ALDH18A1在结直肠癌的治疗和诊断中的应用的制作方法

本发明属于疾病诊断和治疗领域，具体涉及aldh18a1在结直肠癌的治疗和诊断中的应用。

背景技术：

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球每年初诊患者超过120万。根据美国癌症协会(americancancersociety，acs)资料，2018年新发病例约14万，占所有癌症病例的8.1％，死亡人数约5万，占癌症死亡人数的8.3％。目前，结直肠癌患者5年总体生存率为64.5％，约25％的患者在就诊时已出现转移，而发生转移的患者5年总体生存率仅为14％。传统的外科手术治疗以及辅助化疗，依然是结直肠癌患者的主要治疗方式。因此，寻找新的治疗靶点和策略，具有重要的临床意义。

肿瘤细胞通过改变自身代谢状态以适应细胞外微环境。同时，代谢异常又可调控众多基因表达，从而改变肿瘤细胞表型。其中，乙醛脱氢酶家族18成员a1(aldehydedehydrogenasefamily18membera1，aldh18a1)，又称为吡咯啉-5-羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylatesynthetase，p5cs)，在脯氨酸、鸟氨酸及谷氨酸代谢中发挥重要作用。研究表明，aldh18a1通过蛋白质合成代谢的调控，进而促进黑色素瘤细胞增殖，提示aldh18a1可能发挥促癌作用。然而，aldh18a1在结直肠癌患者中的临床病理学意义，目前尚不清楚。本研究利用tcga和geo数据库的基因表达信息以及结直肠癌组织芯片的免疫组化分析，探讨aldh18a1与结直肠癌临床病理参数和生存预后的关系，观察敲低aldh18a1对结直肠癌细胞增殖活性的影响以及与myc基因表达的关系，并进一步通过基因集富集分析(genesetenrichmentanalysis，gsea)评价aldh18a1与myc靶基因活化的关系，旨在为探索新的结直肠癌治疗靶点和策略提供实验依据。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供aldh18a1mrna或aldh18a1蛋白在作为治疗和诊断结直肠癌的标志物中的应用；本发明的目的之二在于提供检测aldh18a1mrna或aldh18a1蛋白的试剂在制备治疗和诊断结直肠癌的试剂盒中的应用；本发明的目的之三在于提供aldh18a1mrna的捕获剂或aldh18a1蛋白的捕获剂在制备治疗和诊断结直肠癌的试剂或试剂盒中的应用；本发明的目的之四在于提供下调aldh18a1表达的试剂和抑制aldh18a1活性的试剂在制备治疗结直肠癌的药物中的应用；本发明的目的之五在于提供下调aldh18a1表达的试剂和抑制aldh18a1活性的试剂在制备抑制结直肠癌细胞增殖活性的药物中的应用；本发明的目的之六在于提供下调aldh18a1表达的试剂和抑制aldh18a1活性的试剂在制备抑制myc基因表达的药物中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、aldh18a1mrna或aldh18a1蛋白在作为治疗和诊断结直肠癌的标志物中的应用。

2、检测aldh18a1mrna或aldh18a1蛋白的试剂在制备治疗和诊断结直肠癌的试剂盒中的应用。

3、aldh18a1mrna的捕获剂或aldh18a1蛋白的捕获剂在制备治疗和诊断结直肠癌的试剂或试剂盒中的应用。

优选的，所述aldh18a1mrna的捕获剂为特异识别aldh18a1mrna的引物或探针。

优选的，所述引物的核苷酸序列为seqidno.5和seqidno.6所示。

优选的，所述aldh18a1蛋白的捕获剂为抗aldh18a1蛋白的抗体。

优选的，所述抗aldh18a1蛋白的抗体为aldh18a1兔抗人多克隆抗体。

4、下调aldh18a1表达的试剂或抑制aldh18a1活性的试剂在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。

优选的，所述下调aldh18a1表达的试剂或抑制aldh18a1活性的试剂为aldh18a1shrna或aldh18a1sirna。

优选的，所述aldh18a1shrna的序列由如seqidno.1和seqidno.2杂交形成；所述aldh18a1sirna如seqidno.9、seqidno.10或seqidno.11所示。

6、下调aldh18a1表达的试剂或抑制aldh18a1活性的试剂在制备抑制结直肠癌细胞增殖活性的药物中的应用。

7、下调aldh18a1表达的试剂或抑制aldh18a1活性的试剂在制备抑制myc基因表达的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了aldh18a1在结直肠癌的治疗和诊断中的应用，通过数据库比较aldh18a1在人结直肠癌和正常结肠组织的表达，列联表分析aldh18a1与临床病理参数的相关性，kaplan-meier及cox回归分析aldh18a1的预后判断意义；mts检测下调aldh18a1表达对结直肠癌细胞增殖的影响；分析aldh18a1与myc基因表达之间的相关性；real-timepcr和westernblot检测敲低aldh18a1后myc基因的表达，gsea分析aldh18a1与myc下游靶基因活化的关系。结果发现aldh18a1在结直肠癌组织高表达，与其临床病理参数及预后相关；下调aldh18a1表达抑制结直肠癌细胞增殖；aldh18a1与myc表达正相关；下调aldh18a1抑制myc基因表达；aldh18a1高表达患者中，c-myc靶基因显著富集。因此aldh18a1可作为结直肠癌患者的预后判断因子，并可能通过下调myc基因表达而抑制结肠癌细胞的增殖，用于结直肠癌的治疗。

附图说明

图1为正常结肠组织和结直肠癌患者的aldh18a1mrna表达水平(a：p<0.01，与正常结肠组织比较)。

图2为免疫组化检测aldh18a1在不同原发肿瘤大小/蔓延范围结直肠癌组织的表达(a：免疫组化检测结果，代表性图片；b：aldh18a1定量分析结果(独立样本t检验，p＝0.0076)a：p<0.01，与t1+t2比较)。

图3为免疫组化检测aldh18a1在不同淋巴结转移状态结直肠癌组织的表达(a：免疫组化检测结果，代表性图片；b：aldh18a1定量分析结果(独立样本t检验，p＝0.0297)a：p<0.05，与n0比较)。

图4为免疫组化检测aldh18a1在不同ajcc临床分期结直肠癌组织的表达(a：免疫组化检测结果，代表性图片；b：aldh18a1定量分析结果(独立样本t检验，p＝0.0297)a：p<0.05，与i+ii比较)。

图5为aldh18a1高/低表达患者之间的预后差异(a：基于tcga结直肠癌数据库aldh18a1表达水平差异的kaplan-meier生存曲线；b：基于结直肠癌组织芯片aldh18a1表达差异的kaplan-meier生存曲线)。

图6为下调aldh18a1表达后结直肠癌细胞增殖活性的变化(a：ht29：对照组和aldh18a1敲低组，独立样本t检验，n＝6，p＝9.4306×10^-12；b：hct116：对照组和aldh18a1敲低组，独立样本t检验，n＝6，p＝3.0567×10^-14；a：p<0.01，与ht29对照组比较；b：p<0.01，与hct116对照组比较)。

图7为aldh18a1和myc在mrna水平的相关性(a：gse41258数据集结直肠癌患者aldh18a1与myc表达之间的相关性；b：myc高/低表达组的表达谱差异分析)。

图8为免疫组化分析aldh18a1和c-myc蛋白之间的相关性(a：结直肠癌组织芯片中aldh18a1与c-myc表达之间的相关性；b：免疫组化检测结直肠癌患者aldh18a1和c-myc的表达，代表性图片)。

图9为基于aldh18a1表达水平差异的gsea分析(a：正常结肠上皮细胞和结直肠癌细胞的aldh18a1、c-myc在蛋白水平的表达情况；b：下调aldh18a1表达后mycmrna的变化a：p<0.01，与sictr组比较；c：下调aldh18a1表达后c-myc蛋白的变化)。

图10为基于aldh18a1表达水平差异的gsea分析(a：hallmark_myc_targets_v1；b：hallmark_myc_targets_v2；c：dang_regulated_by_myc_up；d：dang_myc_targets_up)。

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、aldh18a1在结直肠癌中高表达并具有预后判断价值

(1)aldh18a1在结直肠癌组织中高表达

登录xenapublicdatahubs(http://xena.ucsc.edu/public-hubs/)下载结直肠癌rna测序数据(tcgacolonandrectalcancer，coadread)，芯片平台为illuminahiseq2000rnasequencingplatform；通过r数据包(affy1.42.3)下载geo数据库的gse41258数据集，芯片平台为affymetrixhumangenomeu133aarray，表达谱差异分析利用r语言包(limma3.20.9)。

整理gse41258数据集的表达数据，取aldh18a1中位表达量为临界值，分为aldh18a1高/低表达组，制作表型数据文件。gse41258数据集显示，与正常结肠组织(平均表达量8.237±0.0374，n＝103)相比，结直肠癌患者(平均表达量8.365±0.0296，n＝186)的aldh18a1mrna表达水平显著升高(独立样本t检验，p＝0.0088)(图1)。

(2)aldh18a1与结直肠癌临床病理参数密切相关

对结直肠癌患者的组织芯片(共90例)进行免疫组化染色，具体方法如下：样本烘烤30分钟后标准脱蜡处理，37℃过氧化氢阻断液内浸泡30分钟以阻断内源性过氧化氢酶，随后用pbs液洗涤3次，每次5分钟，放入枸橼酸抗原修复工作液中进行修复，血清封闭30分钟。之后加入aldh18a1兔抗人多克隆抗体(1:20)(abgent，美国)，4℃孵育过夜；第二天用pbs液洗涤3次，每次5分钟，滴加鼠兔通用二抗，37℃孵育30分钟；dab显色3-5分钟，苏木素复染细胞核30秒，酒精梯度脱水后置于二甲苯中透明，待晾干后用中性树胶封片。用光学显微镜下观察并拍照，采用image-pro-plus6.0软件定量分析aldh18a1累积光密度值。

并采用image-proplus软件对aldh18a1表达进行量化分析，发现aldh18a1与原发肿瘤大小蔓延范围(pt)、区域淋巴结转移(pn)以及ajcc(americanjointcommitteeoncancer，美国癌症联合委员会)临床分期等结直肠癌病理参数密切相关(表1及图2-4)。

表1、aldh18a1表达量与结直肠癌临床病理参数的关系

aldh18a1^low为aldh18a1低表达患者，aldh18a1^high为aldh18a1高表达患者，取aldh18a1中位表达量为临界值；p值采用continuity连续性校正公式所得。

(3)aldh18a1高表达的结直肠癌患者预后不良

将tcga结直肠癌数据库的结直肠癌患者进行基于aldh18a1表达差异的kaplan-meier生存分析(利用roc曲线确定临界值)，结果显示：aldh18a1低表达患者，其生存时间(中位生存时间2821天，n＝325)较aldh18a1高表达患者(中位生存时间1566天，n＝93)显著延长(log-rank检验，p＝0.0333)(图5a)。同时，基于结直肠癌患者组织芯片的免疫组化数据，发现aldh18a1低表达患者的预后(中位生存时间77.65月，n＝43)较高表达患者(中位生存时间52.39月，n＝46)显著延长(log-rank检验，p＝0.0021)，与tcga结直肠癌数据库分析结果一致(图5b)。

进一步对上述90例结直肠癌患者的预后预测因子进行单因素和多因素回归分析，结果提示aldh18a1在结直肠癌中具有显著的预后判断价值(风险比为1.996，95％置信区间为1.012～3.939，p＝0.046)(表2)。

表2、结直肠癌预后预测因素的单因素及多因素cox回归分析^a

aldh18a1^low为aldh18a1低表达患者，aldh18a1^high为aldh18a1高表达患者，取aldh18a1中位表达量为临界值。a：pn的自由度已由于线性相关协变量ajcc临床分期而降低；b：线性相关协变量ajcc＝pn

实施例2、shrna敲低aldh18a1基因的表达对结直肠癌细胞增殖活性的影响(1)细胞培养

人结直肠癌细胞系ht29、hct116以及正常结肠上皮细胞ncm460，采用含10％胎牛血清的dmem高糖培养基，置于37℃、5％co2、95％湿度的恒温培养箱中培养，隔日换液，3天～5天传代。

(2)aldh18a1shrna慢病毒包装及感染

采用分子克隆技术将aldh18a1shrna(5’-ccggccattatttgaccagatcattctcgagaatgatctggtcaaataatggtttttg-3’(seqidno.1)，5’-aattcaaaaaccattatttgaccagatcattctcgagaatgatctggtcaaataatgg-3’(seqidno.2))(sigma-aldrich，美国)构建到plvshrna-egfp慢病毒载体(英茂盛业，北京)中，命名为aldh18a1shrna。利用lipofectamine3000转染试剂(invitrogen，美国)将5μgaldh18a1shrna，3.75μgpspax2和1.25μgpmd2.g包装质粒转入5×10^-6生长状态良好的hek293t细胞，48小时后收取病毒上清加入ht29、hct116细胞中，置于37℃恒温培养箱中培养，6小时后换成新鲜培养基，流式细胞分选仪筛选egfp阳性细胞。mts检测，具体是将ht29、hct116细胞消化后，用含10％胎牛血清的dmem高糖培养基配成单细胞悬液，按1000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，每孔体积100μl，置于37℃、5％co2、95％湿度的恒温培养箱中培养24小时；第二天，每孔加入mts溶液10μl，继续孵育2小时；选择490nm波长，在分光光度计上测定各孔吸光度值，记录结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。结果发现，利用aldh18a1shrna下调其表达后，结直肠癌细胞的增殖能力显著抑制(图6)。

实施例3、aldh18a1表达与癌基因myc相关性

(1)aldh18a1和myc在mrna水平呈正相关

研究发现，几乎所有结直肠癌患者都有不同程度的myc基因表达失控，其在结直肠癌的恶性增殖、干性维持、癌性转化等方面扮演重要的角色。于是，我们接下来探讨aldh18a1对结直肠癌细胞增殖能力的调控，是否与myc基因有关。

提取结肠癌患者gse41258数据集中aldh18a1和myc的mrna表达量信息，采用real-timepcr检测aldh18a1和myc的mrna水平，具体方法如下：按照rnaisoplus说明书提取结肠癌患者细胞rna，利用nanodrop2000超微量分光光度计测量rna浓度。根据primescriptrtreagentkit(takara)说明书，将上述提取的rna反转录为cdna，并按照sybrpremixextaq^tmii说明书，取7.5μlsybrpremixextaq^tmii、1μlcdna、1μl上游引物、1μl下游引物、4.5μlddh2o，配制成15μlreal-timepcr反应体系。gapdh引物(上游：5’-acaactttgtatcgtggaagg-3’(seqidno.3)，下游：5’-gccatcacgccacagtttc-3’(seqidno.4))；aldh18a1引物(上游：5’-gcccttcaaccaacatcttct-3’(seqidno.5)，下游：5’-aggggtacagtgataaacggg-3’(seqidno.6))；myc引物(上游：5’-ggctcctggcaaaaggtca-3’(seqidno.7)，下游：5’-ctgcgtagttgtgctgatgt-3’(seqidno.8))。反应条件为：95℃30秒，1个循环；95℃5秒，60℃30秒，72℃30秒，40个循环；溶解曲线65.0℃～95.0℃，温度间隔0.5℃，每15秒读板一次。相关性分析结果提示：aldh18a1与myc的表达水平呈显著正相关(相关系数r＝0.3647，p＝1.0390×10^-13)(图7，a)。

同时，提取gse41258数据集中的myc基因表达值，并根据患者生存结局，利用roc曲线确定临界值，将结直肠癌患者分为myc高表达组和低表达组。表达谱差异分析结果显示，与myc低表达组相比，aldh18a1在myc高表达组的表达水平较高，差异显著(log2foldchange＝0.1947，p＝0.0149)(图7，b)，提示两者在mrna水平存在高度相关性。

(2)aldh18a1和myc在蛋白水平呈正相关

进一步，对结直肠癌组织芯片免疫组化结果进行aldh18a1和c-myc蛋白水平的量化分析，采用westernblot检测aldh18a1和c-myc的蛋白表达，具体方法如下：收集直肠癌患者细胞，加入适量m-per^tmmammalianproteinextractionreagent(thermoscientific，美国)，并按100:1加入蛋白酶抑制剂，吹打混匀后置于冰上裂解30分钟，之后4℃、14000转/分钟离心10分钟，提取上清，bca试剂盒测定蛋白浓度。随后加入适量蛋白上样缓冲液(5×)，混匀后金属浴加热至100℃，10分钟变性。配置电泳凝胶，蛋白上样量为50μg/孔。恒压电泳80v、40分钟，之后120v、45分钟，pvdf转膜100v、100分钟。将膜放入含5％脱脂奶粉的pbst中封闭1小时后孵育一抗，gapdh兔抗人多克隆抗体(1:1000)(cellsignalingtechnology，美国)、aldh18a1兔抗人多克隆抗体(1:1000)以及c-myc兔抗人单克隆抗体(1:1000)，4℃孵育过夜。pbst洗膜10分钟×3次，然后将膜放入1:3000的羊抗兔二抗(中杉金桥，北京)中，室温孵育1小时；pbst洗膜10分钟×3次，加入supersignalingtechnologyit\o"pe(thermoscientific，34095)，bio-rad凝胶成像仪显影。结果发现结直肠癌患者的aldh18a1和c-myc蛋白水平呈显著的正相关(相关系数r＝0.4278，p＝2.6000×10^-5)(图8)。

westernblot实验结果提示，与正常结肠上皮细胞ncm460相比，aldh18a1在结直肠癌细胞中表达明显较高。同时，c-myc的表达趋势与aldh18a1基本一致(图9，a)。

实施例4、下调aldh18a1对myc基因表达的影响

(1)下调aldh18a1基因表达显著抑制mycmrna水平

根据广州锐博生物设计合成的sirna干扰系列：sialdh18a1#1：5’-gttcgttcttggagcaaca-3’(seqidno.9)；sialdh18a1#2：5’-gaacctcaatggaacactt-3’(seqidno.10)；sialdh18a1#3：5’-gaagggatctgtcacatgt-3’(seqidno.11)，以及及产品使用说明书，分别将5μlsialdh18a1-1、sialdh18a1-2和sialdh18a1-3以及阴性对照，与5μl的lipofectaminernaimax(invitrogen，美国)转染试剂在200μl的opti-mem(gibco，美国)中混匀，室温孵育15分钟。同时，将ht29、hct116细胞消化后按(3-5)×10⁵/孔的密度接种于6孔板中，并加入上述混合液，置于37℃、5％co2、95％湿度的恒温培养箱中培养，转染48小时后收集细胞用于aldh18a1的mrna和蛋白表达水平的检测。

real-timepcr结果显示，sialdh18a1组与sictr组相比，其aldh18a1mrna水平显著下调(sictr组，1.0000±0.0856；sialdh18a1#1组，0.0985±0.0053；sialdh18a1#2组，0.1811±0.0060；sialdh18a1#3组，0.0758±0.0044。sictr组与sialdh18a1#1组相比，独立样本t检验，n＝4，p＝2.8687×10^-5；sictr组与sialdh18a1#2组相比，独立样本t检验，n＝4，p＝5.5047×10^-8；sictr组与sialdh18a1#3组相比，独立样本t检验，n＝4，p＝2.3631×10^-8)；而下调aldh18a1之后，mycmrna水平呈现同向变化(sictr组，1.0000变化(sictr组，1.0000±0.0502；sialdh18a1#1组，0.39635±0.0260；sialdh18a1#2组0.6403±0.0218；sialdh18a1#3组0.5696±0.0435。sictr组与sialdh18a1#1组相比，独立样本t检验，n＝4，p＝1.8975×10^-7；sictr组与sialdh18a1#2组相比，独立样本t检验，n＝4，p＝4.0000×10^-6；sictr组与sialdh18a1#3组相比，独立样本t检验，n＝4，p＝2.0000×10^-6)(图9，b)。

(3)下调aldh18a1表达显著降低c-myc蛋白水平

westernblot检测同样提示，sialdh18a1可显著降低aldh18a1蛋白水平，而c-myc与aldh18a1在蛋白水平上呈现同向变化：即下调aldh18a1，c-myc在蛋白水平同样出现显著性下降(图9，c)。

(4)aldh18a1高表达患者存在c-myc靶基因的活化

接下来，对gse41258数据集进行基因集富集分析(genesetenrichmentanalysis，gsea)，具体如下在gsea官方网站(http://software.broadinstitute.org/gsea)下载功能基因集文件：hallmark_myc_targets_v1、hallmark_myc_targets_v2、dang_regulated_by_myc_up和dang_myc_targets_up。完善参数设置，进行gsea分析，提取标准化富集得分(normalizedenrichmentscore，nes)、错误发现率(falsediscoveryrate，fdr)和p值(nominalpvalue)。结果显示，高表达aldh18a1的结直肠癌患者存在多个c-myc靶基因集的富集，包括：hallmark_myc_targets_v1(共含200个基因，其中152个基因显著富集，fdr＝0.0060，p＝0.0041)、hallmark_myc_targets_v2(共含58个基因，其中44个基因显著富集，fdr＝0.0359，p＝0.0425))、c-myc正向调控基因(dang_regulated_by_myc_up(含72个基因，其中39个基因显著富集，fdr＝0.0467，p＝0.0418)和dang_myc_targets_up(含143个基因，其中75个基因显著富集，fdr＝0.0040，p＝0.0041))(图10)。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>余时沧

<120>aldh18a1在结直肠癌的治疗和诊断中的应用

<160>11

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