生物碱类化合物及其制备方法和用途与流程

本发明属于微生物分子生物学与天然产物化学领域，具体涉及从一种海洋微生物中提取的生物碱类化合物及其制备方法和用途。

背景技术

bacillamides家族化合物是杀藻效果强的天然杀藻剂，对多环旋沟藻和针胞藻(raphidophytes)有抑制作用。bacillamides家族属于非核糖体肽类化合物，该家族带有噻唑环结构，目前发现有bacillamidea、b、c、d、e五个成员，结构如下所示：

bacillamide及其衍生物5-flouro-bacillamide和5-iodo-bacillamide能抑制有害甲藻cochlodiniumpolykrikoides，有毒蓝藻nodulariaspumigena，microcystisaeruginosa，aphanizomenongracile，anabaenacircinalis，anabaenopsiscircularis等多种藻的生长，bacillamide类似物—噻唑类化合物具有优良的杀藻活性，是很有价值的杀藻剂先导化合物，因而该家族作为抑藻剂有很高的研究价值和应用价值。此外，bacillamides家族的吲哚噻唑环结构常出现在具有生物活性的环肽中，具有重要的开发价值，例如bacillamide类似物对人结肠癌细胞株hct-116、乳腺癌mda-mb-231细胞等具有细胞毒活性。因此bacillamide衍生物的提取和研究非常有必要。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种生物碱类化合物及其制备方法和用途。该化合物是从培养的海洋微生物b.atrephaeusc89中提取和制备的一种新化合物bacillmidef，该化合物及其衍生物具有抗有害藻的生物活性，因此该化合物有潜在的制备相关药物制剂的应用价值。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种生物碱类化合物，包括结构如式i所示的化合物及其衍生物；

其分子式为c20h22n4o2s，分子量382。

本发明还提供了一种生物碱类化合物的制备方法，包括以下步骤：将海洋萎缩芽孢杆菌bacillusatrophaeusc89经平板培养、种子培养和摇瓶发酵，分离纯化后制备即得所述生物碱类化合物。

优选地，所述平板培养和种子培养采用的培养基包括以下浓度的各组分：酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl10g/l，以人工海水配置。

优选地，所述平板培养和种子培养采用的培养基还包括15-20g/l的琼脂。

平板培养和种子培养采用前述各组分的培养基，才可获得本发明的式i化合物。

优选地，所述摇瓶发酵采用的培养基包括以下浓度的各组分：3-4g/l玉米淀粉，5-6g/l蛋白胨，6-7g/l碳酸钙，3-4g/l大豆蛋白胨，0.1-0.2g/l半胱氨酸，0.01-0.02g/l色氨酸，以人工海水配制。

优选地，所述人工海水中包括以下含量的各组分：25-27g/l的nacl、2-3g/l的mgcl2、3-4g/l的mgso4、1-2g/l的cacl2、0.5-1g/l的kcl、0.1-0.3g/l的nahco3以及0.05-0.1g/l的nabr。

优选地，所述人工海水的配置方法为：将nacl、mgcl2、mgso4、cacl2、kcl、nahco3以及nabr溶解于超纯水中，即得；所得人工海水的ph值为7.0-7.2。

优选地，所述平板培养和种子培养的条件均为：28℃下培养12-16h，采用该温度进行平板培养和种子培养，才可获得本发明的式i化合物；所述摇瓶发酵培养的条件为：28℃、150rpm下培养84-102h。

优选地，所述分离纯化具体采用以下步骤：

将经摇瓶发酵后所得的发酵液采用定性滤纸抽滤的菌液上清，菌液上清经有机溶剂萃取、蒸干后得粗浸膏；

粗浸膏溶于甲醇后过滤、浓缩，然后采用凝胶过滤层析、薄层层析、反相中压制备色谱、半制备高压液相色谱进行纯化，即可。

优选地，所述定性滤纸的孔径为15-20μm；有机溶剂为乙酸乙酯。

优选地，所述甲醇体积为1/10菌液体积；所述过滤采用滤膜为0.22μm滤膜。

优选地，所述凝胶过滤层析步骤为：采用玻璃棒引流法将甲醇加入凝胶柱中，旋上上端柱帽，下端柱帽的细管接收集器，开始平衡洗脱。打开上柱帽，用胶头滴管沿凝胶柱壁缓慢加入待测液，打开下端柱帽洗脱，待样品流至柱底端时用干净已标号的试管收集流出液。

优选地，所述薄层层析(tlc)检测后合并相同组份，采用的展开剂为二氯甲烷：甲醇＝15:1(v/v)。

优选地，所述反相中压制备色谱对样品进行检测分析，采用玻璃上样柱stx26-100(26×100mm)，流动相为甲醇：水(10:90-100:0)梯度洗脱。

优选地，所述半制备型的高效液相色谱仪纯化样品时，采用的色谱柱为zorbaxeclipsexdb-c18(4.6×250mm，5μm),流动相为乙腈：水(25：75)梯度洗脱，紫外检测波长为220nm，柱温25℃，流速1ml/min，检测时间为0-60min。

本发明还提供了一种生物碱类化合物在制备杀藻剂中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明首次获得了一种新化合物bacillmidef，该新化合物的类似物具有抗有害藻的生物活性，因此该新化合物有潜在的制备相关药物制剂的应用价值。

2、本发明通过采用特定平板培养基和种子培养基，并将半胱氨酸和色氨酸溶解于人工海水中配成混合氨基酸溶液并采用滤膜过滤，在发酵培养过程中添加过滤后的混合氨基酸溶液，实现了萎缩芽孢杆菌bacillamidef的产生。

3、本发明提取方法工艺简单，成本低、试剂耗费量小，得到的单体化合物纯度高，稳定性好。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的生物碱类化合物的制备流程图；

图2为实施例中bacillamidef的高效液相色谱分析峰图；

图3为实施例中所得bacillamidef半制备型的高效液相色谱峰图；

图4为实施例中所得bacillamidef的一级、二级质谱图；

图5为实施例中所得bacillamidef的h谱；

图6为实施例中所得bacillamidef的c谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供了一种生物碱类化合物的制备方法，具体包括以下步骤：

1、平板培养：培养基为：酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl10g/l，15-20g/l的琼脂，人工海水配制。取-70℃保藏的海洋萎缩芽孢杆菌bacillusatrophaeusc89，在平板培养基上划线，28℃培养12-16h。

2、种子培养：培养基为：酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl10g/l，人工海水配制。待平板培养基上长出单菌落，取单菌落在5ml种子培养基中，并于28℃、150rpm下培养12-16h。

3、发酵：培养基为：3-4g/l玉米淀粉，5-6g/l蛋白胨，6-7g/l碳酸钙，3-4g/l大豆蛋白胨，以人工海水配制。取种子液1％(v/v)接种到100ml发酵培养基中，并于28℃、150rpm下培养84-102h。通过将半胱氨酸和色氨酸溶解于人工海水中配成混合氨基酸溶液并采用0.22μm滤膜过滤，在发酵培养过程中添加过滤后的混合氨基酸溶液，实现萎缩芽孢杆菌bacillamidef的产生。所述的混合氨基酸溶液中含有0.1-0.2g/l半胱氨酸，0.01-0.02g/l色氨酸。

所述人工海水的配置为：25-27g/l的nacl、2-3g/l的mgcl2、3-4g/l的mgso4、1-2g/l的cacl2、0.5-1g/l的kcl、0.1-0.3g/l的nahco3以及0.05-0.1g/l的nabr,溶剂为millpore超纯水，该人工海水的ph7.0-7.2。

所述平板培养基和种子培养基的配置方法为：将培养基的各组分加入人工海水中，高温灭菌制得。

所述发酵培养基的配置方法为：在人工海水中加入玉米淀粉加热煮沸糊化，然后依次加入胰蛋白胨、大豆蛋白胨和碳酸钙并搅拌溶解，然后高温灭菌得到发酵培养基。所述的搅拌溶解过程中不断补充纯水补足玉米淀粉煮沸过程中失去的水分。

所述的高温灭菌是指121℃环境下灭菌20分钟。

实施例2

将实施例1发酵后得到的发酵液进行分离纯化，具体步骤如下：

用15-20μm的定性滤纸抽滤得菌液上清，菌液上清用同体积的乙酸乙酯萃取三次，蒸干后的浸膏即为粗浸膏，粗浸膏溶于1/10菌液体积的甲醇，0.22μm滤膜过滤得待测液，用旋蒸仪浓缩待测液的浓度，并用0.22μm滤膜过滤，将所得液体进行凝胶过滤层析，收集流出液并对其进行标号。

采用薄层层析(thinlayerchromatography,tlc)和hplc两种方法对收集的流出液进行分析。tlc对流出液进行粗分析，具体步骤为：选择二氯甲烷：甲醇＝15:1的体系作为展开剂，将展开剂倒入展开池中，用吹风机吹干薄板，将薄板放在紫外灯下，用铅笔标出波长为253nm处的点,并用香草酚对样品进行显色，带有将显色情况相同的样品合并，结合hplc检测方法确定含bacillamidef的合并样试管样品中含有bacillamidef。hplc检测特征为色谱柱为zorbaxeclipsexdb-c18(4.6×150mm，5μm),流动相为乙腈：水(20：80—45：55)梯度洗脱，紫外检测波长为220nm，柱温25℃，流速1ml/min，检测时间为0-15min，进样量为20μl。结果显示bacillamidef的出峰时间为13.064min(图2)。

用反相中压制备色谱对含有bacillamidef的溶液进行再次纯化。仪器：agilenttechnologiesflashpurificationsystem；stx26-100玻璃上样柱(柱内径26mm，长度100mm)，检测条件：流动相为甲醇：水(10:90-100:0)梯度洗脱。

用半制备型的高效液相色谱仪对样品进一步纯化，最终得到bacillamidef的纯品。色谱条件：色谱柱为zorbaxeclipsexdb-c18(4.6×250mm，5μm),流动相为乙腈：水(25：75)梯度洗脱，紫外检测波长为220nm，柱温25℃，流速1ml/min，检测时间为0-60min，进样量为15μl。bacillamidef的出峰时间为49.735min(图3)。收集bacillamidef峰，用0.22μm滤膜过滤，吹风机吹干得到bacillamidef的纯品。产率为13.36％。

所得化合物结构如式i所示，

该化合物的一级、二级质谱图如图4所示，h谱和c谱如图5所示。其分子式为c20h22n4o2s，分子量382。

bacillamidef的性质：白色固体，易溶于甲醇，乙醇等有机物，微溶于氯仿，溶于有机溶液后呈橘黄色，极性较大。

对比例1

本对比例提供了一种生物碱类化合物的制备方法，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于：本对比例中，采用的发酵培养基中不添加半胱氨酸。

采用该对比例方法获得的发酵液经实施例2的分离纯化，获得所述的式i化合物，产率为11.23％。

对比例2

本对比例提供了一种生物碱类化合物的制备方法，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于：本对比例中，采用的发酵培养基中不添加色氨酸。

采用该对比例方法获得的发酵液经实施例2的分离纯化，获得所述的式i化合物，产率为12.31％。

对比例3

本对比例提供了一种生物碱类化合物的制备方法，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于：本对比例中，采用的发酵培养基中将色氨酸替换为丝氨酸。

采用该对比例方法获得的发酵液经实施例2的分离纯化，获得所述的式i化合物，产率为8.92％。

效果验证：

本发明实施例获得的新化合物bacillmidef具有抗有害藻的生物活性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。