本发明属于具有抗肿瘤活性药物的合成
技术领域：
，具体涉及一种1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物及其制备方法和应用。
背景技术：
有机锗具有调节人体免疫和造血机能、消除自由基、抗突变、抗癌、消炎、抗菌等多重功效。因而，有机锗化合物成为新一类人类生物效应调节剂和体内平衡调节的药物，其应用前景不可低估。研究和开发新的无毒的有机锗化合物是十分必要的。其中，选择合适的有机配体是首要工作。单宁酸(tannicacid)是从五倍子、塔拉等富含鞣质的植物样品中提取制备的由不同数目棓酰基和葡萄糖形成的酯的聚合物的一类天然多酚化合物。因此，从化学成分上看单宁酸是由不同聚合度的棓酸的混合物。其中又以1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖(pgg)含量为主要成分。药理学研究表明，1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖具有多方面的生理活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、拮抗内毒素/脂多糖、降糖祛脂等。单宁酸具有络合金属离子的特性，络合及沉淀金属离子是单宁酸多种应用的化学基础。单宁酸分子中的多个邻位酚羟基结构，可以作为一种多羟基配体与许多金属离子发生配位反应，如cu2+，sn2+，pb2+，al3+，fe3+，ge4+等。技术实现要素：本发明的目的是提供一种1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物及其制备方法和应用，合成工艺简单且方便操作，合成的1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物对人结肠癌细胞hct116、人宫颈癌细胞hela、人胰腺癌细胞bxpc3、人小细胞肺癌细胞a549、人胃癌细胞sgc7901、人乳腺癌细胞mcf7均具有较好的抑制作用，因此该化合物能够应用于制备治疗或预防肿瘤的药物。本发明的技术方案为：一种1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物，由1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖和锗(iv)离子络合而成。制备所述的1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物的方法，具体步骤为：(1)在醋酸盐缓冲液中，分别加入1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖的甲醇溶液及锗(iv)离子溶液，发生络合反应得到目标产物1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物；(2)调节溶液ph值至2～4，静置得到络合物沉淀；(3)反应溶液离心，分离得到沉淀；(4)沉淀干燥得灰白色粉末状固体；(5)将络合物分散于甲醇中，用sephadexlh-20葡聚糖色谱柱进行分离纯化除去未络合的锗离子和其他杂质。步骤(1)中所述锗(iv)离子溶液按照以下步骤配置得到：将二氧化锗中加入少量氢氧化钠颗粒，用少量水溶解后，用稀酸溶液调节ph至中性，再用去离子水定容。步骤(1)中所述醋酸盐缓冲液ph为6.0。步骤(1)中反应溶液中1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖和锗(iv)离子摩尔比例为1:1～4。步骤(4)中干燥为真空干燥或冷冻干燥，真空干燥温度为40～85℃。所述的制备1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物的方法，步骤(5)中所述分离纯化步骤为：(1)将络合物分散于甲醇中，上sephadexlh-20葡聚糖色谱柱进行分离纯化；(2)先用去离子水清洗除去杂质；(3)再用丙酮溶液洗脱，收集洗脱液；(4)丙酮洗脱部分经减压蒸发浓缩除去有机溶剂得水相；(5)水相经冷冻干燥后得到白色粉末状固体络合物。步骤(1)中所用色谱柱填料为sephadexlh-20葡聚糖凝胶色谱填料。所述的1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。所述的1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物在制备治疗或预防结肠癌、宫颈癌、胃癌、乳腺癌或肺癌药物中的应用。有益效果本发明合成的化合物结构新颖且合成工艺简单，合成的1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物对人结肠癌细胞hct116、人宫颈癌细胞hela、人胰腺癌细胞bxpc3、人小细胞肺癌细胞a549和人胃癌细胞sgc7901、人乳腺癌细胞mcf7均具有较好的抑制作用。具体实施方式以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此离解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。本发明所述的一种1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物的制备方法，具体步骤为：(1)在醋酸盐缓冲液中，按照一定比例分别加入1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖50％甲醇(体积百分比，下同)溶液，及锗(iv)离子溶液，发生络合反应得到目标产物1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物；(2)用1m盐酸溶液调节溶液ph值至2～4，室温或放置冰箱4℃静置得到络合物沉淀；(3)反应溶液在室温下离心，分离得到沉淀；(4)沉淀经冷冻干燥或真空干燥得灰白色粉末状固体；(5)将络合物分散于甲醇中，用sephadexlh-20葡聚糖色谱柱进行分离纯化除去未络合的锗离子和其他杂质。步骤(1)中的1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖为以五倍子单宁酸为原料利用甲醇降解制备得到，具体的制备方法可以参考专利申请号201010169308.0，发明人张颖君，刘青，乔春玲，等.名称为1,2,3,4,6-五-o-五没食子酰基-β-d-葡萄糖的制备方法中的记载。步骤(1)中所述锗(iv)离子溶液按照以下步骤配置得到：将二氧化锗中加入少量氢氧化钠颗粒，用少量水溶解后，用10％稀硫酸溶液调节ph至中性，再用去离子水定容。步骤(1)中所述醋酸盐缓冲液ph为6.0。步骤(1)中反应溶液中1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖和锗(iv)离子摩尔比例为1:4～1:1。步骤(2)中所述调节溶液ph值至2～4。步骤(3)的具体过程为：反应溶液移至离心管中，在室温下，11000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀用去离子水清洗两次，再经离心，弃去上清液，得到沉淀。步骤(4)中所真空干燥温度为40～85℃。进一步优选，步骤(5)的具体过程为：(1)将络合物分散于甲醇中，上sephadexlh-20葡聚糖色谱柱进行分离纯化；(2)先用去离子水清洗除去杂质，所用去离子水体积为2～5个柱体积；(3)再用70％丙酮(体积百分比)溶液洗脱，收集洗脱液，所用丙酮溶液浓度为70％，所用体积为2～3个柱体积；(4)70％丙酮洗脱部分经减压蒸发浓缩除去有机溶剂得水相，减压蒸发浓缩温度为40～45℃；(5)水相经冷冻干燥后得到白色粉末状固体络合物。本发明所述的1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。实施例1：精密称取0.53g二氧化锗于烧杯中，加入少量氢氧化钠颗粒，用少量水溶剂后，用适量10％稀硫酸调节至中性，再补加水定容至500ml，得浓度为10mm的ge4+离子溶液。称取一定量的1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖(pgg)，溶于50％甲醇溶液，配制成浓度为10mm的pgg溶液。配制醋酸盐缓冲液(ph6.0)。在1l烧杯中加入450mlph6.0醋酸盐缓冲液，再加入30ml浓度为10mm的pgg溶液，充分混合后缓慢加入120ml浓度为10mm的ge4+溶液，并用浓度为1m的盐酸溶液将反应液ph调至2，室温下静置30min。离心、洗涤，旋转蒸发器蒸发除去有机溶剂，水相经冷冻干燥得到1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物粗品。将络合物粗品用少量甲醇分散后上sephadexlh-20葡聚糖色谱柱进行分离纯化，先用去离子水冲洗除杂，再用70％丙酮溶液洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发器蒸发除去有机溶剂，水相经冷冻干燥后得到1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物，呈灰白色粉末状固体。实施例2：按照实施例1分别配制浓度为10mmge4+离子溶液、浓度为10mm的pgg溶液及醋酸盐缓冲液(ph6.0)。在100ml烧杯中加入22.5mlph6.0醋酸盐缓冲液，再加入1.5ml浓度为10mm的pgg溶液，充分混合后缓慢加入6ml浓度为10mm的ge4+溶液，并用浓度为1m的盐酸溶液将反应液ph调至2，室温下静置30min。离心、洗涤，旋转蒸发器蒸发除去有机溶剂，水相经冷冻干燥得到1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物粗品。将络合物粗品用少量甲醇分散后上sephadexlh-20葡聚糖色谱柱进行分离纯化，先用去离子水冲洗除杂，再用70％丙酮溶液洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发器蒸发除去有机溶剂，水相经冷冻干燥后得到1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物，呈灰白色粉末状固体。实施例3：按照实施例1分别配制浓度为10mmge4+离子溶液、浓度为10mm的pgg溶液及醋酸盐缓冲液(ph6.0)。在500ml烧杯中加入225mlph6.0醋酸盐缓冲液，再加入15ml浓度为10mm的pgg溶液，充分混合后缓慢加入60ml浓度为10mm的ge4+溶液，并用浓度为1m的盐酸溶液将反应液ph调至2，置于冰箱4℃静置12h。离心、洗涤，旋转蒸发器蒸发除去有机溶剂，水相经冷冻干燥得到1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物粗品。将络合物粗品用少量甲醇分散后上sephadexlh-20葡聚糖色谱柱进行分离纯化，先用去离子水冲洗除杂，再用70％丙酮溶液洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发器蒸发除去有机溶剂，水相经冷冻干燥后得到1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物，呈灰白色粉末状固体。实施例4：配合物的红外光谱对合成的pgg-ge配合物和pgg分别进行红外光谱分析，主要红外光谱数据见表1.对比2种化合物的红外光谱数据可知，pgg中的苯环上的羟基(o-h)震动频率ν位于3201处，形成pgg-ge配合物后该频率移至3336cm-1处，向高波数方向位移了135cm-1，ν(c-oh)位于1323cm-1处，形成配合物后该频率移至1312cm-1处，向低波数方向位移了11cm-1。由此可见，配体的苯环上的羟基氧参与了配位。远红外区的吸收可认为是配位原子—金属的伸缩震动和弯曲震动。参照文献王俊杰,赫春香.槲皮素-锗配合物的合成及清除氧自由基活性的研究.高师理科学刊,2010，(01):71-74.中的记载，可认为865cm-1处的谱带为ge-o的震动频率。表1配合物的主要红外光谱数据成分ν(o-h)ν(c＝c)ν(c-oh)ν(c-o-c)ν(c＝o)ν(o-m)pgg32011596132311921698-pgg-ge33361609131211901693865实施例5：cck8法测1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物对各肿瘤细胞增殖的影响1.材料和方法1.1药物：1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物：浓度10、20、40、80、160、320μg/ml顺铂：10、20、40、80、160、320μg/ml用dmso溶解药物，用完全培养基稀释药物到相应浓度，正常对照组用dmso代替药物做相应稀释，实验同时用相同浓度的顺铂作为阳性对照组。1.2细胞人结肠癌细胞hct116、人宫颈癌细胞hela、人胰腺癌细胞bxpc3、人小细胞肺癌细胞a549、人胃癌细胞sgc7901、人乳腺癌细胞mcf71.3实验步骤将正常培养细胞制成1×105/ml悬液，接种至96孔培养板内，每孔100μl，细胞贴壁24h后给药。细胞贴壁24小时后，加含药物的dmem完全培养基，100μl/孔。加药24小时后，每孔加cck810μl。置于培养箱内孵育1-3h后，充分振荡混匀后用酶标仪在450nm处测定各孔的吸光度(od450nm)。计算药物对细胞生长的抑制率和ic50。抑制率(％)＝(1－od给药组/od对照组)×100％。2.实验结果1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物对各肿瘤细胞增殖的抑制效果实验结果见表2，由表中可以看出1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物对6种肿瘤细胞的增殖具有一定的抑制作用，且随着浓度的逐渐增加，其对肿瘤细胞的抑制作用也逐渐增强。当药物浓度达到，160μg/ml时，对人胰腺癌细胞bxpc3、人小细胞肺癌细胞a549、人胃癌细胞sgc7901、人乳腺癌细胞mcf7增殖的抑制率均达到了80％左右，其中对人胰腺癌细胞bxpc3、人胃癌细胞sgc7901增殖的抑制率均达到了80％以上。由1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖锗络合物对各肿瘤细胞生长的ic50值可以看出，络合物对人胰腺癌细胞bxpc3增殖的抑制作用最强，其ic50值为52.63μg/ml。对人结肠癌细胞hct116增殖的抑制作用最弱，其ic50值为86.18μg/ml。表2pgg-ge络合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用结果(cck8法)当前第1页12