本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及生产草酸氧化酶的大肠杆菌表达系统、草酸氧化酶的生产方法及其应用。
背景技术：
：草酸氧化酶(oxalateoxidase,oxox,ec1.2.3.4)催化草酸氧化成co2和h2o2，主要存在于植物中(胡一鸿等,植物草酸氧化酶.生命的化学,2009,29(2):295-297)，在草酸积累相关疾病的诊断、体内草酸的清除等方面具有很大的应用潜力。在多种植物组织和微生物中已检测到草酸氧化酶活力(kunalkumar&prasanna.d.belur.anewextracellularthermostableoxalateoxidaseproducedfromendophyticochrobactrumintermediumcl6:purificationandbiochemicalcharacterization.preparativebiochemistryandbiotechnology,2016,46(7):734-739)，如大麦、小麦、甜菜、玉米、高粱以及白腐菌、虫拟蜡菌和假单胞菌(pseudomonassp.ox-53.)等。oxox属于cupin超家族。x线衍射显示大麦oxox是一个盘状的同六聚物，含1206个氨基酸、6个mn离子和1,512个h2o；单体分子量26,000，含有一个不规则的n末端延伸、3个α螺旋组成的α螺旋c末端区(赵树田等，草酸代谢酶的研究进展.上海交通大学学报(医学版),2007,27(10):1274-1277)。大麦oxox属于cupin家族monocupins亚群，具有超氧化物歧化酶活性，其活性需要mn，主要是mn2+及少量mn3+。大麦的oxox单体的β桶状域中含有2个保守基序，其中有1个谷氨酸和3个组氨酸残基可结合mn2+。目前草酸氧化酶的生产主要有植物组织提取(周海等,水稻谷糠中的草酸氧化酶及其特性研究.食品科学，2010,31(5):190-193)和重组表达(whittakermm.etal.characterizationofrecombinantbarleyoxalateoxidaseexpressedbypichiapastoris.journalofbiologicalinorganicchemistry,2002,7(1):136-145；casslandp.etal.heterologousexpressionofbarleyandwheatoxalateoxidaseinane.colitrxbgordoublemutant.journalofbiotechnology,2004,109(1-2):53-62)。植物提取方法受原料的影响比较大，含量较低，提取工艺复杂，收率低，植物提取的草酸氧化酶一般是与植物细胞壁稳定的结合，是固体不溶物，不便于其在草酸检测中的检测。重组表达的草酸氧化酶，目前只有大麦、小麦和白腐菌中的草酸氧化酶在毕赤酵母中实现了分泌表达，但表达量很低，发酵周期长，而且需要纯化到较高纯度才有活性，总的生产成本较高。虽然也有在大肠杆菌中表达大麦和小麦草酸氧化酶的报道，但表达量很低，表达的草酸氧化酶形成包涵体，纯化工艺复杂且活性非常低。总体上，草酸氧化酶重组表达的种类较少，表达量偏低，生产成本较高，限制了其在诊断和治疗与草酸相关的疾病方面的应用。大肠杆菌具有遗传性状了解透彻、生长快、培养经济、表达水平高、待选质粒和宿主多等特点，在基因工程
技术领域：
：成为首选的表达系统。但是外源蛋白往往在获得高水平表达的同时，容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵体。目前国内外对蛋白质体外复性研究较多，但其过程往往费时、费力，且不经济，因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。目前有助于提高目的蛋白在大肠杆菌表达系统中可溶性表达的实验方案主要有：(1)降低蛋白合成的速度，可以通过以下方法实现：降低培养温度，使用弱启动子，使用低拷贝数的质粒表达载体和降低诱导物的浓度；(2)改变培养基，可以通过以下方法实现：培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子，加入缓冲液维持ph稳定，加入1％的葡萄糖，抑制lac启动子，加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子和加入乙醇、硫醇和二硫化物等；(3)与分子伴侣或折叠酶共蛋白表达。大肠杆菌中常用的分子伴侣有：groes-groel，dnak-dnaj-grpe，clpb；大肠杆菌中常用的折叠酶有：ppi's(peptidylprolylcis/transisomerases)，dsba(disulfideoxidoreductase)，dsbc(disulfideisomerase)和pdi(proteindisulfideisomerase)；(4)分泌表达，使目的蛋白分泌到周质空间。周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成，而胞内则是还原性的。周质空间有折叠酶dsba和dsbc的存在，帮助蛋白正确折叠。周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解，可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在；(5)使用特定的菌株，如ad494或origami菌株；(6)与可溶性标签蛋白融合表达；(7)体外去折叠，重新折叠。以上促进目的蛋白在大肠杆菌表达系统中可溶性表达的实验方案，单独或联合使用对许多在大肠杆菌中形成包涵体的蛋白的可溶性表达是有促进作用的，不同的蛋白适用的方法不一样，需要摸索和优化。对于某些复杂酶蛋白，尤其是多亚基的酶和空间结构十分复杂的蛋白，如草酸分解酶类(包括有草酸氧化酶、草酸脱羧酶和草酰辅酶a脱羧酶/甲酰辅酶a转移酶等)几乎都是含有2-8个亚基的多亚基酶，聚合物分子量多数在120kda以上，单独使用或联合使用以上方法并不奏效，往往得到的也都是无活性的包涵体，即使部分蛋白可溶也没有酶活性或活性很低，对这些复杂蛋白找到一种在大肠杆菌中可溶且有活性的表达方案并非易事。利用分子伴侣共表达改善目的蛋白可溶表达所得到的实验结果并不一致，而且迄今为止，伴侣分子的共表达对基因表达的影响似乎都具有蛋白质特异性。目前尚不清楚在基因过度表达的情况下，分子伴侣的体内水平是否受到限制，正常情况下，蛋白质的折叠最终达到一种热力学的稳定状态。特别不稳定的蛋白即使在伴侣分子存在的情况下，或许也不能正确折叠。在大肠杆菌中共表达分子伴侣和草酸氧化酶，同时过表达锰离子通道相关蛋白，以促进草酸氧化酶表达的研究，目前尚未有文献报道。技术实现要素：针对现有技术中，在大肠杆菌中表达草酸氧化酶常常得到无活性的包涵体，且复性工艺复杂，成本高的问题，本发明的目的是提供一种新的生产草酸氧化酶的大肠杆菌表达系统，该系统包含大肠杆菌菌株和对应的质粒，利用该系统可以生产可溶且有活性的草酸氧化酶。本发明的另一目的在于提供上述大肠杆菌表达系统生产草酸氧化酶的方法。本发明的另一目的在于提供上述方法获得的草酸氧化酶在制备草酸测定试剂盒中的应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：本发明提供一种生产草酸氧化酶的大肠杆菌表达系统，所述大肠杆菌表达系统中的重组表达质粒包含：草酸氧化酶基因、分子伴侣基因和促进锰离子泵入大肠杆菌细胞相关蛋白的基因。所述大肠杆菌表达系统相较于现有技术而言，具有以下优点：(1)大肠杆菌表达的草酸氧化酶大部分是可溶且有活性的，比活力高；(2)即使存在少量不可溶的包涵体，也是属于非典型包涵体，通过简单纯化或缓冲液溶解就可得到有活性的可溶酶；(3)草酸氧化酶的分离纯化工艺简单；(4)总生产成本低，有利于工业化应用。优选的，所述促进锰离子泵入大肠杆菌细胞相关蛋白的基因在单个所述重组表达质粒上至少含有1个拷贝。更优选的，所述促进锰离子泵入大肠杆菌细胞相关蛋白的基因在单个所述重组表达质粒上的拷贝数为1～4个；更优选的，所述拷贝数为1或2个；最优选的，所述拷贝数为2个，此时草酸氧化酶的表达效果最佳。优选的，所述促进锰离子泵入大肠杆菌细胞相关蛋白的基因，为来源于大肠杆菌的mnth基因、mnts基因、oxyr基因，或与所述mnth基因、mnts基因、oxyr基因编码的蛋白有类似功能的来源于其他物种的基因。所述mnth基因及其终止子dna片段如序列表seqidno.7所示，所述mnts基因及其终止子dna片段如序列表seqidno.8所示，所述oxyr基因及其终止子dna片段如序列表seqidno.9所示。更优选的，所述促进锰离子泵入大肠杆菌细胞相关蛋白的基因为mnts基因，对草酸氧化酶的表达效果最好。重组大肠杆菌诱导表达草酸氧化酶时，优选的，所述分子伴侣基因和促进锰离子泵入大肠杆菌细胞相关蛋白的基因是过表达的。具体的，过表达所述促进锰离子泵入大肠杆菌细胞相关蛋白的基因有以下几种方法：(1)过表达来源于大肠杆菌的锰离子泵入蛋白mnth或与该蛋白有类似功能的蛋白；(2)过表达来源于大肠杆菌的锰离子伴侣蛋白mnts或与该蛋白有类似功能的蛋白；(3)过表达来源于大肠杆菌的oxyr蛋白或与该蛋白有类似功能的蛋白，上述方法均可提高上述大肠杆菌重组菌株培养过程中胞内的锰离子浓度，进而提高草酸氧化酶的可溶且有活性的表达。上述方案中优选的方案是(2)或(3)中的任意一种或其组合；更优选方案(2)。优选的，所述草酸氧化酶为草酸氧化酶b10，基因序列如序列表seqidno.1所示，b10基因编码对应的氨基酸序列如seqidno.11所示。优选的，所述的分子伴侣基因为groes-groel基因，所述分子伴侣基因的启动子选自p43启动子、m1-93启动子、arabad启动子、lac启动子或t7启动子。所述p43启动子序列如序列表seqidno.2所示，m1-93启动子序列如序列表seqidno.3所示，arabad启动子序列如序列表seqidno.4所示，lac启动子序列如序列表seqidno.5所示，t7启动子序列如序列表seqidno.6所示。更优选的，所述分子伴侣基因的启动子选自p43启动子或m1-93启动子；最优选的，所述分子伴侣基因的启动子为p43启动子。大肠杆菌重组菌株的宿主菌株可选自商业化的菌株bl21(de3)、bl21trxb(de3)、rosetta(de3)、origami2(de3)、origamib(de3)或rosetta-gami2(de3)等，优选的，所述大肠杆菌表达系统的宿主菌株为origami2(de3)。本发明将所述重组表达质粒导入到大肠杆菌origami2(de3)中筛选获得重组大肠杆菌。本发明还提供所述的大肠杆菌表达系统用于生产草酸氧化酶的方法，所述的大肠杆菌表达系统诱导表达草酸氧化酶时，所使用培养基为jl培养基，所述jl培养基包含：酵母提取物0.5-1.5％w/v，胰蛋白胨1-2.5％w/v，kh2po410-25mm，(nh4)2so410-50mm，甘露醇1-3％w/v，丁二酸钠5-30mm，mgso40.1-0.6mm，起始ph6.0-7.5。更优选的，所述jl培养基包含：酵母提取物0.75％(w/v)，胰蛋白胨1.5％(w/v)，kh2po415mm，(nh4)2so425mm，甘露醇2％(w/v)，丁二酸钠20mm，mgso40.25mm，起始ph6.5。优选的，所述的大肠杆菌表达系统诱导表达草酸氧化酶时，经jl培养基培养至od600达到1.0-1.2开始诱导，并向所述jl培养基中补加mn2+的终浓度为1-10mm。更优选的，补加mn2+的终浓度为5mm。所述补加的mn2+可以选择mncl2或mnso4。优选的，所述的大肠杆菌表达系统诱导表达草酸氧化酶时，还向所述jl培养基中补加了终浓度为0.5mm的iptg。优选的，所述的大肠杆菌表达系统诱导表达草酸氧化酶时，还需额外补加l-阿拉伯糖0.5g/l，诱导时降低温度到28℃，诱导培养20-24h停止培养。优选的，所述的大肠杆菌表达系统获得重组菌株后，单克隆接种到lb液体种子培养基中培养至od600＝1.0-1.2，再以2％(v/v)的接种量接种到jl培养基诱导表达草酸氧化酶，所述lb液体种子培养基包含：酵母提取物0.5％(w/v)、蛋白胨1％(w/v)、nacl1％(w/v)、20μg/ml氯霉素、50μg/ml卡拉霉素。优选的，所述诱导表达草酸氧化酶后进行纯化过程，用终浓度为15-30％(w/v)硫酸铵对表达草酸氧化酶的重组细胞破碎液的离心上清进行沉淀，沉淀用缓冲液溶解，所述缓冲液的成分包含：ph8.0-9.0、5-25mm的硼酸盐，5-20％(v/v)的异丙醇和0-40％(v/v)的甘油。更优选的，所述硫酸铵的终浓度为20％；所述硼酸盐浓度为10mm。更优选的，所述纯化过程包括如下步骤：s1.对所述的大肠杆菌表达系统诱导表达草酸氧化酶后的湿菌体进行超声裂解；s2.离心，分别收集沉淀和上清液，将所述沉淀中的残余液体吸干，称重，计算湿沉淀的重量；s3.充分悬浮步骤s2所得的沉淀，将悬浊液旋转培养一段时间后，离心，去上清；s4.将步骤s3所得的湿沉淀按每g加入1.5ml缓冲液，充分悬浮沉淀，将悬浊液旋转培养一段时间后，离心，收集上清液；s5.向步骤s2和s4离心获得的上清液中，冰水浴中缓慢加入终浓度为15-30％硫酸铵，4℃静止0.5-2h，离心收集沉淀，沉淀用缓冲液溶解，置于4-8℃冰箱保存。上述纯化过程获得的细胞破碎液上清和细胞破碎液沉淀中均有草酸氧化酶活性，且细胞破碎液上清的样品的酶活性比细胞破碎液沉淀的纯化样品高，细胞破碎液上清初步纯化的草酸氧化酶的比活力大于20u/mg，单体分子量大小在25kda左右。发明人发现在大肠杆菌中共表达分子伴侣，同时过表达或抑制锰离子通道相关蛋白表达或影响胞内锰离子浓度相关的蛋白，可促进草酸氧化酶的可溶且有活性表达。本发明还提供所述的方法获得的草酸氧化酶在制备草酸测定试剂盒中的应用，所述应用包含制备治疗高尿酸血症的药物，制备预防和治疗肾结石的药物，制备低草酸食品，或降解草酸的工业领域应用中的任意一种或多种。所述降解草酸的工业领域应用包括降解造纸废水中的草酸等工业领域的应用。纯化后的草酸氧化酶可应用于各种来源的草酸样品，如尿草酸和血草酸的检测，以及科研和临床诊断用草酸检测试剂盒的开发。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过选择理想的锰离子泵入大肠杆菌胞内的通道蛋白或调控蛋白，优化提高大肠杆菌胞内的锰离子浓度，草酸氧化酶、分子伴侣和锰离子泵入大肠杆菌胞内的通道蛋白或调控蛋白共表达、优化培养基组成等手段，提供了多种可选择的更优化的大肠杆菌工程菌表达重组草酸氧化酶的生产工艺，使得草酸氧化酶在大肠杆菌中的表达活力超过80u/ml，细胞破碎液上清初步纯化的草酸氧化酶的比活力大于20u/mg，单体分子量大小在25kda左右。这同时也为最终找到表达草酸氧化酶的最优组合提供了一个可能的发展方向和技术路线。与传统的大肠杆菌表达体系相比较，本发明所构建的表达系统将大肠杆菌中表达为无活性包涵体的草酸氧化酶，改变成表达出可溶且有高活性的草酸氧化酶，为草酸氧化酶在大肠杆菌中的工业化生产应用提供了有益的理论及实践依据。本发明技术方案具有生产和纯化工艺简单，表达量和比活力高，易于工业放大，成本低，有利于这类酶的工业化生产和应用等显著优势。附图说明图1为草酸氧化酶b10基因表达质粒pgel-mnth-b10图谱。图2为5种不同菌株表达草酸氧化酶的对比。图3为草酸氧化酶b10基因表达质粒pgel-mnts2-b10图谱。图4为草酸氧化酶b10基因表达质粒pgel-mnts3-b10图谱。图5为草酸氧化酶b10基因表达质粒pgel-mnts4-b10图谱。图6为表达载体中不同拷贝的mnts对b10基因表达的影响。图7为分子伴侣基因前不同的启动子对草酸氧化酶表达的影响。图8为不同的培养基对草酸氧化酶表达的影响。图9为sds-page分析草酸氧化酶初步纯化的样品；其中，m：蛋白marker；泳道1：用重组菌株pgel-mnts-b10/origami2(de3)细胞破碎液离心的沉淀纯化的样品；重组菌株pgel-mnts-b10/origami2(de3)细胞破碎液离心的上清液纯化的样品。具体实施方式下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。下述实施例中，草酸氧化酶基因b10(seqidno.1)、p43启动子(seqidno.2)、m1-93启动子(seqidno.3)、arabad启动子(seqidno.4)和lac启动子(seqidno.5)都是由发明人通过全基因合成；t7启动子(seqidno.6)来自pet-28a(+)载体。下述实施例中，mnth基因及其终止子dna片段(seqidno.7)，mnts基因及其终止子dna片段(seqidno.8)和oxyr基因及其终止子dna片段(seqidno.9)，均从大肠杆菌k12mg1655菌株的基因组扩增得到。另外，全基因合成含mnts基因的dna片段(seqidno.10)，该dna片段中mnts基因前带有核糖体识别位点，mnts基因后面接有终止子序列。下述实施例中，将草酸氧化酶b10基因插入到大肠杆菌表达载体中，所述大肠杆菌表达载体可以选择pet系列载体、pcold系列、pgex系列载体或其他能用于大肠杆菌系统中表达蛋白的载体，本发明以pet系列载体中常用的pet-28a(+)载体为例来构建表达锰离子蛋白重组质粒。获得的b10基因对应的氨基酸序列如seqidno.11所示。作为一种优选的实施方式，所述分子伴侣基因选用来自pgro7质粒的groes-groel；将上述重组质粒导入到大肠杆菌宿主菌得到大肠杆菌重组菌株，所述大肠杆菌重组菌株的宿主菌株可选自商业化的菌株bl21(de3)、bl21trxb(de3)、rosetta(de3)、origami2(de3)、origamib(de3)、rosetta-gami2(de3)等，优选origami2(de3)菌株。草酸氧化酶活力的测定方法可采用现有方法，下述实施例中，具体采用hplc检测方法测定草酸氧化酶活力，具体步骤如下：用50mm柠檬酸-naoh(ph5.0)与100mm草酸储备液按比例混合，分别配制成0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1mm草酸标准溶液；取10-20μl的含草酸氧化酶的溶液(蛋白浓度0.1-0.2mg/ml)，加入1ml的2.5mm草酸溶液中(ph5.5)中，37℃，800rpm恒温混匀仪反应20min，加入50μl的2.5mh2so4终止反应。样品处理：①将终止反应后的样品12000rpm离心10min，取上清转入液相进样瓶；②将样品12000rpm离心10min取上清用0.45μm膜过滤至液相进样瓶中。检测条件：进样量20μl；柱温：55℃；流动相：2.5mmh2so4；流速0.6ml/min；色谱柱：sepaxcarbomixh-np10:0.5％；采样时间22min。测定草酸标准样品，通过液相图谱得出相应浓度的样品对应的相应积分面积绘制标准曲线。将处理后的样品通过hplc进行检测，并对得到的数据图谱进行处理，得出相对应的草酸面积，计算酶活单位可根据草酸的减少量来衡量。酶活力单位定义为每分钟消耗1μmol的草酸定义为1个活力单位。下述实施例中的表达分子伴侣的质粒来自takara公司，本发明中用到的其它大肠杆菌菌株和质粒为通过国内外出售常规生物材料的公司购买；本发明中用到的分子生物学试剂从thermofisher公司和toyobo公司购买；无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司(http://www.vazyme.com/)；其它常用生化试剂均是市售分析纯；pcr产物回收和胶回收dna的方法均采用omega公司的试剂盒的方法。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；各种试剂及培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1表达载体pgel-mnth-b10的构建以全基因合成的b10基因(序列如seqidno.1所示)为模版，设计引物对f1/r1，对该基因进行pcr扩增，对扩增产物进行胶回收纯化，方法参照市售dna小量纯化试剂盒说明书的方法，最终得到dna片段1(即b10基因片段)。pcr体系为：10×pcrbuffer5μl，2mmdntp5μl，25mmmgso45μl，10μmprimerf/r各1.5μl，模版dna0.5μl，kod-plus-neo1μl，ddh2o32.5μl；pcr反应条件如下：94℃3min,30个循环(98℃10s，60℃30s，68℃35s)，68℃5min，4℃保温10min；以下载体构建的叙述中pcr体系与上述叙述都是一致的，下面不再赘述，pcr反应条件略有不同，主要是退火温度和延伸时间不同。以商业化购买的pet-28a质粒为模版，设计引物对f2/r2对，对质粒进行扩增，pcr反应条件中退火温度57℃，延伸时间5min，其它条件与上述b10基因扩增的pcr条件一样，扩增产物用限制性内切酶dpni在37℃消化2h(50μl体系，反应条件参照说明书)，对消化后的扩增产物进行胶回收纯化，最终得到dna片段2(pet-28a片段)。通过无缝克隆试剂盒的方法，采用无缝克隆试剂盒说明书的方法，于冰水浴中配制如下的反应体系，将上述dna片段1和dna片段2连接起来，转化大肠杆菌dh5α。ddh2oupto20μl5xbuffer4μldna片段2(pet-28a片段)80ngdna片段1(即b10基因片段)40ng重组酶2μl用inoue法制备dh5α超级感受态，方法参考《分子克隆实验指南(第3版)》，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pet28a-b10；上述所用引物序列如下：f1：5’-agaaggagatataccatgtctgatcctggtctcct-3’r1：5’-gttagcagccggatcttaagcaacatcagttaagag-3’f2：5’-gatccggctgctaacaaagc-3’r2：5’-ggtatatctccttcttaaag-3’以合成的p43启动子dna(序列如seqidno.2所示)片段为模板，设计引物对f3/r3进行pcr扩增，产物纯化后得到dna片段3；以分子伴侣质粒pgro7质粒dna为模板，设计引物对f4/r4扩增groes-groel基因簇，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段4；以重组质粒pet28a-b10为模板，设计引物f5/r5进行扩增，产物纯化后得到dna片段5；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段3、4和5连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-b10。上述所用引物序列如下：f3：5’-ggatctcaactcgagtgataggtggtatgttttcg-3’r3：5’-gcgatagttcgtcatcgttcatgtctcctttttta-3’f4：5’-aaggagacatgaacgatgaatattcgtccattgcat-3’r4：5’-tagtgctcgaattcattacatcatgccgcccatg-3’f5：5’-aagcttgaagatcctttgatc-3’r5：5’-ctcgagttgagatcctttttttc-3’以合成的m1-93启动子序列(序列如seqidno.3所示)为模版，设计引物对f6/r6扩增，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段6；采用细菌基因组dna提取试剂盒提取大肠杆菌jm109的基因组dna，以大肠杆菌k12mg1655菌株的基因组dna为模板，设计引物对f7/r7扩增包含mnth基因及其终止子的dna片段(序列如seqidno.7所示)，产物纯化后得到dna片段7；以pgel-b10质粒dna为模版，设计引物对f8/r8扩增线性化的载体，产物纯化后得到dna片段8；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段6、7和8连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-mnth-b10(图1)。上述所用引物序列如下：f6：5’-ggattggcgaatgggttatctctggcggtgttgac-3’r6：5’-gcgatagttcgtcatatgagctgtttcctggtttaaac-3’f7：5’-caggaaacagctcatatgacgaactatcgcgttgag-3’r7：5’-gaaaagtgccacctgaatggagcacaatgcctgat-3’f8：5’-caggtggcacttttcggggaaatg-3’r8：5’-cccattcgccaatccggatatag-3’实施例2表达载体pgel-mnts-b10和pgel-oxyr-b10的构建以大肠杆菌k12mg1655菌株的基因组dna为模板，设计引物对f9/r9扩增mnts基因和终止子的dna片段(序列如seqidno.8所示)，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段9；以质粒小提试剂盒提取的pgel-mnth-b10质粒为模版，设计引物对f8/r10进行扩增，产物纯化后得到dna片段10；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段9和10连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-mnts-b10。本实施例中所用pcr扩增和无缝克隆的体系和方法与实施例1类似，此处不在赘述。上述所用引物序列如下：f9：5’-caggaaacagctcatatgaatgagttcaagaggtg-3’r9：5’-gaaaagtgccacctgagggtcaatacctgcaagag-3’f8：5’-caggtggcacttttcggggaaatg-3’r10：5’-atgagctgtttcctggtttaaacg-3’以大肠杆菌k12mg1655菌株的基因组dna为模板，设计引物对f11/r11扩增oxyr基因和终止子的dna片段(序列如seqidno.9所示)，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段11；以质粒小提试剂盒提取的pgel-mnth-b10质粒为模版，设计引物对f8/r10进行扩增，产物纯化后得到dna片段12；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段11和12连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-oxyr-b10。上述所用引物序列如下：f11：5’-caggaaacagctcatatgaatattcgtgatcttgag-3’r11：5’-gaaaagtgccacctgcgaaattattcatatcggtca-3’f8：5’-caggtggcacttttcggggaaatg-3’r10：5’-atgagctgtttcctggtttaaacg-3’实施例3不同锰离子通道蛋白的表达测试质粒小提试剂盒的方法提取pet28a-b10、pgel-b10、pgel-mnth-b10、pgel-mnts-b10和pgel-oxyr-b10的质粒dna，转化origami2(de3)菌株，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株pet28a-b10/origami2(de3)，pgel-b10/origami2(de3)，pgel-mnth-b10/origami2(de3)，pgel-mnts-b10/origami2(de3)和pgel-oxyr-b10/origami2(de3)。将抗性平板上的单克隆接种到lb液体种子培养基(酵母提取物0.5％(w/v)，胰蛋白胨1％(w/v)，nacl1％(w/v)，20μg/ml氯霉素，50μg/ml卡拉霉素)中培养至od600＝1.0-1.2，以2％(v/v)的接种量接种到jl培养基(酵母提取物0.5％(w/v)，胰蛋白胨1.0％(w/v)，kh2po410mm，(nh4)2so420mm，甘露醇1.2％(w/v)，丁二酸钠10mm，mgso40.15mm，起始ph6.0-7.5)中，培养温度37℃，摇床转速150转每分钟，培养至od600达到1.0开始诱导，并补加诱导物，所有菌株均需要补加终浓度为0.5mm的iptg和终浓度为5mm的mncl2或mnso4，诱导时降低温度到28℃，诱导培养20-24h停止培养，取1.5ml菌液13000g离心5min，去上清，加入1.5ml0.9％生理盐水清洗菌体一次，13000g离心5min，去上清，加入1.5ml50mmtris-hcl(ph8.0)的buffer，充分悬浮菌体后超声裂解。取细胞裂解液离心后的上清进行草酸氧化酶活力检测。结果发现重组菌株pgel-mnth-b10/origami2(de3)，pgel-mnts-b10/origami2(de3)和pgel-oxyr-b10/origami2(de3)的破碎液上清中有草酸氧化酶活力，其中pgel-mnts-b10/origami2(de3)的活力较高，达到52.9u/ml；而重组菌株pet28a-b10/origami2(de3)和pgel-b10/origami2(de3)的破碎液上清均未检测到草酸氧化酶活力(图2)。实施例4含2～4个拷贝mnts基因表达载体的构建以质粒小提试剂盒提取的pgel-mnts-b10质粒为模版，设计引物对f12/r12进行扩增线性化载体，产物纯化后得到dna片段13；以全基因合成的含mnts基因的dna(如序列表seqidno.10所示)为模板，设计引物对f13/r13扩增完整的dna片段，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段14；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段13和14连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-mnts2-b10(图3)，该载体含有2个mnts的拷贝。本实施例中所用pcr扩增和无缝克隆的体系和方法与实施例1类似，此处不在赘述。上述所用引物序列如下：f12：5’-gatccggctgctaacaaagc-3’r12：5’-ttaagcaacatcagttaagag-3’f13：5’-actgatgttgcttaatccgcgcacgacactgaacat-3’r13：5’-gttagcagccggatcctatttatcggaaggtttatc-3’以质粒小提试剂盒提取的pgel-mnts2-b10质粒为模版，设计引物对f12/r14进行扩增线性化载体，产物纯化后得到dna片段15；以全基因合成的含mnts基因的dna(如序列表seqidno.10所示)为模板，设计引物对f15/r13扩增完整的dna片段，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段16；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段15和16连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-mnts3-b10(图4)，该载体含有3个mnts的拷贝。上述所用引物序列如下：r14：5’-ctatttatcggaaggtttatc-3’f15：5’-ccttccgataaatagtccgcgcacgacactgaacat-3’以质粒小提试剂盒提取的pgel-mnts3-b10质粒为模版，设计引物对f16/r16进行扩增线性化载体，产物纯化后得到dna片段17；以全基因合成的含mnts基因的dna(如序列表seqidno.10所示)为模板，设计引物对f17/r17扩增完整的dna片段，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段18；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段17和18连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-mnts4-b10(图5)，该载体含有4个mnts的拷贝。上述所用引物序列如下：f16：5’-tcatgcaggcataacgcgt-3’r16：5’-caggagtgaagcggcgtac-3’f17：5’-gccgcttcactcctgtccgcgcacgacactgaac-3’r17：5’-gttatgcctgcatgaggaaggaaatgatgacctcg-3’实施例5表达载体中不同拷贝的mnts对b10基因表达的影响按照质粒小提试剂盒方法提取获得的pgel-mnts-b10、pgel-mnts2-b10、pgel-mnts3-b10和pgel-mnts4-b10质粒dna，分别转化origami2(de3)菌株，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株pgel-mnts-b10/origami2(de3)，pgel-mnts2-b10/origami2(de3)，pgel-mnts3-b10/origami2(de3)和pgel-mnts4-b10/origami2(de3)，采用与实施例3中相同的培养基和表达条件进行表达，然后进行酶活力测定，结果如图6所示。单个重组质粒中2个mnts的重组菌株pgel-mnts2-b10/origami2(de3)的破碎液上清的酶活力最高，达到64.7u/ml，单个重组质粒含1个mnts拷贝的测试结果次之，单个重组质粒含3个和4个拷贝的表达效果较差。实施例6分子伴侣基因前不同的启动子对草酸氧化酶表达的影响以质粒小提试剂盒提取的pgel-mnts2-b10质粒为模版，设计引物对f18/r18进行扩增线性化载体，产物纯化后得到dna片段19；以大肠杆菌分子伴侣质粒pgro7为模板，设计引物对f19/r19扩增arabad启动子片段(序列如seqidno.4所示)，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段20；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段19和20连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pagel-mnts2-b10。上述所用引物序列如下：f18：5’-atgaatattcgtccattgcatg-3’r18：5’-ctcgagttgagatcctttttttc-3’f19：5’-ggatctcaactcgagaagaaaccaattgtccatat-3’r19：5’-tggacgaatattcatatggagaaacagtagagagt-3’采用上述类似的方法，将pgel-mnts2-b10质粒载体上分子伴侣基因前的p43启动子(如序列表seqidno.2所示)分别替换为m1-93启动子(如序列表seqidno.3所示)、lac启动子(如序列表seqidno.5所示)和t7启动子(如序列表seqidno.6所示)，得到对应的重组质粒pmgel-mnts2-b10，plgel-mnts2-b10和ptgel-mnts2-b10。按照质粒小提试剂盒方法提取pgel-mnts2-b10、pagel-mnts2-b10、pmgel-mnts2-b10、plgel-mnts2-b10和ptgel-mnts2-b10的质粒dna，分别转化origami2(de3)菌株，涂布到含有50μg/ml卡拉霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株pgel-mnts2-b10/origami2(de3)、pagel-mnts2-b10/origami2(de3)，pmgel-mnts2-b10/origami2(de3)，plgel-mnts2-b10/origami2(de3)和ptgel-mnts2-b10/origami2(de3)。上述重组菌株均采用与实施例3中相同的培养基和表达条件进行表达，pagel-mnts2-b10/origami2(de3)菌株在诱导时需要向培养基中额外补加终浓度为0.5g/l的阿拉伯糖，诱导分子伴侣的表达，进行酶活力测定，结果如图7所示。分子伴侣基因簇前的启动子的强弱会直接影响分子伴侣基因的表达，从而影响草酸氧化酶的可溶性和活性。由图7的结果可以看出，来自枯草芽孢杆菌的组成型启动子p43(seqidno.2)置于groes-groel基因簇前对草酸氧化酶b10的表达是最有利，组成型启动子m1-93启动子(seqidno.3)次之，而诱导型的启动子如阿拉伯糖诱导的arabad启动子(seqidno.4)和iptg或乳糖诱导的lac启动子(seqidno.5)和t7启动子(seqidno.6)较差。实施例7重组菌株pgel-mnts-b10/origami2(de3)摇瓶表达条件优化为了提高草酸氧化酶的表达量和活力，对重组菌株pgel-mnts-b10/origami2(de3)的摇瓶发酵条件进行优化。表达培养基选用lb培养基(酵母提取物0.5％(w/v)，蛋白胨1％(w/v)，氯化钠1％(w/v))，sob培养基(胰蛋白胨2％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，nacl10mm，kcl2.5mm，mgcl210mm，mgso410mm)，soc培养基(胰蛋白胨2％，酵母提取物0.5％(w/v)，nacl10mm，kcl2.5mm，mgcl210mm，mgso410mm，葡萄糖20mm)，2*yt培养基(胰蛋白胨1.6％(w/v)，酵母提取物1％(w/v)，nacl0.5％)，tb培养基(胰蛋白胨2％(w/v)，酵母提取物2.4％(w/v)，k2hpo472mm，kh2po417mm，甘油0.4％(w/v))和jl培养基(酵母提取物0.5％(w/v)，胰蛋白胨1.0％(w/v)，kh2po410mm，(nh4)2so420mm，甘露醇1.2％(w/v)，丁二酸钠10mm，mgso40.15mm)。对上述培养基进行表达测试，表达条件与实施例3相同，然后进行草酸氧化酶活力测定，结果发现，上述6种培养基中，重组菌株pgel-mnts-b10/origami2(de3)在jl培养基中的表达效果最好(图8)，tb培养基次之。为了进一步提高重组菌株pgel-mnts-b10/origami2(de3)的草酸氧化酶的表达活力，上述jl培养基的基础上对培养基和培养条件进行进一步的优化。优化jl培养基中各成分的含量：酵母提取物浓度设置为0.5％、0.75％、1％、1.5％；胰蛋白胨浓度设置为1％、1.5％、2％、2.5％；kh2po4浓度设置为10mm、15mm、20mm、25mm；(nh4)2so4浓度设置为10mm、25mm、40mm、50mm；甘露醇1％、1.5％、2％和3％，丁二酸钠5mm、10mm、20mm、30mm，mgso40.1mm、0.2mm、0.4mm、0.6mm；起始ph6.0、6.5、7.0和7.5，培养至od600达到1.0-1.2开始诱导，并补加iptg0.5mm和终浓度为1mm、2.5mm、5mm、10mm的mncl2或mnso4。单因素优化得到的jl培养基优化组合是：酵母提取物0.75％(w/v)，胰蛋白胨1.5％(w/v)，kh2po415mm，(nh4)2so425mm，甘露醇2％(w/v)，丁二酸钠20mm，mgso40.25mm，起始ph6.5，iptg0.5mm，补加mn2+浓度为5mm。重组菌株pgel-mnts-b10/origami2(de3)在上述优化的jl培养条件下，细胞破碎液上清的草酸氧化酶活力超过80u/ml，比优化前的jl培养基的培养条件提高30％以上。通过正交设计，均匀设计，doe设计等统计优化的方法，还能将上述培养条件进行进一步的优化，得到更优化的培养条件的组合。实施例8重组表达的b10的纯化重组表达的b10的纯化包括以下实验步骤：s1.称取10g重组菌株pgel-mnts-b10/origami2(de3)草酸降解酶诱导表达后的湿菌体，加入200ml溶液(含25mm或50mmtris-hcl(ph8.0)和500mm尿素)，充分振荡悬浮菌体，再加入1-2.5mmmncl2、20-50u/ml核酸酶、1-2.5mmmgcl2，充分混匀后转入250ml离心杯，超声裂解(15mm变幅杆、功率50％、总时间20-30min)。s2.4℃、14000-16000g离心10-15min，分别收集沉淀和收集上清，将带沉淀的离心管倒扣于吸水纸上，待管内残余液体全部吸干后，称取重量，算出湿沉淀的重量。s3.取一支干净的50ml离心管，称取空管的重量，并做好记录；用40ml50mmtris-hcl(ph8.0)、500mm尿素充分悬浮步骤s2所得的沉淀，将悬浊液转入50ml离心管，用玻璃棒碾碎块状沉淀，置于旋转培养仪上转动10min，4℃、14000-16000g离心10-15min，去上清。s4.将步骤s3所得湿沉淀按每g加入1.5ml缓冲液(含有10mm硼酸盐(ph8.0-9.0)和10-20％异丙醇)，充分悬浮沉淀，用玻璃棒碾碎块状沉淀，置于旋转培养仪上转动30min。4℃、16000g离心15-20min，用移液枪轻轻地将上清转移至另一容器中，编号贴标签，置于4℃冰箱保存。s5.将步骤s2和步骤s4离心得到的上清溶液中，冰水浴中缓慢加入20％(w/v)的硫酸铵，4℃静止0.5-2h，在4℃下、12000g离心10分钟收集沉淀，沉淀用缓冲液(包含10mm硼酸盐(ph8.0-9.0)、5-20％(v/v)异丙醇和0-40％的甘油(v/v))溶解，置于4-8℃冰箱保存。对上述来源于细胞破碎液上清和细胞破碎液沉淀的纯化样品进行酶活力测定、蛋白浓度测定和sds-page分析(图9)。结果显示，细胞破碎液上清和细胞破碎液沉淀的纯化样品均有草酸氧化酶活性，细胞破碎液上清的样品的酶活性比细胞破碎液沉淀的纯化样品高，细胞破碎液上清初步纯化的草酸氧化酶的比活力大于20u/mg，单体分子量大小在25kda左右(图9)。本发明用摇瓶发酵制备的草酸氧化酶的成本经过初步测算比包涵体稀释复性纯化工艺低50倍以上，而且容易工业化放大，大规模发酵罐培养综合成本更具优势。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。序列表<110>武汉康复得生物科技股份有限公司<120>生产草酸氧化酶的大肠杆菌表达系统、草酸氧化酶的生产方法及其应用<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>653<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgtctgatcctggtctcctacaggatttttgtgtgggtgtaaatgaccctgattcagca60gtgtttgtaaatggaaaattctgcaagaacccaaaagacgtgacaatcgacgatttctta120tacaaagggtttaatattccctcagacacaaacaacactcaaagagcagaagccacacta180gtagatgtcaatcgatttccagcacttaacacattaggtgtagccatggctcgtgtagac240tttgcgtcctttggcctaaacacacctcatttgcaccctcgtggttctgagatattcgcg300gtgctagaggggactttatatgccggcattgtcaccaccgattacaagcttttcgacacg360gtgttgagaaagggtgacatgattgttttccctcaaggcttaatccacttccagcttaat420cttggcaagacagatgctcttgctattgcctcttttgggagccaatttcctggacgagtt480aatgttgctaatggtgtctttggaactacgccacaaattttggatgatgtacttacccaa540gcgtttcaggtagatgagatggtgattcagcaacttcgatctcagttttcaggtcaaaac600atatcaatcaacactggaagatctattcttaaactcttaactgatgttgctta653<210>2<211>331<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgataggtggtatgttttcgcttgaacttttaaatacagccattgaacatacggttgatt60taataactgacaaacatcaccctcttgctaaagcggccaaggacgctgccgccggggctg120tttgcgtttttgccgtgatttcgtgtatcattggtttacttatttttttgccaaagctgt180aatggctgaaaattcttacatttattttacatttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgc240gcgattatgtaaaatataaagtgatagcggtaccaggagggctggaagaagcagaccgct300aacacagtacataaaaaaggagacatgaacg331<210>3<211>91<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ttatctctggcggtgttgacaagagataacaacgttgatataattgagcccgtattgtta60gcatgtacgtttaaaccaggaaacagctcat91<210>4<211>285<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctct60tctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggacca120aagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattg180attatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcgg240atcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccat285<210>5<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tttacactttatgcttccggctcgtatgttg31<210>6<211>87<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6taatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattt60tgtttaactttaagaaggagatatacc87<210>7<211>1368<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7atgacgaactatcgcgttgagagtagcagcggacgggcggcgcgcaagatgaggctcgca60ttaatgggacctgcgttcattgcggcgattggttatatcgatcccggtaactttgcgacc120aatattcaggcgggtgctagcttcggctatcagctactgtgggttgtcgtttgggccaac180ctgatggcgatgctgattcagatcctctctgccaaactagggattgccaccggtaaaaat240ctggcggagcagattcgcgatcactatccgcgtcccgtagtgtggttctattgggttcag300gcagaaattattgcgatggcaaccgacctggcggaatttattggtgcggcgatcggtttt360aaactcattcttggtgtttcgttgttgcagggcgcggtgctgacggggatcgcgactttc420ctgattttaatgctgcaacgtcgcgggcaaaaaccgctggagaaagtgattggcgggtta480ctgttgtttgttgccgcggcttacattgtcgagttgattttctcccagcctaacctggcg540cagctgggtaaaggaatggtgatcccgagtttacctacttcggaagcggtcttcctggca600gcaggcgtgttaggggcgacgattatgccgcatgtgatttatttgcactcctcgctcact660cagcatttacatggcggttcgcgtcaacaacgttattccgccaccaaatgggatgtggct720atcgccatgactattgccggttttgtcaatctggcgatgatggctacagctgcggcggcg780ttccacttttccggtcatactggtgttgccgatcttgatgaggcttatctgacgctgcaa840ccgctgttaagccacgctgcggcaacggtctttggattaagcctggttgctgcggggctg900tcttcaacggtggtggggacactggcggggcaggtggtgatgcagggcttcattcgcttt960catatcccgctgtgggtgcgtcgtacagtcaccatgttgccgtcatttattgtcattctg1020atgggattagatccgacacggattctggttatgagtcaggtactgttaagttttggtatc1080gctctggcgctggttccactgctgattttcaccagtgacagcaagttgatgggcgatctg1140gtgaacagcaaacgcgtaaaacagacaggctgggtgattgtggtgctggtcgtggcgctg1200aatatctggttgttggtggggacggcgctgggattgtagttgaatgagcgtcgcatct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