本发明涉及基因检测
技术领域：
及生物信息学领域，具体涉及检测和分析幽门螺旋杆菌毒性及致病性的方法。
背景技术：
：幽门螺旋杆菌(helicobaeterpylori,hp)于1983年首次被发现以来，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。据统计，全世界人群中幽门螺旋杆菌的感染率达50％，我国的感染率高达60％-90％，幽门螺旋杆菌感染可导致慢性胃炎、胃溃疡、胃癌和和胃淋巴瘤等消化道疾病，而且随着时间的迁移，幽门螺旋杆菌的根除难度逐年增加，治疗失败的例数也越来越多。因此，检测分析患者体内幽门螺旋杆菌的基因特性至关重要。幽门螺旋杆菌基因组包含166万个左右的碱基对，超过1500个基因，其中2/3已鉴定生物学功能。其中，若干基因的功能与幽门螺旋杆菌感染的病理发生过程密切相关，包括定向移动、粘膜层穿透、上皮细胞表面定植、酸度中和、毒力蛋白分泌及感染机制、炎症反应诱导等(tombetal.,1997)。不同幽门螺旋杆菌菌株的基因组之间具有很强的遗传多样性，包括点突变、基因插入/删除、基因重排、基因重组等。致病基因在不同幽门螺旋杆菌菌株间的遗传多态性，是影响幽门螺旋杆菌致病性/感染性的最重要因素之一。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于，提供一种检测分析幽门螺旋杆菌的毒性及致病性的方法，能够通过对幽门螺旋杆菌菌株的一次检测来从整体上全面判断该菌株的毒性和解读该菌株的功能，对深入研究幽门螺旋杆菌的致病机制和指导幽门螺旋杆菌感染患者的个性化治疗都具有非常重大的意义。为解决上述技术问题，本发明提供的一种检测分析幽门螺旋杆菌的毒性及致病性的方法，技术方案为：对幽门螺旋杆菌目标菌株进行dna提取和全基因组序列检测，根据全基因组序列检测的结果进行全基因组测序数据数据分析和致病相关基因特异性分析；分析方法包括以下步骤：1)对所述致病相关基因进行分型分类；所述致病相关基因分为重要分型基因和其他致病相关基因；所述重要分型基因包括毒性相关基因a(caga)、空泡细胞毒素a(vaca)基因、膜外炎症蛋白a(oipa)基因和粘附相关脂蛋白ab(alpab)基因，其中，毒性相关基因a(caga)分为caga西方型和caga东方型，空泡细胞毒素a(vaca)基因分为s1/m1型、s1/m2型、s2/m1型、s2/m2型，膜外炎症蛋白a(oipa)基因分为on(开)型和off(关)型，粘附相关脂蛋白ab(alpab)基因分为alpab东方型和alpab西方型；所述其他致病相关基因包括iv型分泌系统(t4ss)基因、其他毒性基因致病岛上的基因(cagpai)、空泡蛋白vacb基因、膜外蛋白家族(omp)基因、尿素酶家族基因、鞭毛蛋白家族基因、胶原蛋白酶基因、十二指肠溃疡诱导基因、表皮接触诱导基因和adp-庚糖合成酶基因。2)根据全基因组序列检测的结果统计致病相关基因的reads数。具体步骤包括：用fastqc软件对测序下机的序列fastq的质量画图，然后用trimmomatic软件去除测序接头低质量碱基，保证序列的平均质量大于或等于q30；用bowtie2软件，将fastq文件比对到参考基因的序列上，生成bam文件；用picard软件对bam文件排序，然后去除重复序列；用samtools软件对经排序和去除重复序列后的bam文件进行比对结果的统计(全部reads数，匹配到hp基因上的总reads数，选定130多个基因的总reads数即目标总reads数)、测序位点深度的统计(目标基因位点的平均覆盖度)、以及选定130个基因比对上的reads数的统计(各个目标基因对应的reads数)。3)将重要分型基因分别统计比对到各自参考序列的百分比。具体包括:毒性相关基因a(caga)分别统计比对到参考序列caga阳性西方型、caga阳性东方型和caga阴性的reads的百分比；空泡细胞毒素a(vaca)基因分别统计比对到参考序列s1/m1、s1/m2、s2/m1、s2/m2的reads的百分比；膜外炎症蛋白a(oipa)基因分别统计比对到参考序列on型、off型的reads的百分比；粘附相关脂蛋白ab(alpab)基因分别统计比对到参考序列alpab西方型、alpab东方型的reads的百分比。4)对重要分型基因进行分型判定，对其他致病相关基因进行功能完整度判定，具体判断依据如下：a.“+”表示阳性，“-”表示阴性，即不存在；b.caga的毒性：东方型>西方型>–；vaca的毒性：s1/m1>s1/m2>s2/m1>s2/m2(-)；oipa的诱导炎症功能：on>off；alpab的诱导炎症功能：alpab东方型＞alpab西方型；其中，东方型或s1/m1或on占比≥60％时功能判定为毒性强或诱导炎症，东方型或s1/m1或on占比介于10％～60％之间时功能判定为毒性中等或部分诱导炎症，东方型或s1/m1或on占比≤10％时功能判定为毒性弱或不诱导炎症；c.其他致病相关基因中reads数≥10的基因的判定为“+”，reads数＜10的基因的判定为“-”。5)根据上述判定结果，对重要分型基因判断其毒性及功能意义解读，对其他致病相关基因判断其功能完整性及功能意义解读。具体的，在本发明提供的方法中，毒性相关基因a(caga)和空泡细胞毒素a(vaca)与幽门螺旋杆菌毒性有关，膜外炎症蛋白a(oipa)基因和粘附相关脂蛋白ab(alpab)基因与幽门螺旋杆菌诱导炎症功能有关。具体的，在本发明提供的方法中，对于iv型分泌系统(t4ss)基因，若iv型分泌系统(t4ss)基因的判定结果均为“+”，则iv型分泌系统(t4ss)功能完整，幽门螺旋杆菌向宿主细胞注射毒性蛋白a的功能正常；若iv型分泌系统(t4ss)基因的判定结果出现“-”，则iv型分泌系统(t4ss)功能不完整，幽门螺旋杆菌向宿主细胞注射毒性蛋白a的功能受影响；特别是，若iv型分泌系统(t4ss)基因的判定结果出现“-”且“-”出现在关键组分中，则iv型分泌系统(t4ss)功能不完整，幽门螺旋杆菌向宿主细胞注射毒性蛋白a的功能受损；对于其他毒性基因致病岛上的基因(cagpai)，若其他毒性基因致病岛上的基因(cagpai)的判定结果均为“+”，则辅助/保护caga蛋白注射入宿主细胞的功能正常；若其他毒性基因致病岛上的基因的判定结果出现“-”且出现在关键组分中，则辅助/保护caga蛋白注射入宿主细胞的功能不完整；对于空泡蛋白vacb基因，若判定结果均为“+”，则辅助性毒性蛋白功能正常；若判定结果为“-”，辅助性毒性蛋白功能受损；对于膜外蛋白家族(omp)基因，若膜外蛋白家族(omp)基因的判定结果均为“+”，则膜外蛋白功能正常，宿主免疫逃避幽门螺旋杆菌粘附宿主细胞的功能正常；若判定结果出现“-”，则膜外蛋白功能受影响；对于尿素酶家族(urease)基因，若尿素酶家族(urease)基因的判定结果均为“+”，则幽门螺旋杆菌中和酸度功能正常；若判定结果出现“-”，则幽门螺旋杆菌中和酸度功能受影响；对于鞭毛蛋白基因，若鞭毛蛋白基因的判定结果均为“+”，则幽门螺旋杆菌定向移动功能正常；若判定结果出现“-”，则幽门螺旋杆菌定向移动功能受影响；对于胶原蛋白酶基因，若判定结果为“+”，则幽门螺旋杆菌的穿透功能正常；若判定结果为“-”，则幽门螺旋杆菌穿透功能受损；对于表皮接触诱导基因，若判定结果为“+”，则幽门螺旋杆菌接触消化道表皮能力正常；若判定结果为“-”，则幽门螺旋杆菌接触消化道表皮能力受损；对于十二指肠溃疡诱导基因，若判定结果为“+”，则幽门螺旋杆菌诱导十二指肠溃疡能力正常；若判定结果为“-”，则幽门螺旋杆菌诱导十二指肠溃疡能力受损；对于adp-庚糖合成酶基因，若判定结果为“+”，则幽门螺旋杆菌诱导激活nf-kb转录因子能力正常；若判定结果为“-”，则幽门螺旋杆菌诱导激活nf-kb转录因子能力受损。优选的，在本发明提供的方法中，所检测的iv型分泌系统(t4ss)基因至少包括以下关键组分基因hp0522_cag3、hp0523_cag4、hp0524_cag5、hp0526_cag6、hp0527_cag7、hp0528_cag8、hp0530_cag10、hp0531_cag11、hp0532_cag12、hp0537_cag16、hp0539_cag18、hp0540_cag19、hp0541_cag20、hp0542_cag21、hp0543_cag22、hp0544_cag23、hp0546_cag25；进一步的，所检测的iv型分泌系统(t4ss)基因还可以包括hp0525、hp0529_cag9；其中，hp0522_cag3、hp0524_cag5、hp0526_cag6、hp0530_cag10、hp0531_cag11、hp0532_cag12、hp0537_cag16、hp0539_cag18、hp0540_cag19、hp0541_cag20、hp0542_cag21、hp0543_cag22、hp0544_cag23是caga蛋白转移所必需的；hp0523_cag4缺失会影响caga转移；hp0528_cag8失活会消除幽门螺旋杆菌将caga蛋白转移到胃细胞中的能力；hp0546_cag25缺失会导致细菌缺失caga蛋白的转运能力；所检测的其他毒性基因致病岛上的基因(cagpai)至少包括基因hp0545_cag24；进一步的，所检测的其他毒性基因致病岛上的基因(cagpai)还可以包括hp0520_cag1、hp0534_cag13、hp0535_cag14、hp0536_cag15、hp0538_cag17、hp0521_cag2、hp0441_virb4homologue、hp0017_virb4homologue、hp0459_virb4homologue；其中，hp0545_cag24是caga蛋白转移所必需的，并能刺激胃上皮细胞产生和分泌白细胞介素-8；所述空泡蛋白vacb基因是基因hp1248_vacb；该基因缺失，会导致多数基因上调，其中包括(caga,flab)，同时也表明该基因和细菌适应温度和ph值条件有关；所检测的膜外蛋白基因(omp)至少包括基因hp1564_abc_transporter_substrate-binding_protein、hp0009_omp1、hp0324_omp10、hp0472_omp11、hp0477_omp12、hp0671_omp14、hp0706_omp15、hp0722_omp16、hp0796_omp18、hp1125_omp18、hp0896_omp19、hp0923_omp22、hp1107_omp23、hp1113_omp24、hp1156_omp25、hp1157_omp26、hp1177_omp27、hp1342_omp29、p0079_omp3、hp1395_omp30、hp1469_omp31、hp1501_omp32、hp0127_omp4、hp0227_omp5、hp0229_omp6、hp0252_omp7、hp0317_omp9、hp0839_ompp1_p1；进一步的，所检测的膜外蛋白基因(omp)还可以包括hp0725_omp17、hp1243_omp28；其中，hp1564_abc_transporter_substrate-binding_protein、hp0324_omp10、hp0472_omp11、hp0477_omp12、hp0671_omp14、hp0706_omp15、hp0923_omp22、hp1107_omp23、hp1113_omp24、hp1156_omp25、hp1157_omp26、hp1342_omp29、p0079_omp3、hp1395_omp30、hp1469_omp31、hp1501_omp32、hp0227_omp5、hp0229_omp6、hp0252_omp7、hp0317_omp9、hp0839_ompp1_p1翻译的蛋白是外膜蛋白组成成分；hp0009_omp1参与幽门螺旋杆菌粘附到胃上皮细胞过程；hp0722_omp16与幽门螺旋杆菌的粘附相关；hp0725_omp17的缺失会减少宿主中性细胞的激活；hp0796_omp18、hp1125_omp18的蛋白在幽门螺旋杆菌感染宿主过程中引起的ifn-γ的调节中起到重要作用；hp0896_omp19的蛋白能在凝集素介导的作用下帮助幽门螺旋杆菌粘附到胃黏膜上；hp1177_omp27的蛋白与ceacam1结合物帮助毒性因子caga进入宿主细胞，增强白细胞介素-8的释放；hp0127_omp4的蛋白协助幽门螺旋杆菌粘附胃表皮；所检测的尿素酶家族(urease)基因至少包括基因hp0070_uree、hp0069_uref、hp0068_ureg、hp0067_ureh、hp0071_urei；进一步的，所检测的尿素酶家族(urease)基因还可以包括hp0072_ureb；其中，hp0070_uree缺失会导致其转移镍元素能力下降并且使得脲酶活性显著下降；hp0069_uref、hp0068_ureg、hp0067_ureh是将镍元素转移到脲酶活性位点的蛋白之一；hp0071_urei是幽门螺旋杆菌在胃部生存必要蛋白；hp0072_ureb是幽门螺旋杆菌保守蛋白之一，可以被作为抗体；所检测的鞭毛蛋白基因至少包括基因hp0601_flaa、hp0115_flab、hp0840_flaa1、hp1557_flie、hp1559_flgb、hp1558_flgc、hp1041_flha、hp1035_flhf、hp0770_flhb、hp1419_fliq、hp0173_flir、hp1420_flii、hp0870_flge、hp0908_flge、hp1119_hap1,flgk、hp0752_flid、hp0815_mota、hp0816_motb、hp0352_flig、hp1031_flim、hp0753_flis、hp0327_flag、hp0797_hpaa、hp0584_flin、hp0295_fla、hp1575_flhb、hp1030_fliy、hp0907_flgd、hp1274_pfla、hp0751_flag、hp0410_hpaa、hp1192、hp1462、hp0232；进一步的，所检测的鞭毛蛋白基因还可以包括hp0325_flgh、hp0351_flif、hp0246_flgi、hp1092_flgg、hp1585_flgg、hp0353_flih；其中，hp0601_flaa、hp0115_flab对幽门螺旋杆菌运动性起到重要的作用；hp0840_flaa1缺失会造成幽门螺旋杆菌的生长减慢；hp1557_flie、hp1559_flgb、hp1558_flgc缺失均会造成幽门螺旋杆菌菌株没有鞭毛也没有运动性；hp1041_flha、hp0770_flhb、hp1419_fliq、hp0173_flir与转移主要的鞭毛蛋白到鞭毛结构的尾部有关；hp1035_flhf与调节鞭毛的合成、及鞭毛运动性相关；hp1420_flii与驱动iii型鞭毛外排有关；hp0870_flge、hp0908_flge和鞭毛的驱动力紧密相关；hp1119_hap1,flgk与鞭毛组装的过程中控制鞭毛的长度有关；hp0752_flid与鞭毛组装过程中扮演鞭毛保护蛋白的角色有关；hp0815_mota、hp0816_motb与转动、修复鞭毛有关；hp0352_flig、hp1031_flim、hp0584_flin、hp1030_fliy与转移蛋白、调节鞭毛驱动引擎的转动和转化有关；hp0753_flis与防止鞭毛蛋白过早聚集并且参与鞭毛组装有关；hp0327_flag、hp0751_flag与极性鞭毛蛋白有关；hp0797_hpaa、hp0410_hpaa与在低ph值的条件下防止鞭毛蛋白亚基的降解有关；hp0295_fla与鞭毛钩连接蛋白有关；hp1575_flhb与外排蛋白的成分有关；hp0907_flgd与鞭毛钩蛋白的capping蛋白有关；hp1274_pfla与瘫痪的鞭毛表型有关；hp1192、hp1462、hp0232与参与鞭毛运动的蛋白有关；所述胶原蛋白酶基因是基因hp0169_prtc，hp0169_prtc会降低幽门螺旋杆菌对胃细胞生存和增殖的影响；所述表皮接触诱导基因是基因dupa，dupa和胃溃疡有密切的关系；所述十二指肠溃疡诱导基因是基因icea，icea与消化性溃疡疾病密切相关；所述adp-庚糖合成酶基因是基因rfae，rfae与幽门螺旋杆菌诱导激活nf-kb转录因子密切相关，并且使得肠胃上皮细胞分泌的il-8减少。具体的，在本发明的方法中，所述幽门螺旋杆菌目标菌株是经过体外提取和培养获得的幽门螺旋杆菌。具体方法是，通过对经尿素试验验证为阳性的胃粘膜样本进行菌株分离提取；对提取的hp菌株进行平板培养(微需氧)4-5天，接种后通过镜检和尿素酶实验挑选单克隆菌落再次培养到足够的量。该胃粘膜样本是由幽门螺旋杆菌阳性患者胃粘膜取样获得。具体的取样操作是，确认病人受检前停止服用抗生素一个月以上，停止服用质子泵抑制剂二周以上，停止服用中药二周以上，且经尿素呼气试验验证为阳性；在胃镜活检取样时应取胃窦与胃体病变部位，初治患者的幽门螺旋杆菌多分布于胃窦距幽门2-5cm处，补救治疗患者要同时采集胃底和胃体处样本；确认样本为新鲜无污染，无食物残渣遗留的胃黏膜组织标本。具体的，在本发明的方法中，所述全基因组序列检测具体包括建库和测序。本发明的方法具有以下优点：1.本发明的方法对幽门螺旋杆菌功能基因组进行整体全方位解析，尤其是对致病相关基因进行特异性分析，可以鉴定出关键致病基因的具体情况(哪种亚型，或者基因是否缺失)，有助于对该型菌株的毒力、感染性、致病性等指标进行量化解读，对深入理解hp致病机制及指导hp感染患者个性化治疗，对临床研究和教学都有非常重大的意义。2.本发明采用二代测序方法对hp进行全基因组测序，通过一次检测及结果分析对幽门螺旋杆菌目标菌株毒性及功能进行整体、全面的量化解读，能够从整体上准确地分析出该目标菌株的毒力、感染性、致病性等指标，能极大节约传统单个基因检测造成的时间、费用、工作量等大量成本。3.本发明的方法中包括了对幽门螺旋杆菌感染过程中涉及到的多组关键致病基因家族进行监测分析，具有很强的疾病学及临床指导意义4.本发明的方法的可扩展性强，可随着幽门螺旋杆菌基因组学研究的进一步深入，未来若发现新的致病基因，一旦生物学功能明确，可以随时扩充到本发明的基因列表中。5.本发明是首次将illumina公司的二代测序技术应用于人类胃黏膜样本中进行胃幽门螺旋杆菌体外克隆的全基因组检测。6.本发明运用创新性的检测方式和创新性的整合分析很好的诠释了致病基因的选取、致病基因多态性的确定以及致病基因功能注释数据库的建构等，具有非常强的原创性、独特性和唯一性。具体实施方式下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下为本发明检测幽门螺旋杆菌的一具体病例样本的操作过程和结果分析。1.取样1)确认病人(杨先生于2017年12月24日在郑州大学第五附属医院进行胃镜活检)受检前停止服用抗生素一个月以上，质子泵抑制剂二周以上，中药二周以上，且经尿素呼气试验(ubt)验证为阳性。2)确认采样的胃黏膜组织标本新鲜无污染，无食物残渣遗留。3)在胃镜活检取样时尽量取胃窦与胃体病变部位双份样本，各两块，共四块标本分别放入二个运送培养基试管内，并确认组织样本浸入运送培养基的液体中，拧紧试管盖，48小时内2-8度冷藏运输。4)初治患者的hp多分布于胃窦距幽门2-5cm处，补救治疗患者的hp会从胃窦转移到胃体和胃底，因此对后者要同时采集胃底和胃体处样本。5)多次根除治疗失败的患者，建议距上次治疗结束至少3个月，甚至更长(共识建议2个月)。2.菌株体外提取及培养2.1材料准备1)抗生素的配制准确称取tmp10mg，溶于10ml超纯水中，加乳酸一滴，并在水浴锅内煮沸10分钟，准确称取万古霉素20mg，多粘菌素10mg,两性霉素b10mg,将三种抗生素均匀混合，均匀摇晃并加入超纯水定容至20ml,并用0.22um过滤器过滤除菌，分装于2ml冻存管内，-20℃保存备用。2)哥伦比亚血琼脂平板的配置(200ml，加抗生素)称取7.8g哥伦比亚血琼脂粉末倒入三角烧瓶内，加入186ml超纯水，使用微波炉高火加热1分钟，充分摇晃使其完全溶解，使用高压灭菌锅在121℃高压15分钟灭菌，高压后待温度下降至70℃左右，取出放入55℃恒水浴箱，待降温至55℃左右，先加入2ml抗生素，再加入14ml羊血，充分混匀，用移液枪量取15ml哥伦比亚血琼脂缓缓加入平板中，匀速加入避免泡泡出现，室温进行冷却。3)冻存保存液的配置①心脑浸液冻存液：称取3.7g心脑浸液粉末加入80ml超纯水内，再加入20ml甘油，使用高压灭菌锅在121℃高压15分钟灭菌，然后进行分装至2ml冻存管，-20℃保存备用。②蛋白胨水保存液：称取1g蛋白胨粉末加入80ml超纯水内，再加入20ml甘油，使用高压灭菌锅121℃高压15分钟灭菌，然后进行分装至2ml冻存管，-20℃保存备用。③按照心脑浸液冻存液：蛋白胨水保存液：混有菌株的生理盐水，比例为2:3:5，-80度保存。2.2实验操作1)使用保存管配套一次性接种棒将胃黏膜标本分别直接接种在二块哥伦比亚血琼脂培养基上，并进行标识胃窦与胃体，接种时直接将胃粘液面与培养基接触，小面积将胃黏膜涂匀，并倒入少许保存液，进行旋转涂匀，再将胃黏膜样本取出加入至尿素酶管里，进行尿素酶反应，观察试剂颜色发生变化时间，24h内若由正常的淡黄色变为粉红色即为阳性，表示有幽门螺旋杆菌存在，否则为阴性。2)哥伦比亚血琼脂平板盖上平板盖后，倒置放入三气培养箱内，在微需氧环境(5％o2，10％co2，85％n2)温度在37℃培养3-4天。细菌然后通过形态观察(革兰氏染色)以及生化反应如尿素酶、氧化酶及触酶等来鉴定。培养4天后观察平板，进行氧化酶试验，用氧化酶滤纸条分别蘸取平板菌落，滤纸顶端如立刻出现紫色，继而逐渐加深，证明该菌落为幽门螺旋杆菌，阴性不变色。挑取饱满及清晰的幽门螺旋杆菌转接至另一块哥伦比亚血琼脂平板内在三气培养箱内进行二代培养2-3天，将所有生长在哥伦比亚血琼脂平板二代的菌落进行收集加入至冻存保存液，选取一些进行尿素酶实验并涂于玻片上进行革兰氏染色，确认其幽门螺旋杆菌生长状态与形态，将菌株冻于-80℃冰箱内进行保存，以备后面做全基因组测序使用。3.dna提取使用magenhipurebacterialdnakits进行细菌dna抽提。1)吸取500ul菌株冻存液至1.5ml离心管中，10,000xg离心1分钟收集细菌，缓慢吸取400ul上清液丢弃。2)加入200μlbufferste和10μllysozyme至1.5ml离心管中，充分震荡重悬细菌，在37℃反应10分钟。3)加入220μlbufferdl和10μlproteinasek至1.5ml离心管中，充分震荡混匀，在65℃消化反应30分钟。4)加入5μlrnasesolution至1.5ml离心管中，充分震荡混匀，室温25℃反应30分钟。5)加入220μl无水乙醇至1.5ml离心管中，充分震荡混匀30秒。6)把hipuregdnamicrocolumn装在2ml收集管中，将1.5ml离心管内液体全部加入，10,000xg离心1分钟。7)倒弃废液，把柱子装回收集管中。加入500μlbuffergw1至柱子上。10,000xg离心1分钟。8)倒弃废液，把柱子装回收集管中。加入650μlbuffergw2至柱子中。10,000xg离心1分钟。9)倒弃废液，把柱子装回收集管中。加入650μlbuffergw2至柱子中。10,000xg离心1分钟。10)倒弃废液，把柱子装回收集管中。10,000×g离心2分钟，丢弃2ml收集管。11)将柱子装在新的1.5ml离心管中。加入30μl预热至65℃bufferte至柱子膜中央。放置1分钟，10,000×g离心1分钟。12)丢弃柱子，将1.5ml离心管保存在4℃冰箱。13)使用yeasondsdnahsassaykitfor在thermoqubit3.0仪器上进行荧光染料定量，取dna总量为10ng定容至50ul于0.6ml离心管内，准备进行片段打断。4.建库1)选用试剂hieffngstmmaxupiidnalibraryprepkitforhieffngstmsingle-indexedadapterkitforset1，与hieffngstmdnaselectionbeads等试剂进行ngs建库。2)使用diagenodepico仪器进行超声片段打断，选择300bp片段程序，cyclecondition(on/offcycletime)30”/90”，cyclenumber6次。3)吸取50uldna至0.2mlpcr管内，加入6ulendprepbuffer和4ulendprepenzyme，震荡混匀并短暂离心，进行末端修复/da尾添加，在pcr仪上运行，30℃反应20分钟，72℃反应20分钟，4℃恒温。4)加入30ulligationenhancer，5ulquickt4dnaligase和5uldnaadapter，震荡混匀并短暂离心，进行接头连接，20℃反应30分钟，4℃恒温。5)吸取已充分震荡混匀的60μlhieffngstmdnaselectionbeads加入0.2ml离心管内，震荡混匀并短暂离心，室温25℃反应5分钟。6)将pcr管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，吸附5分钟后小心吸取150ul至新0.2ml离心管内，加入上清20μlhieffngstmdnaselectionbeads加入0.2ml离心管内，震荡混匀并短暂离心，室温25℃反应5分钟。7)保持pcr管始终置于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后，小心移除上清。8)重复步骤6，总计漂洗两次。9)保持pcr管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。10)将pcr管从磁力架中取出，加入适量22μlddh2o，震荡混匀并短暂离心，室温25℃反应5分钟。11)将pcr管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。吸附5分钟后小心转移20μl上清至新的0.2ml管中。12)加入25ul2×supercanacetmhigh-fidelitymix和5ulprimermix震荡混匀并短暂离心，在pcr仪上运行98℃反应1分钟，8个循环(98℃反应10秒，60℃反应30秒，72℃反应30秒)，72℃反应5分钟，4℃恒温。13)吸取已充分震荡混匀的40μlhieffngstmdnaselectionbeads加入0.2ml离心管内，震荡混匀并短暂离心，室温25℃反应5分钟。14)将pcr管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，吸附5分钟后小心丢弃上清。15)保持pcr管始终置于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后，小心移除上清。16)重复步骤6，总计漂洗两次。17)保持pcr管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。18)将pcr管从磁力架中取出，加入适量15μlddh2o，震荡混匀并短暂离心，室温25℃反应5分钟。19)将pcr管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。吸附5分钟后小心转移20μl上清至新的1.5ml管中。20)使用agilent2100dna1000chip进行质量检测，确认片段范围及浓度。5.测序1)使用公式(concentrationinng/μl)/(660g/mol×averagelibrarysize)×106＝concentrationinnm稀释样本浓度至4nm。2)取5ul4nm样本与5ul0.2nnaoh充分混匀后，室温放置5分钟进行双链裂解，加入990ulht1buffer稀释至20pm,从20pm溶液中吸取800ul加入200ulht1buffer中，最终上机浓度为16pm。3)吸取10nmphixlibrary(2μl)加入10mmtrisph8.5(3μl)，混分混匀，加入5ul0.2nnaoh充分混匀后，室温放置5分钟进行双链裂解，加入990ulht1buffer稀释至20pm,从20pm溶液中吸取800ul加入200ulht1buffer中，最终上机浓度为16pm。4)各吸取300ul样本与300ul标准品进行混合，加入测序试剂中，使用illuminaexperimentmanager软件进行上机表格制作，使用miseqreagentkitv3,300-cycles在miseq测序仪上选取测序模式为2*150bp，运行24小时进行二代测序工作。6.全基因组测序数据数据分析1)根据全基因组检测结果统计和致病密切相关的基因reads数，具体包括：用fastqc软件对测序下机的序列fastq的质量画图，然后用trimmomatic软件去除测序接头低质量碱基，保证序列的平均质量大于或等于q30；2)用bowtie2软件，将fastq文件比对到参考基因的序列上，生成bam文件；3)用picard软件对bam文件排序，然后去除重复序列；4)用samtools软件对排序和去完重复序列的bam文件进行比对结果的统计(全部reads数，匹配到hp基因上的总reads数，选定130多个基因的总reads数即目标总reads数)，测序位点深度的统计(目标基因位点的平均覆盖度)还有选定130个基因比对上的reads数的统计(各个目标基因对应的reads数)。测序数据统计分析见表1。7.致病基因特异性分析1)对致病相关基因reads数分别统计比对到参考序列的百分比，具体包括:caga分别统计比对到参考序列caga阳性西方型，caga阳性东方型和caga阴性reads的百分比；vaca分别统计比对到参考序列s1/m1,s1/m2,s2/m1,s2/m2的reads的百分比；oipa分别统计比对到oipa基因on和off序列的reads百分比；alpab分别统计比对到alpab西方型和alpab东方型的reads百分比；其他致病基因分别统计比对到参考序列的百分比。2)对重要分型基因进行分型判定，对其他致病基因进行功能完整度判定，具体判断依据如下：a.+表示阳性；–表示阴性，即不存在；b.caga的毒性：东方型>西方型>–；vaca的毒性：s1/m1>s1/m2>s2/m1>s2/m2(-)；oipa的诱导炎症功能：on>off；alpab的诱导炎症功能：东方型＞西方型；其中，caga的东方型或vaca的s1/m1或oipa的on或alpab的东方型占比≥60％时功能判定为毒性强或诱导炎症，caga的东方型或vaca的s1/m1或oipa的on或alpab的东方型占比介于10％～60％之间时功能判定为毒性中等或部分诱导炎症，caga的东方型或vaca的s1/m1或oipa的on或alpab的东方型占比≤10％时功能判定为毒性弱或不诱导炎症；c.reads数大于等于10的基因判定为“+”，小于10的基因判定为“-”；3)根据上述判定结果对其进行功能意义的解读，具体包括对重要分型基因判断其毒性，对其他致病相关基因判断其功能完整性及意义解读。毒性相关基因a(caga)、空泡细胞毒素a(vaca)基因、膜外炎症蛋白a(oipa)基因和粘附相关脂蛋白ab(alpab)基因的基因分型统计及判定见表2-4。其他检测基因统计分析及判定见表6。表1测序数据统计分析表2毒性相关基因a(caga)基因分型统计西方型(weastern)东方型(eastern)-total判定结果临床意义94.17％5.83％0.00％100.00％西方型为主毒性弱表3空泡细胞毒素a(vaca)基因分型统计s1/m1s1/m2s2/m1s2/m2-total判定结果临床意义94.84％5.16％//100.00％s1/m1毒性强表4膜外炎症蛋白a(oipa)基因分型统计onofftotal判定结果临床意义100.00％0.00％100.00％on诱导炎症表5粘附相关脂蛋白ab(alpab)基因分型统计西方型(weastern)东方型(eastern)total判定结果临床意义19.56％80.44％100.00％东方型为主诱导炎症表6其他检测基因统计分析采用本发明的方法，通过一次检测及分析，能够对幽门螺旋杆菌目标菌株的毒性及功能进行整体而全面的量化解读，能够准确地分析出该目标菌株的毒力、感染性、致病性等指标。尤其是针对幽门螺旋杆菌目标菌的重要分型基因如毒性相关基因a(caga)、空泡细胞毒素a(vaca)基因、膜外炎症蛋白a(oipa)基因和粘附相关脂蛋白ab(alpab)基因，能够快速准确的鉴定各种亚型或者基因是否缺失，并分析其毒性及功能，针对其他致病相关基因如iv型分泌系统(t4ss)、其他毒性基因致病岛上的基因(cagpai)、空泡蛋白vacb基因、膜外蛋白家族(omp)、尿素酶家族、鞭毛蛋白家族、胶原蛋白酶基因、十二指肠溃疡诱导基因、表皮接触诱导基因和adp-庚糖合成酶基因，能够高通量的判定各基因的检测结果并解读幽门螺旋杆菌各项功能，对于在临床研究和教学研究中深入理解hp致病机制及指导hp感染患者个性化治疗都有非常重大的意义。综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。当前第1页12