一种提高铁皮石斛多糖含量的方法及采用该方法得到的铁皮石斛与流程

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种通过过表达基因提高铁皮石斛多糖含量的方法及采用该方法得到的石斛。

背景技术

铁皮石斛(dendrobiumcatenatumlindl)，又称黑节草，为兰科石斛属多年生常绿草本植物。其种类繁多，全世界石斛属植物就有1000多种，其中我国有70多种，大部分分布在华南和西南地区。石斛在中国及东南亚的国家中是有着极高价值的民间药材，其干茎成为“枫斗”，根据《本草图经》中的“惟生石上者胜.亦有生栎木上者，名木斛，不堪用”，又知铁皮石斛在石斛属中为上品，其品质佳，药用价值高，药用成分好。铁皮石斛含有人体所必需的多种有益成分，味甘性微寒，属补益药中的补阴药；不仅具有清音润喉、滋阴清热、生津益胃等功效，还可以增强机体免疫力，预防心血管和眼科疾病。

石斛的有效成分包括多糖、生物碱、黄酮类物质、菲类化合物、氨基酸及微量元素等，其中多糖是主要活性成分，石斛生理活性的强弱与其多糖含量密切相关，故常以多糖含量的高低判断石斛类药材质量的好坏。

目前，已知的提高铁皮石斛中多糖含量的方法包括：

1.通过改变种植铁皮石斛的基质——树种类型，来提高多糖含量。

缺点：需要驯化苗，增殖率低，多糖含量提高得并不多，仅比野生铁皮石斛提高了5.94％左右；

2.通过改变施肥方法提高多糖含量。

缺点：需要驯化苗，施肥需在采收前一年，方法繁琐，周期长；

3.控制光温等条件增加多糖含量。

缺点：成本高，控制周期长。

另外，ugp(uridinediphosphateglucosepyrophosphorylasegene)表达产物为尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(udp-glucosepyrophosphorylase，ugpase)，ugpase催化1-磷酸葡萄糖和尿苷三磷酸合成udp-葡萄糖和焦磷酸，而udp-葡萄糖是多糖合成主要的糖基供体。众多研究已经从黄芪、甘蔗和马铃薯等植物中克隆了ugp基因。少数对石斛ugp基因的研究也只停留在cdna克隆和表达分析阶段，吕楠等人的研究也仅涉及了该基因在铁皮石斛不同年份，不同组织中的表达量。但目前尚未出现过表达该基因会对铁皮石斛本身造成何种影响的研究。

技术实现要素：

本发明的目的之一，就在于提供一种提高铁皮石斛多糖含量的方法，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种提高铁皮石斛多糖含量的方法，包括以下步骤：

(1)过表达dcugp载体构建：

a.根据已知的铁皮石斛的dcugpcdna序列，设计引物；

b.提取铁皮石斛rna反转录得到总cdna，根据步骤(a)中设计得到的引物进行pcr扩增得到dcugp目的片段；

c.用spei与asci限制内切酶对载体pfgc1008与步骤(b)得到的dcugp目的片段进行酶切；

d.将步骤(c)酶切后的dcugp目的片段与载体pfgc1008进行电泳检测，对所需片段进行回收；将回收产物加入连接酶进行连接反应，得到连接产物pfgc1008-dcugp；

e.将步骤(d)所得的连接产物pfgc1008-dcugp转化大肠杆菌后，提取质粒pfgc1008-dcugp并验证；

(2)pfgc1008-dcugp转化农杆菌gv3101

将步骤(1)所得的质粒pfgc1008-dcugp转化农杆菌gv3101，然后进行克隆pcr，进行农杆菌验证；

(3)菌种活化：

活化含有pfgc1008-dcugp的保存农杆菌gv3011，制成侵染液；

(4)侵染：

选取生长健壮、颜色较绿且较致密的铁皮石斛野生型原球茎并切割，然后加入步骤(3)所得侵染液，进行侵染；

(5)共培养：

将步骤(4)侵染后的原球茎转入共培养基上进行共培养；

(6)抗性筛选：

将步骤(5)共培养后的原球茎转移至筛选培养基进行抗性筛选，至分化出新的原球茎，即完成抗性筛选；

(7)植株再生：

将步骤(6)所得的新的原球茎转移至不含潮霉素的培养基，待其分化出芽后，转入生根培养基中生根，获得完整植株。

作为优选的技术方案，步骤(3)中，农杆菌gv3011的活化方法为：将农杆菌gv3011用yep培养液两次培养，培养后收集菌体用ms液体培养基制成侵染液。

作为进一步优选的技术方案，步骤(3)中，所述yep培养液的组成为：gen50μg/ml+rif10μg/ml+cm25μg/ml。

作为优选的技术方案，步骤(4)中，侵染前，对步骤(3)所得的侵染液进行浓度调整。

作为优选的技术方案，步骤(4)中，所述侵染的条件为28℃摇床50rpm侵染30min。

作为优选的技术方案，步骤(5)中，共培养条件为20℃下黑暗培养4d。

作为优选的技术方案，步骤(6)中，所述筛选培养基配方为：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂4.8g/l+马铃薯20g/l+灭菌后加头孢500mg/l+潮霉素20mg/l。

作为优选的技术方案，步骤(6)中，筛选培养的条件为：22-25℃，光照强度为1800-2000lx，光照周期为14h光照/d，10h黑暗/d的恒温培养室培养。

作为优选的技术方案，步骤(7)中，所述生根培养基的配方为：ms+蔗糖30g/l+琼脂4.8g/l+马铃薯20g/l+灭菌后加头孢500mg/l。

本发明的目的之二，在于提供上述方法得到的铁皮石斛。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.利用农杆菌介导的方法将dcugp基因转入铁皮石斛中，方法简便，易操作且成本低；

2.通过过表达铁皮石斛本身的dcugp基因来获得多糖含量增加的铁皮石斛，克服了外界一些不确定因素，如温度、光照、ph等的影响；

3.为解决传统育种中存在的生产周期长、品质不佳等问题提供了一种有效方法；

4.获得的组培苗干净无毒且可大量扩增，可直接用于多糖提取，也可移栽至自然环境种植，为广泛推广奠定基础；

5.移栽后结合一些外部条件的方法可能使多糖含量提高得更多；

6.在组培苗阶段即可获得多糖含量增加的铁皮石斛，不需驯化，从侵染到获得多糖含量增加的铁皮石斛植株仅需一年左右。

即，本申请利用农杆菌介导的方法，将dcugp转入铁皮石斛中，获得了葡萄糖、蔗糖及多糖含量均高于野生型的铁皮石斛；本方法成本低、易操作，对缩短铁皮石斛育种年限，提高其品质具有重要意义。

附图说明

图1为pfgc1008-dcugp载体构建电泳结果图；

图2为pfgc1008载体图；

图3为农杆菌克隆pcr验证电泳结果图；

图4为转化及筛选结果示意图；

图5为铁皮石斛幼苗荧光定量分析，图5中，wt为野生型；t1，t2和t3为转基因型；

图6为铁皮石斛原球茎葡萄糖与蔗糖含量比较结果示意图；

图7为铁皮石斛植株多糖含量比较结果示意图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种提高铁皮石斛多糖含量的方法，包括以下步骤：

(1)过表达dcugp载体构建：

a.根据已知的铁皮石斛的dcugpcdna序列，设计引物；

利用ncbi网站查询铁皮石斛dcugp的cds序列和cdna序列，其核苷酸序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示，根据上述核酸序列，在引物设计软件primer3.0与dnaman中设计引物，所得的引物序列如表1所示，

表1引物序列

b.采用现有技术提取铁皮石斛rna反转录得到总cdna，根据步骤(a)中设计得到的引物进行pcr扩增，先得到含5’utr及3’utr部分的dcugp基因目的片段，如图1a所示；再以此片段为模板，加入含有酶切位点的特异性引物进行pcr扩增，得到含有酶切位点的dcugp目的片段；其中，扩增含5’utr和3’utr的dcugp时所用引物的正向序列和反向序列如seqidno:5和seqidno:6所示，扩增含酶切位点的dcugp时所用特异性引物的正向序列和反向序列如seqidno:3和seqidno:4所示；

c.同时用spei与asci两种限制内切酶对载体pfgc1008和步骤(b)得到的dcugp目的片段即含有酶切位点的dcugp进行酶切；

其中，spei和asci均购自北京newenglandbiolabs；载体pfgc1008来自https://www.arabidopsis.org/servlet/tairobject？id＝500300074&type＝vector，

其结构如图2所示，酶切位点如图2中的方框所示，

d.将上述酶切后的dcugp与pfgc1008进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图1-b所示，证明酶切正确，对所需片段胶回收，用于下一步的连接反应；回收产物进行连接，加入t4dna连接酶(购自北京newenglandbiolabs)，根据胶回收片段的浓度确定目的片段dcugp与载体pfgc1008的添加比例，反应总体积20μl，然后16℃连接反应5h，得到连接产物pfgc1008-dcugp；

e.将步骤(d)所得的连接产物pfgc1008-dcugp转化大肠杆菌后，提取质粒pfgc1008-dcugp并验证，具体步骤为：

超低温冰箱中取出感受态细胞(大肠杆菌))放入冰中，待其融化后加入质粒(100μl大肠杆菌加入20ml步骤d所得的连接产物pfgc1008-dcugp)，冰浴30min，42℃热击1min后迅速放回冰中冰浴2min；加入yep培养液1ml，摇床上37℃，200rpm摇晃1h后涂板(cm(本发明中，除非特别说明，简写“cm”均指氯霉素)25μg/ml)静置于37℃培养过夜，8-12h；

每个平板挑取单菌落进行克隆pcr反应，检测重组dna是否成功转化。将成功转化的大肠杆菌转入5ml含25μg/ml氯霉素的yep液体培养基中，200rpm，37℃下过夜摇菌；之后筛选出含重组质粒的细菌提取质粒dna，并用spei/asci酶切验证，结果如下图1-c所示，出现10496bp和1433bp的条带，符合预期结果，说明连接转化成功；将最后验证正确的质粒送往公司测序；验证载体是否构建成功所用引物的正向序列和反向序列如seqidno:7和seqidno:8所示；

(2)pfgc1008-dcugp转化农杆菌gv3101

将步骤(1)所得的质粒pfgc1008-dcugp转化农杆菌gv3101(购自北京博迈德生物技术有限公司)，然后进行克隆pcr，pcr产物电泳结果如图3所示，均出现769bp大小的条带，与预期结果符合，表明连接产物转化农杆菌成功，可用于铁皮石斛侵染；

(3)菌种活化：

活化农杆菌gv3011；

将保存的农杆菌gv3011先取至含有相应抗生素的5ml液体yep培养液(组成为：gen(本发明中，除非特别说明，简写“gen”均指庆大霉素)50μg/ml+rif(本发明中，除非特别说明，简写“rif”均指利福平)10μg/ml+cm25μg/ml)中，封口并置于28℃，200rpm摇床过夜培养；再转移至250ml液体yep培养液(组成为：gen50μg/ml+rif10μg/ml+cm25μg/ml)中大量培养后收集菌体，用ms液体培养基制成侵染液；

(4)侵染：

选取生长健壮、颜色嫩绿且较致密的铁皮石斛野生型原球茎作为转化受体并切割，然后加入步骤(3)所得侵染液，进行侵染，具体过程为：

a.打开分光光度计，调至600nm，测定农杆菌液浓度；

b.将前述扩增培养的农杆菌yep溶液分装于2支离心管中，4000rpm离心10min；

c.离心后弃上清，加入10mlms培养液，冰上悬浮至全溶；

d.ms培养液稀释菌液至od值为0.6左右；

c.加入as(乙酰丁香酮)使溶液as终浓度为100μmol/l，摇匀；

e.选取生长健壮，颜色较绿且比较致密的铁皮石斛野生型原球茎(如图4-a所示)切割至直径3-5mm左右，放入无菌锥形瓶中，加入前述步骤制作好的侵染液；

f.28℃摇床50rpm侵染30min；

(5)共培养：

将步骤(4)侵染结束后将原球茎于无菌培养皿中滤纸吸干余液，转入共培养基上，20℃下黑暗培养4d后原球茎周围长有一圈乳白色的农杆菌，如图4-b所示；

(6)抗性筛选：

具体步骤为：

4d后，挑取共培养的原球茎于100ml无菌三角瓶，用无菌水冲洗4-5次，每次摇晃数次，直到水不再浑浊，呈现清澈透明状态即可，最后用含100μl头孢(500mg/l)的50ml水再摇晃清洗约1min，倒掉液体，将原球茎置于无菌培养皿里滤纸上，吸干水分，然后迅速转移至筛选培养基(筛选培养基配方为：ms+6-ba(6-苄氨基嘌呤)1.0mg/l+naa(萘乙酸)0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂4.8g/l+马铃薯20g/l+灭菌后加头孢500mg/l+潮霉素20mg/l)；后置于22-25℃，光照强度为1800-2000lx，光照周期为14h光照/d，10h黑暗/d的恒温培养室培养；筛选期间，定期统计原球茎的存活情况，并且转移到新配制的筛选培养基中，至分化出新的原球茎，完成抗性筛选；

约50d后筛选情况如图4-c所示，褐色或透明的为转化未成功的原球茎，因其不具有抗性基因而不能在筛选培养基中生存，逐渐死亡；图4-c中箭头所指的原球茎颜色依然是绿色，可以在筛选培养基中存活，证明成功转入dcugp基因，转化效率为16.9％；

(7)植株再生：

筛选得到新的原球茎后将其转移到不含潮霉素的培养基中，待其分化出芽后转入生根培养基(配方为：ms+蔗糖30g/l+琼脂4.8g/l+马铃薯20g/l+灭菌后加头孢500mg/l)中生根获得完整植株；

筛选稳定后的原球茎继续继代培养后，原球茎颜色深绿、致密饱满，部分原球茎有所分化(如图4-d所示)；继代培养2个月后，原球茎分化出茂密且颜色嫩绿的幼苗(如图4-e所示)；将生长健壮的幼苗移至生根培养基中，3个月后，幼苗生长发育成植株，茎部有所增粗，并且成功生根(如图4-f所示)。

本实施例的蔗糖、琼脂购自成都浩博优科技有限公司，

naa，6-ba，头孢，潮霉素，利福平，庆大霉素，氯霉素购自北京solarbio。

实施例2qrt-pcr检测

将实施例1所得的完整植株进行qrt-pcr检测，其中，qrt-pct检测时的dcugp引物的的正向序列和反向序列如seqidno:9和seqidno:10所示，内参引物的正向序列和反向序列如seqidno:11和seqidno:12所示，结果如图5所示，转基因铁皮石斛的dcugp基因表达量比野生型铁皮石斛的显著增高。

实施例3葡萄糖及蔗糖的检测

精密称取无水葡萄糖对照品配制成质量浓度为10mg/l的对照品储备母液，吸取葡萄糖标准液配制成浓度梯度溶液过0.45μm滤膜后装入进样瓶。取利用热水浸提法(称取野生型和转基因型的鲜品原球茎各5g，其余步骤与下述植株多糖的提取相同)提取的转基因原球茎多糖溶液5ml过0.45μm滤膜，装入进样瓶。根据hpaec-pad法进行检测后绘制标准曲线以及计算样品溶液中葡萄糖和蔗糖的含量，结果如图6所示，结果表明：dcugp过表达铁皮石斛原球茎葡萄糖含量比野生型的增高107.8％(图6-a)，蔗糖含量dcugp过表达铁皮石斛原球茎比野生型的增高325.9％(图6-a)。

实施例4多糖含量检测

取无水葡萄糖对照品适量，加水制成浓度为0.1mg/ml的葡萄糖溶液。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml、2.0ml，分别置10ml具塞试管中，各加水补至2.0ml，再加入含1mg/ml蒽酮的80％硫酸6ml，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，置冰浴中冷却5min，以相应试剂为空白，在620nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

样品溶液的制备：分别取野生型和转化型铁皮石斛植株约3g，加水20ml。80℃水浴2h，静置后取上清存放于另一干净的离心管中。沉淀继续按上述比例加水，如此重复提取多糖2次。取所得上清溶液5ml加无水乙醇至乙醇浓度为80％，置于4℃冰箱中沉淀多糖不少于24h，7000rpm离心5min，弃上清，加入热水溶解沉淀，即可得到样品溶液。

测定法：量取供试品溶液1ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入含1mg/ml蒽酮的80％硫酸6ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，计算，即得，结果如图7所示，表明转基因植株多糖含量比野生型的高21.6％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。