节杆菌NX917及其吸附菌剂在邻苯二甲酸酯污染土壤修复中的应用的制作方法

本发明属农业生物领域，特别涉及一株去除农田土壤中dbp和dehp的高效降解菌及其吸附菌剂制备方法和应用。

背景技术：

邻苯二甲酸酯(phthalicacidesters，paes)又称酞酸酯，是一类人工合成的有机化合物，在塑料、化肥、农药、玩具、化妆品、清洁剂及涂料等行业中均有广泛应用，大约有20％～60％paes用于聚氯乙烯(pvc)的加工制造，作为增塑剂提高塑料制品的延展性和柔韧度。农膜的大量使用被认为是土壤中邻苯二甲酸酯重要的来源之一。由于邻苯二甲酸酯分子与塑料分子之间结合的范德华力极易断裂，随着时间的推移，邻苯二甲酸酯分子从塑料分子之中迁移到土壤中。土壤中邻苯二甲酸酯不仅影响土壤质量、植物的生长和品质、而且还在作物中具有一定的生物累积效应，被农作物和蔬菜吸收至可食用部分而污染食物链，对生态系统和人体健康构成严重威胁。其中，邻苯二甲酸二丁酯(dibutylphthalate，dbp)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhexylphthalate，dehp)是土壤中检出率较高，且含量较高的两种邻苯二甲酸酯类化合物，具有典型的内分泌干扰性和潜在的“三致”效应，因此，修复农田土壤邻苯二甲酸酯污染特别是dbp和dehp污染对保障农产品安全和人体健康具有十分重要的现实意义。

目前，土壤有机污染修复主要采用物理修复、化学修复和生物修复的方法。生物修复尤其是微生物修复技术由于具有安全，高效、无二次污染，经济效益好等优点，被人们认为是进行有机污染土壤修复最有效、最有前途的一种污染治理技术，但游离微生物在实际的环境中易受外界因素的影响，其降解作用难以充分发挥。采用固定化微生物技术，利用某一载体将筛选出的高效降解菌固定在一定的微观环境中，屏蔽外界的不利因素，最终提高对邻苯二甲酸酯污染物的降解率，使其在复杂的土壤环境中也可以稳定地发挥高效能。因此，通过吸附、包埋等方法将高效降解菌进行固定化后施用于污染土壤将会更好地提高外源菌对邻苯二甲酸酯的降解效果。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一株针对邻苯二甲酸酯(特别是dbp和dehp)具有高效降解能力的菌株，进而提供一种降解土壤中dbp、dehp的吸附菌剂，该菌剂制备方法操作简单，适宜广泛应用，能够解决农田土壤邻苯二甲酸酯污染问题。

本发明中所涉及的邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯(dbp)和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(dehp)，为两者的复合污染。

(1)邻苯二甲酸酯降解菌的筛选：本发明经过一系列筛选得到一株节杆菌nx917，分类名为arthrobactersp.，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为cctccm2018396，保藏日期为2018年6月25日。

(2)菌悬液的制备：将dbp、dehp降解菌培养至对数生长期，用生理盐水将菌体洗净后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使菌悬液的od600＝0.8-1.2；所述dbp、dehp降解菌为节杆菌nx917，分类名为arthrobactersp.，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为cctccm2018396，保藏日期为2018年6月25日。具体情况下，所述生理盐水为已灭菌的0.9％nacl溶液。

(3)吸附菌剂制备方法：将花生粕、麦麸、木屑、硅藻土粉碎过筛后80℃烘干，按一定比例混合成复合载体，120℃湿热灭菌30min。准确量取一定量的菌悬液均匀喷洒至复合载体并混合均匀，在一定温度条件下通风发酵培养一定时间，恒温烘干后粉碎4℃保存。

进一步地，所述步骤(1)中节杆菌nx917的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，组份为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1000ml。

进一步地，所述步骤(1)中节杆菌nx917的培养条件为：25-30℃、ph6.5-7.5、150-200r/min恒温震荡培养24-72h。优选28℃、ph7.0、170r/min恒温震荡培养24h。

进一步地，所述步骤(2)中清洗菌体的方法为：将节杆菌nx917的培养液于3500-4500rpm离心5-15min，弃上清液，用灭菌的生理盐水重悬沉淀后，重复离心及重悬沉淀的步骤1-3次。

上述节杆菌nx917在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用。

进一步地，节杆菌nx917应用的形式为吸附菌剂，用量为0.5-10ml/10g干土，降解过程中保持土壤含水量为田间最大持水量的55-65％。

本发明的优点在于：

(1)本发明提供的节杆菌nx917对土壤dbp和dehp复合污染具有高效的降解效果，在邻苯二甲酸酯污染土壤修复领域具有广泛的应用前景。

(2)本发明采用花生粕、麦麸、木屑、硅藻土复合载体作为吸附材料通过吸附方法制备降解dbp、dehp的菌剂，制备方法操作简单。

(3)降解菌的固定化效果好，对土壤中dbp、dehp的降解效率高，适宜于大面积的农田土壤邻苯二甲酸酯污染原位修复。施用吸附菌剂培养7天后对土壤中dbp、dehp的降解率达到89.6％和42.5％；相比之下，空白对照组dbp、dehp的降解率为19.1％和2.4％，游离菌处理组介于两组之间，dbp和dehp的降解率达到47.2％和12.8％。

附图说明

图1节杆菌nx917的划线培养结果；

图2ph值对节杆菌nx917降解dbp和dehp的影响；

图3初始浓度对对节杆菌nx917降解dbp和dehp的影响；

图4转速对节杆菌nx917降解dbp和dehp的影响；

图5接种量对节杆菌nx917降解dbp和dehp的影响；

图6温度对节杆菌nx917降解dbp和dehp的影响；

图7菌液接种量对菌剂降解dbp效果的影响；

图8菌液接种量对菌剂降解dehp效果的影响；

图9菌剂发酵时间对菌剂降解dbp效果的影响；

图10菌剂发酵时间对菌剂降解dehp效果的影响；

图11实施例3制备的吸附菌剂对土壤中dbp的降解性能；

图12实施例3制备的吸附菌剂对土壤中dehp的降解性能。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例中所用到的培养基如下：

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1000ml，121℃下灭菌30min。

无机盐培养基：k2hpo4·3h2o：1g，nacl：1g，nh4no3：0.5g，mgso4·7h2o：0.4g，cacl2：0.1g，fecl3·6h2o：0.01g，加水定容至1000ml，121℃下灭菌30min。

dbp/dehp无机盐培养基：各移取1ml浓度为5g/l的dbp和dehp丙酮溶液于完成灭菌的100ml无机盐培养基中，置于通风橱内。丙酮完全挥发后，即可得到浓度为100mg/l的dbp/dehp无机盐培养基(dbp、dehp均为100mg/l)。

实施例1邻苯二甲酸酯降解菌的筛选与鉴定

(1)邻苯二甲酸酯降解菌的筛选

在银川市郊区的蔬菜大棚中采集一定量的土样，准确秤取10g新鲜土样，加入盛有90ml蒸馏水和10ml玻璃珠的三角瓶中，置于摇床中30℃、175rpm振荡混匀，静置待用。

按1％的接种量从以上混合液中取1ml，加入到100ml初始浓度为100mg/l邻苯二甲酸酯(dbp、dehp均为50mg/l)的无机盐培养液中，置于摇床中30℃、175rpm避光条件下进行振荡培养7d。每次转接逐渐增加邻苯二甲酸酯浓度(包括200mg/l、500mg/l、800mg/l、1000mg/l、1500mg/l和2000mg/l)，每七天作为一个驯化周期转接一次，共经过6个驯化周期持续进行培养。

取100μl终期驯化液，涂布于2000mg/l邻苯二甲酸酯(dbp和dehp均为1000mg/l)的无机盐固体平板上，然后置于30℃生化培养箱中静置培养。待长出肉眼可见菌落后，观察其生长特征，筛选出长势最好的菌株，挑取单菌落将其反复划线接种于新的无机盐固体培养基上，直至镜检纯化为止。

(2)邻苯二甲酸酯降解菌的鉴定

①对筛选到的单菌落nx917进行形态观察，其培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、隆起形状、透明度、颜色、迁移性、质地、形态、边缘特征及光泽度等。菌株nx917在牛肉膏蛋白胨培养基平板上培养数天后。菌落呈圆形，淡黄色，黏质不透明，边缘整齐，表面隆起，湿润光滑，宽度一般在2～2.5mm。具体形态见图1。

②将菌株nx917送往上海生工生物股份有限公司进行分子生物学鉴定，经序列比对，其与节杆菌(arthrobactersp.)(genbank登录号cp017421.1)的同源性达到100％。综合菌株的形态特征及16srdna序列分析结果(seqidno.1)，初步鉴定菌株nx917为节杆菌(arthrobactersp.)。

实施例2节杆菌nx917对邻苯二甲酸酯降解能力检测

菌悬液的制备：挑取光滑完整的节杆菌nx917菌落，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在摇床中28℃、170r/min恒温震荡培养24h。取出牛肉膏蛋白胨液体培养基后，将培养液装于已灭菌的离心管中，在室温条件下，于4000r/min离心分离10min，收集湿菌体。然后用灭菌的生理盐水(0.9％的nacl溶液)洗涤三次。最后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使其在波长λ＝600nm条件下的吸光度值od＝1。

dbp/dehp无机盐培养基中dbp/dehp残留量的测定：向100ml的dbp/dehp无机盐培养基中加入乙酸乙酯30ml，振荡30min，然后转移至分液漏斗振荡5min后分液，再用10ml的乙酸乙酯冲洗三次，将乙酸乙酯溶液全部转移到平底烧瓶中。用玻璃层析柱(1.2cm×30cm)依次加入4g无水硫酸钠、6g弗罗里硅土和4g无水硫酸钠，先用10ml的乙酸乙酯预洗柱子，弃去该淋洗液，将平底烧瓶中的乙酸乙酯萃取液分3次转移到层析柱中，再用50ml的乙酸乙酯进行洗脱。收集全部洗脱液于鸡心瓶中，35℃经旋转蒸发浓缩至恰好蒸干后，用色谱级正己烷定容至2.0ml后，过有机系0.22μm滤膜后进行气相色谱质谱分析。

采用气相色谱质谱联用法对dbp和dehp进行测定。色谱条件为：色谱柱：rtx-5ms石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：高纯氦气；进样口温度：240℃；柱箱温度70℃；流速：1ml/min；进样量1ul；分流进样。升温程序：240℃，保持5分钟；以5℃/min速率升温至280℃，保持1min。质谱条件为：el离子源，离子源温度250℃，四极杆温度150℃，接口温度280℃，溶剂延迟时间3min；全扫描定性分析的扫描范围50-90amu，选择离子检测scan模式对化合物进行定量分析。

(1)ph值对节杆菌nx917降解dbp和dehp的影响

dbp/dehp初始浓度均为100mg/l的dbp/dehp无机盐培养基，用0.1mol/lhcl和0.1mol/lnaoh调节培养基的ph值分别为ph＝5.0、ph＝6.0、ph＝7.0、ph＝8.0、ph＝9.0，灭菌。在菌悬液接种量2％(体积比)、温度30℃、转速150r/min的条件下振荡培养5天，测定dbp/dehp残留量并计算降解率。

降解率计算公式：降解率(％)＝((邻苯二甲酸酯初始浓度—邻苯二甲酸酯残留浓度)/邻苯二甲酸酯初始浓度)×100％。

图2的结果表明：nx917菌株对邻苯二甲酸酯的降解能力随着ph值的升高而先升高后降低，当ph＝7时，nx917对dbp和dehp降解率最高，分别为80.87％和42.57％。因此，菌株降解dbp和dehp的最佳ph条件为7。

(2)初始浓度对对节杆菌nx917降解dbp和dehp的影响

dbp/dehp初始浓度为50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l的dbp/dehp无机盐培养基灭菌后，将2％菌悬液分别加入不同浓度dbp/dehp无机盐培养基，在ph＝7、温度30℃、转速150r/min条件下振荡培养5天，测定dbp/dehp残留量并计算降解率。

图3的结果表明：随着初始浓度的增大，dbp和dehp降解率均呈现先增大后减小的趋势。当初始浓度为100mg/l时，菌株对dbp和dehp的降解率均达到最高，分别为73.63％和62.58％。因此，菌株降解dbp和dehp的最佳初始浓度为100mg/l。

(3)转速对节杆菌nx917降解dbp和dehp的影响

dbp/dehp初始浓度均为100mg/l的dbp/dehp无机盐培养基灭菌后，在菌悬液接种量为2％(体积比)、ph＝7、温度30℃条件下，分别在0、100r/min、150r/min、175r/min、200r/min的转速条件下振荡培养5天，测定dbp/dehp残留量并计算降解率。

图4的结果表明：在转速为175r/min的条件下，菌株nx917对dbp和dehp的降解率最高，分别达到85.55％和39.86％。因此，菌株降解dbp和dehp的最佳转速为175r/min。

(4)接种量对节杆菌nx917降解dbp和dehp的影响

dbp/dehp初始浓度均为100mg/l的dbp/dehp无机盐培养基灭菌后分别加入0、1％、2％、3％、4％(体积比)的菌悬液，在ph＝7、温度30℃、转速175r/min的条件下振荡培养5天，测定dbp/dehp残留量并计算降解率。

图5的结果表明：在菌悬液接种量为4％的条件下，菌株nx917对dbp和dehp的降解率最高，分别达到96.63％和36.69％。因此，菌株降解dbp和dehp的最佳菌悬液接种量为4％。

(5)温度对节杆菌nx917降解dbp和dehp的影响

dbp/dehp初始浓度均为100mg/l的dbp/dehp无机盐培养基灭菌后，在菌悬液接种量为4％(体积比)、ph＝7、转速175r/min条件下，分别在温度为20℃、30℃、40℃条件下振荡培养5天，测定dbp/dehp残留量并计算降解率。

图6的结果表明：在温度为40℃的条件下，菌株nx917对dbp和dehp降解率最高，分别达到95％和59.65％。因此，菌株降解dbp和dehp的最佳温度为40℃。

实施例3吸附菌剂制备条件的优化

(1)菌悬液的制备：将节杆菌nx917接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃，170r/min的条件下培养24h。取出液体培养基后，将液体分装于50ml的无菌离心管中，于4000rpm下离心10min。弃去上清液后，用灭菌后的生理盐水重悬后再次离心，清洗两次后，用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使其od600＝1.0。

(2)吸附菌剂的制备方法：将载体按一定质量比例混合，120℃湿热灭菌30min，冷却后接种15％菌液，同时加入15％营养液混匀分装，在30℃下通风发酵48h，恒温烘干后粉碎4℃保存即得。

本实施例为了确定吸附菌剂最佳的制备条件，选择了载体配比、菌液接种量、发酵时间为影响因素，通过实验，优化制备条件。

①载体配比的对菌剂活菌量的影响

由表1可以看出，花生粕、麦麸、木屑和硅藻土的比例会影响菌剂中的活菌数。在载体重量配比为60∶20∶15∶5时，为菌体提供了最适合的生长环境，活菌含量最多，达到20.3×10⁸cfu/g。

表1不同载体配比制备的菌剂的活菌量

②菌液接种量对菌剂降解邻苯二甲酸酯的影响

当载体m(花生粕)∶m(麦麸)∶m(木屑)∶m(硅藻土)按60∶20∶15∶5比例混合、营养液为10％时，菌液接种量对菌剂降解dbp和dehp效果的影响见图7、图8，菌剂对dbp的降解率接种量为5％时均最高，在3天、5天、7天的降解率分别为89.8％、93.3％、99.2％，接种量越高，降解效率越低。菌剂对dehp降解率分两种情况，在3天和5天时，接种量为25％，降解率最高，分别为55.3％、71.3％，第7天的降解率在接种量为20％时最高，为87.9％。

③发酵时间对菌剂降解邻苯二甲酸酯的影响

当载体m(花生粕)：m(麦麸)：m(木屑)：m(硅藻土)按60∶20∶15∶5比例混合、接菌量为15％、营养液量为15％时，发酵时间对菌剂降解dbp和dehp效果的影响见图9、图10，菌剂对dbp的降解率在发酵时间为72h时最高，3天、5天、7天的降解率分别为56.3％、74.3％、87.1％；菌剂对dehp降解率同样是发酵时间为72h时最高，在3天、5天、7天的降解率分别为29.9％、55.8％、75.4％。结果表明发酵时间过短，影响菌体的繁殖，造成活菌数较少。

实施例4吸附菌剂对土壤中邻苯二甲酸酯的降解效果

利用实施例3确定的最优化条件制备吸附菌剂，分别测试游离的菌悬液及本实施例中制备的吸附菌剂对土壤中dbp、dehp的降解效果，设空白对照。

每份称取200g污染土壤样品(dbp、dehp含量各为50mg/kg)于棕色样品瓶中。游离菌组：向土壤样品中加入od600＝1.0的菌悬液20ml(菌悬液接种量为10％)；吸附菌剂组：向土壤样品中加入上述制备得到的吸附菌剂1.5g(相当于20ml菌悬液的活菌量)；空白对照组：不添加游离菌和吸附菌剂。再向各组中加入灭菌去离子水，使土壤含水量为田间最大持水量的60％，封口后放入25℃生化培养箱中暗培养，分别在培养到第3、5、7天时取样进行分析。

经过7天的室内培养，在施加吸附菌剂处理组中，dbp、dehp的降解率分别达到89.6％、42.5％；相比之下，空白对照组dbp、dehp的降解率分别为19.1％和2.4％，游离菌处理组介于两组之间，dbp、dehp的降解率达到47.2％和12.8％(图11、图12)。说明本发明的吸附菌剂能够显著提高对dbp、dehp的降解率。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110>宁夏大学

<120>节杆菌nx917及其吸附菌剂在邻苯二甲酸酯污染土壤修复中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1485

<212>dna

<213>arthrobactersp.

<400>1

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