍数。

图3：式（1）化合物（5µm）和10µm的hso3^-共存的pbs溶液加入等当量的其他离子后荧光强度比值变化柱状图（1.vacant;2.f^-;3.br^-;4.i^-;5.hco^3-;6.no^3-;7.clo^-;8.so4^2-;9.scn^-;10.s2o3^2-;11.s^2-;12.cys;13.hcy;14.gsh）。

图4是式（1）化合物合成方法反应式图。

具体实施方式

实施例1：式（1）化合物的合成方案如下式所示：

具体合成步骤如下：

在50ml圆底烧瓶中依次加入化合物1(0.31g,0.71mmol)和化合物2(0.174g,0.71mmol)，20ml乙醇溶解，将反应混合物加热回流反应2.5h。tlc监测反应终点，减压蒸馏除去溶剂，粗产品用35ml的乙酸乙酯洗涤，得到红色固体(180mg)，产率38.7%。

核磁共振氢谱测定：¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ(ppm)=9.15(d,j=5.6hz,2h),8.84(s,1h),8.64(t,j=8.0hz,1h),8.43(d,j=8.0hz,1h),8.32(d,j=8.4hz,1h),8.19(t,j=6.8hz,2h),8.11(q,j=15.2hz,2h),7.88(t,j=7.6hz,1h),7.79(t,j=7.6hz,1h),7.64(d,j=9.2hz,1h),6.92(d,j=4.6hz,1h),6.69(d,j=2.0hz,1h),4.97-4.88(m,4h),3.58(t,j=6.8hz,4h),2.51(d,j=1.6hz,2h),1.18(s,6h)。

核磁共振氢谱测定：¹³cnmr(100mhz,dmso-d6),δ(ppm)=12.94,30.58,45.19,46.05,57.84,97.02109.57,111.00,111.42,112.28,116.94,124.79,128.21,128.51,128.65,129.78,132.40,141.75,144.88,145.32,146.24,147.92,153.89,157.91,160.29,172.47。

实施例2

向式（1）化合物(5µm)的pbs溶液中分别加入10µm的f^-，br^-，i^-，hco3^-，no3^-，clo^-，so4^2-，scn^-，s2o3^2-，s^2-，cys，hcy，gsh，hso3^-，so3^2-后，测其在478nm和631nm荧光发射强度比值变化发现：式（1）化合物对hso3^-/so3^2-有独特的荧光选择性，加入hso3^-/so3^2-后，式（1）化合物在631nm处荧光强度明显降低，同时，在478nm处荧光强度明显增强，i631/i478最低，如图1所示。

实施例3

向式（1）化合物(5µm)的pbs溶液中分别加入不同当量的hso3^-，测其在478nm和631nm荧光强度变化发现：式（1）化合物荧光强度随着hso3^-浓度的变化而变化，如图2所示。

实施例4

于式（1）化合物（5µm）和20当量的hso3^-的pbs溶液中分别加入20当量的f^-，br^-，i^-，hco3^-，no3^-，clo^-，so4^2-，scn^-，s2o3^2-，s^2-，cys，hcy，gsh后，测其在478nm以及631nm荧光发射强度比值变化发现：式（1）化合物对其他离子有较强的抗干扰能力，如图3所示。