一种具有高产细菌素的益生功能鼠李糖乳杆菌及其应用的制作方法

本发明属于有益菌筛选技术领域，主要涉及一种具有高产细菌素的益生功能鼠李糖乳杆菌及其应用。

背景技术：

益生菌（probiotic）该词最早是起源于希腊语，是由lilly和sti11we11在1965年科学杂志上提出，“由一种微生物产生促进另一种微生物生长的物质”[15]。随着科学经济的迅猛发展和对益生菌知识的不断丰富，人们对益生菌又有了进一步的认知。1989年英国的fullerr将其定义为：益生菌是额外补充的活性微生物，能改善肠道菌群的动态平衡，对宿主的健康产生良好的作用。此后在2001年，世界联合国粮农组织（fao）和世界卫生组织（who）定义：益生菌（probiotics）是一种活的微生物，当以适当剂量服用时能够对宿主（人或动物）产生有益健康的作用。目前人们对益生菌公认的定义是：益生菌指的是一类对宿主有益的微生物，能够定值依附于人体肠道内，维持肠道菌群的动态平衡，起到健康的功效。益生菌能够促进人体对营养物质的消化吸收，可以预防和治疗人体腹泻，此外益生菌还可以缓解乳糖不耐症等多种功效。因此，如今越来越多的人开始选择服用益生菌产品，益生菌及其产品受到前所未有的关注。目前我们将已知的益生菌分为以下三大类，第一是乳杆菌类，第二是双歧杆菌类，第三种是革兰式阳性球菌类。在2010年，国家卫生部办公厅组织制定了《可用于食品的菌种名单》，其中包括21种益生菌。其中双歧杆菌属占6种，包括长双歧杆菌（bifidobacteriumlongum）、婴儿双歧杆菌（bifidobacteriuminfantis）两歧双歧杆菌（b.bifidum）等；乳杆菌属14种，包括副干酪乳杆菌（lactobacillusparacasei）、干酪乳杆菌（l.casei）、植物乳杆菌（l.plantarum）、鼠李糖杆菌（l.rhamnosus）、卷曲乳杆菌（lactobacilluscrispatus）等；此外还有嗜热链球菌（s.thermophilus）。

技术实现要素：

本发明的目的是，在于提供一种具有高产细菌素的益生功能鼠李糖乳杆菌及其应用。

首先经广泛筛选，从传统马奶酒中获得一株具有高产细菌素、耐胆酸盐、高肠道粘附能力的鼠李糖乳杆菌。该菌所产细菌素对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atcc25923、大肠杆菌(escherichiacoli)atcc25922均具有显著抑菌效果。

本发明所提供的一种具有高产细菌素的益生功能鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)1.0320株，是从传统马奶酒样品中分离出来的一株革兰氏阳性菌。该菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.15557，保藏日期为2018年04月08号。本发明的鼠李糖乳杆菌产细菌素的能力为，肠壁粘附率高（达11.76%以上），耐低ph(ph低于3),耐胆盐（在0.3%的高浓度胆盐中孵育4h后，菌落数能维持在10⁷cfu/ml）。

所述的鼠李糖乳杆菌作为具有抗菌功能的食品添加剂的应用。

被抑制菌为革兰氏阳性菌，如葡萄菌属、链球菌属、小球菌属、片球菌属，不抑制乳酸杆菌属。

所述的鼠李糖乳杆菌作为具有抗菌功能的饲料添加剂的应用。

被抑制菌为革兰氏阳性菌，如葡萄菌属、链球菌属、小球菌属、片球菌属，不抑制乳酸杆菌属。

所述的鼠李糖乳杆菌作为食品和饲料生产中发酵剂的应用。

所述的鼠李糖乳杆菌在制备高密度包埋菌粉中的应用。该应用的操作如下：

鼠李糖乳杆菌高密度菌液的制备，包括如下步骤：

1）活化：从-80℃保存的鼠李糖乳杆菌的1.0320的菌种中挑取一部分并划线于固体mrs培养基中，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于mrs基础液体培养基中活化传代两次，培养12-16h菌液出现浑浊，取0.1ml的菌液在mrs固体培养基的平板上三区划线，置于37℃过夜培养，挑取单菌落革兰氏染色进行镜检，无杂菌污染，为合格；

2）发酵：发酵液配比为1%酵母粉，2%乳糖，4.5%~5%脱盐乳清粉，葡萄糖10%，硫酸锰0.01%，硫酸镁0.01%，用氨水调整ph为6.6；接种量2%，培养12h后，用氨水调整ph至6.3，加入1.2%酵母细胞破碎液，继续发酵4-12h，测定菌数10¹²cfu/ml以上，使用蒸汽灭菌的纳滤陶瓷膜过滤去除45%水分，得高密度鼠李糖乳杆菌菌液。

步骤2)中所述的纳滤的技术条件是：温度35℃，压力2.0mpa。

步骤2)中所述的酵母细胞破碎液采用以下方法制备：使用啤酒酵母发酵后，经生理盐水清洗，离心获得10⁶cfu/ml以上浓度的酵母细胞，超声破碎，55℃灭菌25分钟后备用。

然后利用上述鼠李糖乳杆菌高密度菌液制备包埋菌粉：将以上步骤获得的高密度鼠李糖乳杆菌培养液，根据质量比依次加入1.5%海藻多糖，搅拌30分钟，加入0.2%植物油搅拌40分钟，加入β环装糊精3%，搅拌60分钟；所得浓缩液高压低温喷粉，获得包埋粉，其中，低温喷雾条件为：进风温度110℃，出风温度45℃。

研究通过牛津杯双层琼脂扩散法筛选对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atcc25923和大肠杆菌(escherichiacoli)atcc25922均具有抑菌效果的乳杆菌，最终获得鼠李糖乳杆菌1.0320株。该株发酵液测得的细菌素最大浓度为253.5mg/ml，为已知发现鼠李糖乳杆菌同种最高，所产细菌素的抑菌活力接近或超过同属其他维生素产生细菌素的的抑菌能力，如植物乳杆菌318、植物乳杆菌1.0628以及69-2。也超过已知其他种类细菌素，如枯草芽孢杆菌ma139类，解淀粉芽胞杆菌ｙ－３２－１细菌。该菌所产细菌素对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atcc25923、大肠杆菌(escherichiacoli)atcc25922均具有显著抑菌效果。

附图说明

图1是该乳杆菌生长过程中ph的变化。

图2是该乳杆菌对caco-2细胞的黏附作用。

图3是鼠李糖乳杆菌1.0320与本实验室其他抑菌能力较高菌株的对比。

图4是鼠李糖乳杆菌1.0320与在中国工业微生物保藏中心（cicc）购买的已经保藏的其他具有产细菌素能力的对比。

图5是菌株菌体形态特征。

图6是牛津杯双层琼脂扩散法的照片——菌株69-2对大肠杆菌atcc25922产生的抑菌圈，其中1：ph6.0的无细胞发酵上清液所产生的抑菌圈；2：未调ph的无细胞发酵上清液所产生的抑菌圈。

图7是菌株318对大肠杆菌atcc25922产生的抑菌圈。

图8是菌株1.0628对大肠杆菌atcc25922产生的抑菌圈。

图9是菌株1.0320对大肠杆菌atcc25922产生的抑菌圈。

具体实施方式

下面结合附图来对具体实施例来进一步描述。

实施实例1鼠李糖乳杆菌1.0320生产富含细菌素的青贮饲料

发酵后青贮饲料细菌素含量达到211mg/g。对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atcc25923和大肠杆菌(escherichiacoli)atcc25922均具有抑菌效果，能够减少耐久饲养过程中抗生素的使用。

玉米收割及窖贮：青贮窖彻底消毒后。收割处于黄熟期到完熟期之间的全株玉米。原料用秸秆揉切机揉切至2-3cm。调制青贮料水分含量为72％。按照2%接入鼠李糖乳杆菌1.0320发酵液。也可以同时混合接入布氏乳杆菌lactobacillusbuchneri（sld2-1）、玉米乳杆菌lactobacilluszeae（ssd3），或其他青贮发酵剂。当窖内原料填满压实后，必须及时封埋窖口。玉米入窖密封后40～50天便能完成发酵过程，如需饲喂即可开窖。开窖后，在取料时，若是圆形窖，应自上而下一层一层地向下取，使青贮料始终保持一个平面，若是沟形官，应从窖一端的横断面垂直方向．由外向内一层一层地切取，不可掏洞取料。

实施实例2鼠李糖乳杆菌1.0320提高东北酸菜质量

东北酸菜常用的发酵剂为植物乳杆菌。其他株鼠李糖乳杆菌由于不耐酸，无法用于东北酸菜的发酵，本发明所述鼠李糖乳杆菌1.0320耐酸，因此可以和东北酸菜发酵剂混合使用。混合使用鼠李糖乳杆菌1.0320作为酸菜发酵剂，能够降低酸菜较长的发酵期内被杂菌污染的可能性，生产的酸菜不褐变、不烂帮，显著提高出菜率。

实施实例3鼠李糖乳杆菌1.0320减少仔猪腹泻

仔猪断奶后腹泻是一类常见疾病，一般采用抗生素治疗。本发明所述鼠李糖乳杆菌1.0320，耐酸高产细菌素，能够抑制致病性大肠杆菌，显著降低仔猪腹泻发生率。可以通过发酵液、菌粉的形式添加到仔猪饲料中，或喷洒至仔猪围栏附近，由于能够已知能够显著嫌少仔猪发生腹泻的问题。