1,3-茚满二酮类化合物山芝麻碱及其药物用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，涉及一种从药用植物山芝麻中分离得到的1，3-茚满二酮 类新化合物山芝麻碱及其在制备抗乙肝病毒药物和抗炎药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 山芝麻为梧桐科植物山芝麻（HelicteresangustifoliaL.)的干燥根或全株，味 苦、性寒，归肺、大肠经，可解表清热、解毒消肿，用于治疗感冒发热、痄腮、乳娥、麻疹、咳嗽、 泄泻痢疾、痈肿。山芝麻作为民间用药已有悠久的历史，有大量关于山芝麻抗乙肝病毒及治 疗多种炎症的文献报道，且大量的临床试验证明其疗效确切，因此国内许多学者对其抗乙 肝病毒及抗炎效果展开了大量研究，但多停留于粗提物上，到目前为止，其抗乙肝病毒及抗 炎药效物质基础和作用机制尚未明确。而山芝麻在我国资源非常丰富，本申请的发明人拟 对其进行深入研究，确定其抗乙肝病毒和抗炎作用物质，阐明其作用机理，并在此基础上开 发出抗乙肝病毒和抗炎药物，不仅可以充分利用山芝麻资源，还可以减少感染乙肝病毒患 者和炎症病人的痛苦，创造出较大的经济效益和社会效益。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种从山芝麻中分离得到的1，3-茚满二酮类新化合物山芝 麻喊（helicterine, 1) 〇
[0004] 本发明的进一步目的还在于提供上述化合物作为制备抗乙肝病毒药物中的用途。
[0005] 本发明的进一步目的还在于提供上述化合物作为制备抗炎药物中的用途。
[0006] 本发明从山芝麻属植物山芝麻（H.angustifolia)干燥根的乙醇提取物乙酸乙酯 萃取部位中分离得到1个1，3_茚满二酮类生物碱（由无法分离的E和Z两种构型以1:1 比例组成），并应用现代药理研究方法，对分离得到的化合物进行了抗乙肝病毒和抗炎活 性评价，结果证实其具有较强的体外抗乙肝病毒活性和对内毒素（LPS)以及聚肌胞苷酸 [poly(I:C)]诱导的巨噬细胞系RAW264. 7生成一氧化氮（N0)均有较强的抑制作用，所述的 化合物可用于制备抗乙肝病毒药物和制备抗炎药物。
[0007] 本发明所述的1，3-茚满二酮类化合物具有以下化学结构：
[0008]
[0009] 本发明所述的化合物通过下述方法制备：
[0010] 取山芝麻干燥根25kg，粉碎，用95 %乙醇回流提取3次（50LX3)，每次2h，合 并提取液并浓缩得浸膏〇.95kg，加水（4L)混悬，分别以等体积石油醚、乙酸乙酯和正 丁醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物200g。将乙酸乙酯萃取部 位经硅胶（200-300目）柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脱， 得到11个流份（Fr. 1-11)，其中流份Fr.3(32g)再经硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇， 30: 1，20: 1，10: 1，5: 1，3: 1，1:1)、MPLC(甲醇-水，20:80-80:20 梯度洗脱）和s印hadex LH-20柱色谱等方法纯化，分离得到化合物山芝麻碱（helicterine, 1，由无法分离的E和Z 两种构型以1:1比例组成）。
【附图说明】
[0011] 图1是山芝麻根中山芝麻碱的提取分离流程图。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1制备山芝麻碱
[0013] 取山芝麻干燥根25kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次（50LX3)，每次2h，合并提 取液并浓缩得浸膏〇.95kg，加水（4L)混悬，分别以等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取5 次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物200g。将乙酸乙酯萃取部位经硅胶（200-300 目）柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脱，得到11个流份（Fr. 1-11)， 其中流份Fr. 3 (32g)再经硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇，30:1,20:1, 10:1,5:1,3:1，1:1)、 MPLC(甲醇-水，20:80-80:20梯度洗脱）和s印hadexLH-20柱色谱等手段纯化，分离得到 由E和Z两种构型以1:1比例组成的山芝麻碱（helicterine, 1)组成；
[0014] 化合物1为黄色块状结晶（氯仿-甲醇）；m.P. 205-208°C;Μ酽+71.4 (￡· 0.35, MeOH);分子式：C14H16N03;ES頂S:245;UV(Me0H):Xnax(l〇ge):239.5(3.41)，301.4( 3. 27)nm；IR(KBr) υ nax(cm :3318, 2955, 2920, 2356, 1694, 1635, 1558, 1419, 1308； !11?5頂5(口〇8行"6)111/2246.1129[]\1+!1] + ((：14!116勵3，。&1。(1.246.1125) ;其中2构型（1&)的 NMR数据为"H-NMR^OOMHz，DMS0-d6)δΗ:8· 89 (2H，dd，J=15. 7, 10. 6Hz，12-NH2)，7. 62( 1H，m，H-12)，7. 43 (1H，d，J = 7. 9Hz，H-6)，7. 32 (1H，d，J = 7. 9Hz，H-5)，4. 27 (1H，m，H-10) ，3. 59 (1H,m,H-lla)，3. 47 (1H,overlapped,H-llb)，2. 56 (3H,s, 4-0CH3)，1. 16 (3H,d,J= 7. 0Hz, 10-0CH3) ;13C-NMR(150MHz，DMS0-d6)δc:194.l(C-l), 191. 6(C-3), 151. 1(C-12), 14 1. 9 (C-7)，136. 1 (C-9)，136. 0 (C-5)，135. 6 (C-8)，133. 4 (C-4)，132. 0 (C-6)，104. 9 (C-2)，6 6.3(C-11)，34.8(C-10)，18.0(10-0CH3)，17.8(4-0CH3);所含E构型（lb)的NMR数据为： iH-NMR^OOMHz.DMSO-df；)SH:8.89(2H，dd，J= 15.7，10.6Hz，12-NH2)，7.62(lH，m，H-12)，7 ?43(lH，d，J= 7.9Hz，H-6)，7.32(lH，d，J= 7.9Hz，H-5)，4.23(lH，m，H-10)，3.59(lH，m，H-1la)，3. 47 (1H，overlapped,H-llb)，2. 58 (3H，s，4-0CH3)，1. 17 (3H，d，J= 7. 0Hz，10-0CH3); 13C-NMR(150MHz，DMS0-d6)δc: 193.9 (C-3)，191.4 (C-l)，151.0 (C-12), 141. 6 (C-7)，136.5(C -8),136. 0 (C-5),136. 0 (C-9),133. 7 (C-4) ,131.9 (C-6),104. 9 (C-2),66. 3 (C-ll),34. 9 (C-10)，18. 0 (10-0CH3)，17. 7 (4-0CH3)〇
[0015] 实施例2体外抗乙肝病毒（HBV)实验
[0016]应用ifepG2的2. 2. 15细胞株（教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室， 上海），以每孔10X1〇5个细胞接种于24孔板，培养基为DMEM，生长液含10 %胎牛血清， 38〇μ8/πι1G418,0.03%谷胺酰胺，青霉素、链霉素各lOOyg/ml，在5%C02孵箱中37°C培 养，48小时后，换成用二甲基亚砜助溶的含药培养液，每种药物设3~5个浓度，每个浓度设 4个平行孔，继续培养9天（每3天换液一次），收集上清液用ELISA检测HBsAg及HBeAg 含量。同样条件下以不含药物的培养液上清液作为对照组。同时用上述细胞株，用MTT法 测定药物的细胞毒性。阳性对照为拉米呋啶。结果证实本发明所述化合物山芝麻碱具有显 著的抗HBV活性，且有效浓度低，细胞毒性较小，对HBsAg的IC5。值为58. 3μg/ml，显著高 于阳性对照拉米呋啶（3TC)，对HBeAg有一定程度的抑制作用，在浓度为100μg/ml时抑制 率为27. 7% (表1)。
[0017] 表1.山芝麻碱对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用
[0018]
[0019] /:当细胞毒性> 25%时不进行抑制率测试
[0020] 实施例3体外抑制巨噬细胞（RAW264. 7)N0生成试验
[0021] 取小鼠巨噬细胞细胞系（RAW264. 7)细胞，以1.OX106/ml浓度接种在96孔板中， 在 37°C下培养 2h。然后将供试品（1、2.5、5、10 和 20μΜ)与LPS(lng/ml)或poly(I:C) (lyg/ml) -同加入到细胞培养液中，共同在37°C下培养24h，将细胞培养液迅速在冰 中冷却。取细胞培养液的上清液按每孔50μ1置于新的96孔板中，在每孔中加入50μ1 Griess试剂（25μ11 %对氨基苯磺酰胺2. 5%磷酸溶液和25μ10. 1 %萘乙二胺2. 5%磷酸 溶液）。室温下放置lOmin后，用酶标仪在570nm测定反应产物的吸光度（Α)值。在同 一块96孔板中，要同时加入NaN02的标准溶液用以绘制计算N02浓度的标准曲线，以未 加LPS或p〇ly(I:C)和样品的细胞培养液作为空白，以未加样品的细胞培养液为阴性对 照，以地塞米松为阳性对照。用MTT法测定细胞毒作用。结果表明，本发明所述化合物对 1^5和？〇17(1 :〇诱导的巨噬细胞勵生成均有较强的抑制作用，其1(：5。值分别为15.96和 8. 96μM，以地塞米松（DEX)为阳性对照，结果表明山芝麻碱具有抗炎活性（如表2所示）。
[0022] 表2.山芝麻碱对巨噬细胞Ν0生成的抑制作用
[0023]
[0024] 本发明中实验采用的试剂均为本领域公知技术，可市购。
【主权项】
1. 一种1，3-茚满二酮类化合物山芝麻碱（helicterine)，其具有以下化学结构：2. 按权利要求1所述的1，3-讳满二酮类化合物山芝麻碱（helicterine)，其特征在 于，通过下述方法制备： 取山芝麻干燥根，粉碎，用95 %乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液并浓缩得浸 膏，加水混悬，分别以等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并萃取液并浓缩至干，得乙 酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶200-300目柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲 醇50:1-0:1梯度洗脱，得到11个流份Fr. 1-11，其中流份Fr. 3再经硅胶柱色谱（二氯甲 烷-甲醇，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，1:1)、MPLC(甲醇-水，20:80-80:20 梯度洗脱）和 sephadex LH-20柱色谱方法纯化，分离得到化合物山芝麻碱，该山芝麻碱由无法分离的E 和Z两种构型以1:1比例组成。3. 权利要求1所述的化合物在制备抗乙肝病毒药物中的用途。4. 权利要求1所述的化合物在制备抗炎药物中的用途。
【专利摘要】本发明属于医药领域，涉及一种1,3-茚满二酮类新化合物及其在制备抗乙肝病毒和抗炎药物中的用途。本发明从山芝麻属植物山芝麻(Helicteres.angustifolia)干燥根中分离得到1个由E和Z两种构型以1:1比例组成的1,3-茚满二酮类生物碱山芝麻碱(helicterine)，并采用现代药理研究方法证实其具有较强的抗乙肝病毒活性，对HBsAg的IC50值为58.3μg/ml，显著高于阳性对照拉米呋啶，对HBeAg有一定程度的抑制作用；另外，体外抑制一氧化氮生成试验结果表明其对内毒素(LPS)和聚肌胞苷酸[poly(I:C)]诱导的巨噬细胞一氧化氮生成均有很强的抑制作用，IC50值分别为15.96和8.96μM。所述的山芝麻碱可用于制备抗乙肝病毒和抗炎药物。
【IPC分类】A61P29/00, A61P31/20, C07C225/18, C07C221/00
【公开号】CN105439878
【申请号】CN201410505723
【发明人】陈道峰, 殷翔, 凌丽君, 史训龙, 朱海燕, 卢燕
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年9月28日