专利名称：红毛新碱b化合物及其用于制备抗心肌缺血药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及红毛七总生物碱中一种全新结构的化合物，命名为红毛新碱B，并对该化合物进行了药理作用的研究，证明其能够用于制备抗心肌缺血药物的用途。
背景技术：
红毛七(Radix caulophylli)为小檗科植物类叶牡丹(Leontice robustum(Maxim.)Diels.)的干燥根及根茎，是陕西秦巴山区特有的天然药用植物。已有的研究表明红毛七中主要成分包括木兰花碱、塔斯品碱、N-甲基金雀花碱等生物碱及葳严苮皂苷等物质。红毛七的提取物具有降压、兴奋子宫平滑肌、抗菌消炎、抗病毒、抗风湿、抗痉挛等多种药理作用。在我国红毛七为非药典收载的药用植物，只在民间有使用，有关药用成分和药理作用的系统研究和报道较少。申请人用细胞膜色谱筛选技术对红毛七的活性作用进行了系统研究，发现红毛七总生物碱中多种有效成分具有不同的药理活性，并首次发现了其中的一种全新化学结构的生物碱命名为红毛新碱B，经离体和整体药理实验验证，发现红毛新碱B具有抗心肌缺血的药理活性。
在本研究之前，对红毛新碱B的结构、药理作用以及抗心肌缺血用途未见有任何文献资料报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种从红毛七中提取的红毛新碱B化合物，并对该红毛新碱B的结构进行分析，证明该化合物能够提高心肌收缩力，是一种潜在的用于临床的抗心肌缺血用途的药物，为红毛七中有效成分的后续研究提供基础资料。
申请人采用元素分析、紫外光谱法、红外光谱法、质谱法、核磁共振波谱法，结合样品理化性质研究，确定红毛七中红毛新碱B化合物的母体结构如下 其中，R1和R2是相同或不同的并代表氢、烷基、环烷基、链烯基、链炔基。
X1和X2是相同或不同的并代表氢、烷基、烷氧基、环烷基、链烯基、链炔基、不饱和的单环烃、羟基、硫羟基、氨基、铵、卤素、羧酸或酯或其硫酯、酮、醛、碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺。
Y1和Y2是相同或不同的并代表氢、烷基、烷氧基、环烷基、链烯基、链炔基、不饱和的单环烃、羟基、硫羟基、氨基、铵、卤素、羧酸或酯或其硫酯、酮、醛、碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺。
R代表氢、烷基、环烷基、链烯基、链炔基。
申请人对上述化合物分别采用离体蛙心灌流试验，大鼠离体腹主动脉环试验以及抗心肌缺血试验，对红毛新碱B进行研究。离体蛙心灌流试验中，以心率和心肌收缩力作为试验指标，观察给药前后心率和心肌收缩力的变化情况；大鼠离体腹主动脉环试验中，分别观察红毛新碱B对去甲肾上腺素、氯化钙、氯化钾所致主动脉条收缩的影响；抗心肌缺血试验中，采用两种心肌缺血试验模型，并与西药阳性对照药硝苯地平片和中药阳性对照药复方丹参滴丸进行了比较，观察红毛新碱B的抗心肌缺血作用，证明红毛新碱B化合物是一种能够用于临床的抗心肌缺血用途的药物。
图1是红毛新碱B对离体蛙心心率的影响直方图(n＝8，x±s)；图2是红毛新碱B对离体蛙心心肌收缩力的影响直方图(n＝8，x±s)；图3是红毛新碱B对NE所致大鼠腹主动脉收缩的影响曲线(n＝6)；其中红毛新碱B浓度M1＝0.029μmol·L，M2＝0.059μmol·L，M3＝0.15μmol·L，Mv＝1μmol·L；图4是红毛新碱B对NE所致大鼠腹主动脉收缩的影响直方图(n＝6)；图5是红毛新碱B对CaCL2所致大鼠腹主动脉收缩的影响曲线(n＝6)，其中红毛新碱B浓度M1＝0.044μmol·L，M2＝0.073μmol·L，M3＝0.18μmol·L，Mv＝1μmol·L；图6是红毛新碱B对CaCL2所致大鼠腹主动脉收缩的影响直方图(n＝6)；图7是红毛新碱B对KCL所致大鼠腹主动脉收缩的影响曲线(n＝6)；其中红毛新碱B浓度M1＝0.012μmol·L，M2＝0.023μmol·L，M3＝0.058μmol·L，Mv＝1μmol·L；图8是是红毛新碱B对KCL所致大鼠腹主动脉收缩的影响直方图(n＝6)。
以下结合附图和制备方法及其药理对本发明作进一步详细说明。
具体实施例方式
1.红毛新碱B的制备1)红毛七总生物碱的分离(1)红毛七总生物碱上柱样品的制备将红毛七总生物碱的浸膏用甲醇或乙醇充分溶解以后，过滤。得到红毛七总生物碱的甲醇或乙醇溶液。将此溶液与柱层析用硅胶拌样，挥干溶剂后，即可用于柱层析分离。
(2)分离柱的准备
取柱层析硅胶，氯仿-甲醇-氨水(3∶1∶0.1)为流动相湿法装柱，平衡柱子(放置过夜)。平衡后的柱子即可用于红毛七总生物碱的分离。
(3)红毛七总生物碱的粗分将上柱样品用准备好的分离柱进行分离。上柱样品与装柱所用的硅胶重量比为1∶20。上好样品后，首先采用氯仿-甲醇-氨水(3∶1∶0.1)为洗脱剂进行洗脱，洗脱过程按照色带收集样品，并分别记为HMQ1(黄色色带)、HMQ2(红棕色色带)、HMQ3(黄色色带)、HMQ4(青色色带)、HMQ5(黄色色带)、HMQ6(红色色带)。上述样品收集完以后，对红毛七总生物碱的甲醇或乙醇溶液改用甲醇为洗脱剂，进行洗脱，得到HMQ7～HMQ9三个部位，按照色带收集样品，分别记为HMQ7(红色色带)、HMQ8(红色色带)、HMQ9(棕色色带)。
(4)红毛七总生物碱各分离部位的筛选经过本中心的心血管细胞膜色谱模型和初步药理学实验进行筛选，结果表明HMQ6和HMQ8为红毛七总生物碱中作用于心血管的有效部位，所以对这两个部位进行进一步分离。
2)红毛新碱B的分离(1)样品的制备将HMQ6和HMQ8的浸膏用甲醇充分溶解以后，过滤。得到红毛七总生物碱中有效部位HMQ6和HMQ8的甲醇溶液。将此溶液与柱层析用硅胶拌样，挥干甲醇后，即可用于柱层析分离。
(2)色谱柱的准备取柱层析硅胶，氯仿-甲醇-氨水(6∶1∶0.05)为流动相湿法装柱，平衡柱子(放置过夜)。平衡后的柱子即可用于红毛七总生物碱中HMQ6的分离。取柱层析硅胶，甲醇为流动相湿法装柱，平衡柱子(放置过夜)。平衡后的柱子即可用于红毛七总生物碱中HMQ8的分离。
(3)HMQ6和HMQ8的分离将上柱样品用准备好的分离柱进行分离。上柱样品与装柱所用的硅胶重量比为1∶50。上好样品后，采用氯仿-甲醇-氨水(6∶1∶0.05)为洗脱剂进行，按照色带收集样品，分别记为HMQ6-1(黄色色带)、HMQ6-2(黄色色带)、HMQ6-3(黄色荧光色带)、HMQ6-4(红色色带即红毛新碱B)、HMQ6-5(橘红色色带)。
(4)HMQ6和HMQ8各分离成分筛选经过本中心的心血管细胞膜色谱模型和初步药理学实验进行筛选，结果表明HMQ6-4即红毛新碱B为红毛七总生物碱HMQ6中作用于心血管的化合物。
(5)红毛新碱B的纯化申请人采用重结晶的方法对红毛新碱B进行纯化，具体操作步骤如下分离得到红毛新碱B的样品，回收洗脱剂并将样品蒸干后，用甲醇加入适量氨水作为溶剂，将样品转移至广口瓶中。将广口瓶于4℃保存，可见到橘黄色沉淀产生。用微型抽滤器抽滤，得到此橘黄色沉淀。
取红毛新碱B的橘黄色沉淀适量，以水-氨水(10∶1)为溶剂，加热溶解。待样品完全溶解后，趁热过滤，得到滤液。将此滤液置于广口瓶中并于4℃保存，可见到橘黄色絮状沉淀。如此反复重结晶即可得到红毛新碱B的纯品。
3.红毛新碱B化合物的结构分析(1)理化性质研究红毛新碱B与硅钨酸试液、磷钼酸试液以及碘化铋钾试液三种生物碱沉淀试剂作用，均表现出明显的生物碱反应。其熔点为256～258℃。
(2)元素分析采用PE-2400元素分析仪对红毛新碱B进行元素分析测定，推断其化学式为C20H24NO6和C20H22NO6。
(3)紫外光谱法红毛新碱B最大吸收峰为(λmax，nm)269，225，360，308，500。
(4)红外光谱法红毛新碱B主要红外吸收峰为(νmax，KBr)3437cm-1(ν-OH)，2918cm-1(ν-CH)，1672cm-1(ν＝CO)，1269cm-1(ν-CN)，1600cm-1，1500cm-1(苯环的特征吸收峰)。
(5)质谱法红毛新碱B的MS(m/z)343，298，285，224，139，115，58(100)。
(6)核磁共振波谱法红毛新碱B的1H-NMRδ4.02(2，10-OCH3)，6.61(3H)，3.45(4H)，3.48(5H)，3.16(N-CH3)，7.62(6a-OH)，7.31(8H)，6.81(9H)。
13C-NMRδ141.12(1C)，157.65(2C)，114.55(3C)，29.72(4C)，61.14(5C)，112.94(6a C)，198.15(7C)，123.04(8C)，114.12(9C)，157.79(10C)，140.95(11C)，129.47(12C)，129.87(13C)，135.00(15C)，126.62(17C)，57.95(2-OCH3)，58.06(10-OCH3)，45.77(N-CH3)。
综合四谱信息，确定红毛新碱B为一种生物碱类化合物，其化学名为1，6a，11-三羟基-2，10-二甲氧基-6，6-甲基-7-氧-5，6，6a，7-四氢-[de，g]-4H-二苯并异喹啉(1，6a，11-trihydroxy-2，10-dimethoxy-6，6-dimethyl-7-oxo-5，6，6a，7-tetrahydro-4H-Dibenzo[de，g]quinolinium)。通过查阅CA，未发现与此结构相同的化合物。结构如下
3.红毛新碱B的药理作用(1)红毛新碱B的离体蛙心灌流实验A、Ringer’s营养液配制精密称取氯化钠6.50g，氯化钾0.14g，碳酸氢钠0.20g，葡萄糖2.00g，二水磷酸二氢钠0.00845g，氯化钙0.12g。将前五种试剂用适量蒸馏水溶解混合，再将事先已用少量蒸馏水溶解的氯化钙缓慢加入，搅拌、混匀，定容至1000mL。用磷酸调pH值为7.4，临用前新鲜配制。
B、供试液制备取盐酸维拉帕米注射液(Vp)一支，加蒸馏水稀释，配制成40μg/mL的溶液，备用。
精密称取红毛新碱B适量，用DMSO溶解并定容至10mL，置于冰箱中备用，临用前加入适量Ringer’s营养液稀释至所需的浓度。
C、实验方法取蟾蜍，用探针破坏脊髓，背位置于蛙板。剪开腹部皮肤，剪除胸部肌肉及胸骨，打开胸腔，剪破心包膜，暴露心脏。结扎右主动脉支，自静脉窦以下把其余血管一起结扎，于左动脉支剪一V字形口，将盛有任氏液的蛙心插管从剪口处插入主动脉，当插管进到动脉球部后，即转向左后方，轻轻推进，在心脏舒张瓣膜打开时即可插入左心室，如见到插管内的液面随心搏而上下波动即表明插管成功。将插管与左动脉支固定，剪断两根动脉，持插管提起心脏，在静脉窦结扎处以下剪断血管使心脏离体。实验中要不断用滴管吸去插管内血液，用营养液连续换洗至无色，使插管内保留1mL左右的营养液。
用带有长线的蛙心夹夹住心尖，长线与张力换能器相连，给心脏适当量的前负荷(0.5g)，即可将心脏的搏动记录在生物机能系统上。
室温条件下，标本平衡1h，每隔20min换营养液。待其稳定后，将插管内任氏液体积定量为1.0mL，记录一段正常心搏曲线。注入10μL空白溶液，记录心搏曲线，作为空白对照。待标本稳定后，注入10μL阳性药溶液，记录心搏曲线。冲洗标本数次，直至标本收缩值回到基线附近。注入10μL不同浓度的红毛新碱B的溶液，记录心搏曲线。重复以上操作，计算红毛新碱B对离体蛙心心率和心肌收缩力影响。
D、实验结果红毛新碱B对离体蛙心心率的影响以心率作为药理指标，观察加药前后药理指标的变化。经过配对t检验，结果表明在离体蛙心中分别加入4、12、30、60、120μg/mL的红毛新碱B供试样品溶液时，对心率的影响不明显。
阳性药(Vp)及红毛新碱B对离体蛙心心率的影响如图1和下表所示红毛新碱B对离体蛙心心率的影响(n＝8，x±s)
红毛新碱B对离体蛙心心肌收缩力的影响以心肌收缩力作为药理指标，观察加药前后药理指标的变化。经过配对t检验，结果表明在离体蛙心中分别加入4、12、30、60、120μg/mL的红毛新碱B供试样品溶液时，心肌收缩力均显著下降，。
阳性药(Vp)及红毛新碱B对离体蛙心心肌收缩力的影响如下表和图2所示
红毛新碱B对离体蛙心心肌收缩力的影响(n＝8，x±s)
**表示与空白组比较，加药后的心肌收缩力有显著性差异。
(2)红毛新碱B对离体大鼠腹主动脉血管收缩的抑制作用A、样品溶液制备精密称取红毛新碱B样品，用DMSO溶解并定容至10ml(6mg/ml)，置于冰箱中备用，临用前加入适量Krebs液稀释至所需的浓度。
B、离体腹主动脉环标本制备取健康SD大鼠一只，颈总动脉放血处死，剪开腹部皮肤并移除腹部组织，暴露腹主动脉，剪取自股动脉分支至膈主动脉裂孔处的一段腹主动脉，迅速移入盛有4℃Krebs液的培养皿中，冲洗血管内外壁上附着的血液，用虹膜剪剪除血管周围附着组织，剪成宽1mm的动脉环标本，置于4℃冰箱中备用。
C、红毛新碱B对NE所致主动脉条收缩的影响将大鼠离体腹主动脉环标本固定于盛有1.0mL Krebs液(37±0.5℃)的浴槽中，持续通入混合气体(95％O2+5％CO2)，一端连于张力换能器上，另一端固定于浴槽调节旋钮上，静息张力5mN，先用高钾Krebs液刺激2次，检验血管环活性，每次5min，然后用Krebs液冲洗至张力平衡，每20min换液1次，待血管张力稳定后开始实验。待张力平衡后，以累加浓度法由低浓度到高浓度向浴管中加入一定剂量NE，连续记录标本对NE的量效反应，直至血管平滑肌产生最大收缩效应，绘制NE量效曲线。反复冲洗标本使血管张力达基线水平，给以不同剂量单体1，使之与标本充分接触后20min后，按上述操作，重复NE量效反应，绘制给药后NE量效曲线。以给药前动脉环对NE最大收缩为100％，分别计算各浓度时的收缩值，绘制收缩曲线，见图3、直方图参见图4；D、红毛新碱B对CaCl2所致主动脉条收缩的影响将大鼠离体腹主动脉环标本固定于盛有1.0mL Krebs液(37±0.5℃)的浴槽中，持续通入混合气体(95％O2+5％CO2)，一端连于张力换能器上，另一端固定于浴槽调节旋钮上，静息张力5mN，先用高钾Krebs液刺激2次，检验血管环活性，每次5min，然后用无钙Krebs液冲洗至张力平衡，每20min换液1次，待血管张力稳定后开始实验。待张力平衡后，以累加浓度法由低浓度到高浓度向浴管中加入一定剂量CaCl2溶液，连续记录标本对的量效反应，直至血管平滑肌产生最大收缩效应，绘制Ca2+量效曲线。反复冲洗标本，平衡，待血管张力达基线水平，分别给以不同剂量单体1，使之与标本充分接触20min后，按上述操作，重复Ca2+量效反应，绘制给药后Ca2+量效曲线。以给药前Ca2+最大收缩为100％，分别计算各浓度时的收缩值，绘制收缩曲线见图5，直方图参见图6。
E、红毛新碱B对KCL所致主动脉条收缩的影响将大鼠离体腹主动脉条标本固定于盛有1.0mL Krebs液(37±0.5℃)的浴槽中，持续通入混合气体(95％O2+5％CO2)，一端连于张力换能器上，另一端固定于浴槽调节旋钮上，静息张力5mN，先用高钾Krebs液刺激2次，检验血管环活性，每次5min，然后用无K+Krebs液冲洗至张力平衡(k+用等量的NaCl代替)每20min换液1次，每20min换液1次，待血管张力稳定后开始实验。待标本在营养液中稳定后，以累加浓度法向浴管中从低浓度到高浓度加入一定剂量KCL溶液，连续记录标本对的量效反应，直至血管平滑肌产生最大收缩效应，绘制K+量效曲线。反复冲洗标本，平衡，待血管张力达基线水平，给以不同剂量单体1，使之与标本充分接触后，按上述操作，重复K+量效反应，绘制给药后K+量效曲线。以给药前K+最大收缩为100％，分别计算各浓度时的收缩值，绘制收缩曲线见图7，直方图参见图8。
F、红毛新碱B对不同药物的拮抗作用结果见下表红毛新碱B对不同药物的拮抗作用
由上可知红毛新碱B对由去甲肾上腺素、氯化钾和氯化钙所引起的大鼠腹主动脉血管收缩均有明显的抑制作用，使最大效应降低，其量效反应曲线非平行右移，pD2值基本不变。证明其通过阻断受体依赖性钙通道和电压依赖性钙通道对大鼠腹主动脉收缩产生非竞争性拮抗作用。
(3)红毛新碱B的抗心肌缺血试验A、红毛新碱B对垂体后叶素诱发的大鼠急性心肌缺血的影响雄性大鼠40只，随机分为5组，每组8只。第一组为阴性对照组，给辅料(相当于大剂量所含)；第二组为西药阳性对照组，给硝苯地平片10.7mg/kg(相当于人等效剂量的4倍)；第三组为中药阳性对照组，给复方丹参滴丸290mg/kg(相当于人等效剂量的4倍)；第四、五组为红毛新碱B组，分别给红毛新碱B146.7、392mg/kg(含纯药物21、56mg/kg)。各组均灌胃给药，每天一次，5ml/kg，连续7天，末次给药1小时后静注垂体后叶素制造急性心肌缺血模型。腹腔注射20％乌拉坦0.5ml/100g麻醉大鼠，仰卧固定，四肢插入针型电极，记录II导联心电图。先记录给垂体后叶素前心电图(造模前)，然后舌下静脉注射垂体后叶素0.5u/kg，注射时间均为5秒。注射后立即(造模后0min)、30s、1min、5min记录心电图，测量注射垂体后叶素前、后ST-T段的高度，同时观察心律失常的潜伏期和持续时间，结果见下表红毛新碱B对垂体后叶素诱发的大鼠缺血性心律失常的影响(x±s)
由表可见，给大鼠静脉注射垂体后叶素可诱发心电图ST-T段抬高，红毛新碱B能降低垂体后叶素诱发的大鼠心电图ST-T段抬高，降低心律失常的发生率，提示试验药物能减轻垂体后叶素诱发的大鼠急性心肌缺血。
B、红毛新碱B对冠状动脉结扎诱发的大鼠急性心肌缺血的影响雄性大鼠100只，随机分为8组。第一组为假手术组，给辅料(相当于大剂量所含)；第二组为模型对照组，给辅料；第三组为西药阳性对照组，给硝苯地平片10.7mg/kg(相当于人等效剂量的4倍)；第四组为中药阳性对照组，给复方丹参滴丸290mg/kg(相当于人等效剂量的4倍)；第五组为红毛新碱B组，给红毛新碱B366.75mg/kg(含纯药物52.4mg/kg)。各组均灌胃给药，每天一次，5ml/kg，连续7天。末次给药1小时后，记录正常心电图(造模前)，测量ST-T段高度。然后除假手术组外，其余各组按下法结扎冠状动脉制造急性心肌缺血模型。用乙醚麻醉大鼠，仰卧固定，在无菌条件下切开左胸部皮肤，于第四肋间隙钝性分离肌肉，轻压右胸挤出心脏，于肺动脉圆锥与左心耳之间，距左冠状动脉起源2～3mm处结扎冠状动脉。随后立即把心脏送回胸腔，挤出胸腔内空气，行人工呼吸至自主呼吸恢复。缝合伤口，局部涂抹青霉素预防感染。假手术组大鼠冠状动脉下穿线但不结扎，余手术过程相同。手术后立即记录缺血后心电图(造模后0min)，测量ST-T段高度。各组动物于手术后24小时，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，再记录心电图(造模后24h)，测量ST-T段高度；股动脉采血，分离血清，测定乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；开胸剪取心脏，用冷生理盐水冲洗，除去心房，将心室横切成3～4片，侵入0.25％NBT溶液中，37℃水浴10min染色。切下梗死心肌称重，计算梗死心肌占全心室心肌重量的百分比，结果见下表红毛新碱B对大鼠心肌梗塞范围的影响(x±s)
与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01红毛新碱B对心肌缺血大鼠心电图的影响(x±s)
与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01红毛新碱B对心肌缺血大鼠血清LDH和CK活性的影响(x±s)
与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01红毛新碱B对心肌缺血大鼠血清SOD和MDA活性的影响(x±s)
与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01结果表明，红毛新碱B能降低急性心肌缺血大鼠梗塞心肌占全心室的比例，降低结扎冠脉后心电图ST-T段的即刻抬高，对结扎冠脉24小时后心电图ST-T段的抬高也有降低趋势；降低血清MDA含量，升高SOD活性，结果说明，红毛新碱B能缩小大鼠心肌梗塞范围，对大鼠急性心肌缺血有保护作用。
权利要求
1.红毛新碱B化合物，其母体结构式如下 其中R1和R2是相同或不同，并代表氢、烷基、环烷基、链烯基、链炔基；X1和X2是相同或不同，并代表氢、烷基、烷氧基、环烷基、链烯基、链炔基、不饱和的单环烃、羟基、硫羟基、氨基、铵、卤素、羧酸或酯或其硫酯、酮、醛、碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺；Y1和Y2是相同或不同，并代表氢、烷基、烷氧基、环烷基、链烯基、链炔基、不饱和的单环烃、羟基、硫羟基、氨基、铵、卤素、羧酸或酯或其硫酯、酮、醛、碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺；R代表氢、烷基、环烷基、链烯基、链炔基。
2.红毛新碱B化合物用于制备抗心肌缺血药物的用途。
全文摘要
本发明公开了红毛新碱B化合物及其用于制备抗心肌缺血药物的用途，采用元素分析、紫外光谱法、红外光谱法、质谱法、核磁共振波谱法，结合样品理化性质研究，确定红毛七中红毛新碱B的化合物结构。并为其临床应用及进一步开发研究提供资料。经离体蛙心灌流试验，大鼠离体腹主动脉环试验以及抗心肌缺血试验证明，红毛新碱B化合物是一种潜在的用于临床的抗心肌缺血用途的药物。
文档编号A61K31/473GK1733733SQ20051004310
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月15日 优先权日2005年8月15日
发明者贺浪冲, 王嗣岑, 王娜, 马婧, 杜鹃, 王嫦鹤, 温彬宇 申请人:西安交通大学