一种用于评价烟草烟气诱发炎症反应程度的体外细胞共培养模型的构建方法、评价方法与流程

本发明涉及一种用于评价烟草烟气诱发炎症反应程度的体外细胞共培养模型的构建方法、评价方法，属于烟草及卷烟烟气安全性评价技术领域。

背景技术：

吸烟时烟雾能引起气管以及肺部的炎症，烟气冷凝物(cigarettesmoke，cs)可以在呼吸道造成组织损伤，这种损伤涉及cs诱导的气道疾病和相关肺部疾病的发展，如慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，copd)，气道上皮细胞是cs的主要靶点。目前大多数研究体外快速copd风险模型评估的方法是模仿肺细胞对cs的反应，很大一部分研究使用肺泡、支气管和气道上皮细胞系统。例如使用上皮细胞(小鼠肺泡ii型上皮细胞、支气管上皮细胞)或细胞转化的细胞系。copd患者的气道有炎性细胞，包括中性粒细胞、巨噬细胞、t淋巴细胞和树突状细胞。其中，巨噬细胞被认为是慢性阻塞性肺病的主要细胞类型之一，它在copd的病理生理过程中起着重要作用。

许多研究已经证明病理改变和紊乱的免疫系统之间紧密联系，尤其是和单核巨噬细胞系统之间的联系更为紧密。巨噬细胞是一种白细胞，它参与了炎症的发生和发展，并通过吞噬、抗原表达和免疫调节等功能对组织进行修复和重塑。研究证实，吸烟者肺中m2表型的极化水平增强，copd患者更高，这表明m2巨噬细胞在吸烟诱导的copd的发病机制中起着至关重要的作用。

有研究通过巨噬细胞吞噬贫铀颗粒，吞噬后的巨噬细胞上清作用于支气管上皮细胞，来观察炎症反应程度，然而，细胞培养上清处理肺上皮细胞和支气管上皮细胞均不足以被用来评估copd的炎症过程。当气道上皮细胞受到cs刺激时，巨噬细胞和受损的气道上皮细胞之间的相互作用关系及机制如何，目前也鲜见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于评价烟草烟气诱发炎症反应程度的体外细胞共培养模型的构建方法。该方法可以更好的模拟机体内的生理环境，用来评估疾病风险。

本发明还提供一种用于评价烟草烟气诱发炎症反应程度的方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于评价烟草烟气诱发炎症反应程度的体外细胞共培养模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)将beas-2b细胞置于共培养板的上室中培养，然后进行染毒处理；

(2)将染色后的巨噬细胞置于共培养板的下室，和步骤(1)中染毒处理后的beas-2b细胞进行共培养，得到体外细胞共培养模型。

步骤(1)中beas-2b细胞置于共培养板的上室中培养所用的培养基包括bebm基础培养基和细胞因子。

上述细胞因子包括bpe、hydrocortisone、hegf、epinephrine、insulin、transferrin、triiodothyronine、retinoicacid、ga中的至少一种。

步骤(1)中染毒处理的操作包括以下步骤：

a、收集待测烟的烟气冷凝物，于溶媒中充分溶解，得到染毒母液；

b、将染毒母液加入beas-2b细胞的培养基中，得到染毒液；

c、将染毒液加入共培养板的上室中，对beas-2b细胞进行染毒。

步骤c中染毒的时间为1.5～2.5h。

步骤c中染毒液浓度范围为0～400μg/ml。

步骤(2)中所述的巨噬细胞为人肺巨噬细胞。

步骤(2)中共培养的时间为0.5～10h。

步骤(2)中所述的对巨噬细胞进行染色处理，包括如下步骤：

1)用cfdase细胞标记液悬浮步骤(1)培养得到的巨噬细胞，置于离心管内；

2)向步骤1)所述的离心管中加入cfdase细胞储存液混匀得到混合液；

3)将上述混合液放置在co2培养箱中37℃孵化10min；

4)孵化结束后即刻加入培养巨噬细胞所用的dmem高糖复合培养基，混匀后离心，去上清液；

5)用步骤4)所述的dmem高糖复合培养基重复洗涤2～3次，之后再加入步骤4)所述的dmem高糖复合培养基，混匀，置于步骤3)所述的培养箱中孵化5min，以促进染色效应；

6)取出后再次离心，去上清液，加入步骤4)所述的dmem高糖复合培养基，混匀；

7)在荧光显微镜下观察染色效果，进行正常的细胞培养；

整个过程在避光条件下进行。

上述用于评价烟草烟气诱发炎症反应程度的体外细胞共培养模型是基于beas-2b细胞需要气液界面培养，巨噬细胞在炎症刺激下游走的特性而研发的体外风险暴露模型。气液界面(airliquidinterface，ali)的培养通常用于气道上皮在离体培养时产生顶面—底侧极性极化，beas-2b细胞进行气液界面(air-liquidinterface，ali)培养，为cs染毒研究提供良好的细胞模型。该模型的建立在帮助人类进一步了解空气污染对人体健康的影响方面有很大的促进作用，对人类认识特定的copd发病原因方面也有一定的帮助，同时也适用于其它与香烟相关的威胁人类健康的疾病的研究。

一种用于评价烟草烟气诱发炎症反应程度的方法，包括以下步骤：

(1)将beas-2b细胞置于共培养板的上室中培养，然后进行染毒处理；

(2)将染色后的巨噬细胞置于共培养板的下室中，与步骤1)中染毒处理的beas-2b细胞进行共培养；

(3)选取评价指标，划分评价等级标准；

(4)评价烟草烟气诱发炎症反应的程度。

上述用于评价烟草烟气诱发炎症反应程度的方法，步骤(1)中染毒处理的操作为：

a、收集待测烟的烟气冷凝物，于溶媒中充分溶解，得到染毒母液；

b、将染毒母液加入beas-2b细胞的培养基中，得到染毒液；

c、将染毒液加入共培养板的上室中，对beas-2b细胞进行染毒。

步骤(3)中所述的选取评价指标为从细胞水平和蛋白表达水平方面选取评价指标。

上述从细胞水平选取评价指标具体为细胞数目的测定。

上述从蛋白表达水平选取评价指标具体为il-6炎症因子的表达量的测定。

上述il-6炎症因子的表达采用elisa方法进行检测，根据产品说明书配制标准品，设置不同的标准品浓度梯度。按照试剂盒步骤操作，通过用酶标仪450nm的波长读值分析计算。

本发明的有益效果：

本发明将beas-2b细胞通过染毒液染毒处理，同时对人肺巨噬细胞进行染色处理，通过构建染毒处理的beas-2b细胞和人肺巨噬细胞的共培养模型，来评估慢性阻塞性肺疾病的cs暴露的风险以及特定的copd的病因，相比于单独的气道上皮细胞培养，beas-2b细胞和人肺巨噬细胞的共培养体系能更好的模拟机体内的生理环境，能为烟气引发的炎症反应程度的评价提供有力的支持。

本发明的评价方法也适用于其它与香烟相关威胁人类健康的疾病的评估。

附图说明

图1为技术方案流程图；

图2为beas-2b细胞在不同染毒液浓度下的生存率；

图3为巨噬细胞培养及染料染色；

图4为beas-2b染毒后共培养下室巨噬细胞游走至上室的荧光及进入上室的巨噬细胞数量；

图5为cs染毒后炎症因子il6水平的表达差异。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。

1、实验材料：humanbronchialepithelialcellline(beas-2b)和人肺巨噬细胞系。其中beas-2b细胞购自americantypeculturecollection(manassas，va，usa)；人肺巨噬细胞购自cellbio公司(cbr-130027)；人肺巨噬细胞的染色所用的试剂盒(cfdase细胞增殖与示踪检测试剂盒)购自南京恩晶生物科技有限公司，使用方法严格按照说明书进行。

2、主要实验器材：转盘式吸烟机、生物安全柜、co2培养箱、96孔板、corning6孔transwell(8μm)、移液器、实时荧光定量pcr仪、酶标仪。

3、实施例的共培养体系具体为transwell共培养系统，共培养系统的膜孔径大小为5～8μm。

4、荧光细胞计数用imagej软件；pcr和elisa数据分析用prism5.0统计分析并作图。

实施例1

本实施例用于评价烟草烟气诱发炎症反应程度的体外细胞共培养模型的构建方法，包括以下步骤：

技术方案流程图如图1所示。

1、培养基的配制

(1)beas-2b细胞培养基为begmbulletkit培养基(cc-3171)，购自lonza公司，使用方法按照说明书进行。

(2)巨噬细胞培养基为dmem高糖复合培养基，配制方法为：将90％dmem高糖培养基(dmem高糖培养基购自hyclone公司，货号为sh30022.01b)和10％胎牛血清以9:1的体积比例混合，再加入总体积比1％的青链霉素摇匀，分装，-20℃环境下保存。

2、细胞的培养和传代

beas-2b细胞的培养和传代：

(1)beas-2b细胞的培养：在细胞培养室，无菌条件下提前向15ml离心管中以及100×20mm培养皿内加入5ml细胞培养基，放入37℃co2培养箱中预热。之后将细胞液加入到离心管中，混匀后离心，吸去上清液，用1ml培养基混匀细胞沉淀，吸取加入到培养皿内，光镜下观察细胞形态，放入培养箱中培养，定时从培养箱中取出培养皿，光镜下观察。培养48小时左右，吸去旧培养基，用dpbs冲洗培养皿，加入5ml新的培养基。

(2)beas-2b细胞的传代：提前准备0.05％的胰蛋白酶1ml，室温预热。吸去原培养皿内的旧培养基，dpbs清洗两遍后加入准备好的胰蛋白酶，光镜下观察到beas-2b细胞由贴壁状态转变为漂浮状态时，迅速用3ml含血清的bebm培养基中和胰蛋白酶，转移液体至离心管中离心，去上清液。用2ml培养基重悬，均分到准备好的含有5ml培养基的培养皿内，观察培养。

人肺巨噬细胞的培养和传代：

(1)巨噬细胞的培养：在细胞培养室，无菌条件下提前向15ml离心管中以及50ml细胞培养瓶内加入5ml细胞培养基，放入37℃co2培养箱中预热。之后将细胞液加入到离心管中，混匀后离心，吸去上清液。用1ml培养基混匀细胞沉淀，吸取加入到细胞培养瓶内，光镜下观察细胞形态，放入培养箱中培养，定时从培养箱中取出培养瓶，光镜下观察。在瓶内培养基呈现橙黄色，细胞增殖旺盛条件下，向瓶内加入5ml培养基。

(2)巨噬细胞的传代：光镜下观察到巨噬细胞增殖到一定程度。提前在三个50ml培养瓶内分别加入5ml细胞培养基，放入37℃co2培养箱中预热。将原培养瓶内细胞液吸入到15ml离心管中，离心，去上清液。用3ml细胞培养基混匀，均分到三个培养瓶内，观察培养。

3、染毒物质的制备

cs的制备和收集：cs是3r4f主流标准烟，使用吸烟机提取烟气冷凝物，将收集好的烟气冷凝物用10mg/ml的dmso充分溶解，得到10mg/ml的烟气冷凝溶液，即染毒液母液，冻存在-80℃环境下备用。

4、细胞的处理

(1)beas-2b细胞的染毒：在六孔transwell共培养板的上层每孔接种4×10⁵成熟beas-2b细胞，配制3r4f染毒液，为了模式共培养染毒液，将3r4f染毒液用bebm培养基稀释成不同的浓度，通过检测不同浓度下细胞的生存率，选择生存率在80％以上的染毒液浓度，作为共培养系统中beas-2b的最佳染毒浓度，3r4f染毒液稀释浓度为0-400μg/ml，具体稀释浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml，如图2所示。

其中，图2a的横坐标1-6分别表示染毒液浓度为0、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml，图2b的横坐标1-3分别表示染毒液浓度为0、100μg/ml、300μg/ml。通过不同浓度稀释下细胞存活率的结果最终选定300μg/ml为最佳染毒浓度。

染毒液用bebm培养基进行稀释至300μg/ml，吸去需要染毒细胞的旧培养基，加入2ml新培养基于共培养板的下室，1ml染毒液于共培养板的上室，在培养箱中培养2h(1.5～2.5h均可)。

(2)人肺巨噬细胞的染色：

1)用1mlcfdase细胞标记液悬浮5×10⁶个成熟巨噬细胞，置于15ml离心管中。

2)用cfdase细胞标记液将cfdase细胞储存液(1000×)稀释至2×。

3)将1mlcfdase细胞储存液(2×)加入到步骤1)中的15ml离心管中，轻轻混匀。

4)将离心管放置在37℃co2培养箱中孵化10min，取出后即刻加入10mldedm高糖复合培养基，混匀后离心，去上清液，重复用5ml(5～10ml均可)dedm高糖复合培养基洗涤。

5)再加入5ml(5～10ml均可)dedm高糖复合培养基，混匀，置于37℃co2培养箱中孵化5min，以促进染色效应，取出后再次离心，去上清液，加入5ml高糖复合培养基，混匀。

6)在荧光显微镜下观察(如图3所示)，进行正常的细胞培养。

整个过程在避光条件下进行。

5、beas-2b细胞与人肺巨噬细胞的共培养

beas-2b细胞与人肺巨噬细胞共培养：将六孔transwell共培养板编号为1，2，3，4，5，control六组。实验设计：1组共培养40min，2组共培养80min，3组共培养120min，4组共培养160min，5组共培养200min，control组共培养240min，其中control组不染毒，其余五组均染毒，染毒浓度为300μg/ml。根据上述不同培养时间的荧光效果选取最佳培养时间为2h。

将上述共培养系统进行共培养2h之后取出，将相应实验孔上室的染毒液和下室的培养基吸出，在共培养系统上下室加入2ml含1％fbs的新的bebm培养基，下室再加入1/6×5×10⁶已经染色的成熟巨噬细胞，放入培养箱中进行共培养，在荧光显微镜下拍摄上室的荧光图片。

实施例2

用于评价烟草烟气诱发炎症反应程度的方法，包括以下步骤：

步骤1-4同实施例1。

5、巨噬细胞与beas-2b细胞共培养

巨噬细胞与beas-2b细胞共培养：将六孔共培养板编号为1，2，3，4，5，control六组。实验设计，1组共培养40min，2组共培养80min，3组共培养120min，4组共培养160min，5组共培养200min，control组共培养240min，其中control组不染毒，其余五组均染毒，染毒浓度为300μg/ml。根据上述不同培养时间的荧光效果选取最佳培养时间为2h。

培养相应时间后将六孔共培养板取出，在荧光显微镜下拍摄上室的荧光图片(结果如图4a所示)从图4a可以看出，染毒浓度为300μg/ml时下室巨噬细胞游走到上室的数量明显高于control组，表明上室beas-2b细胞在染毒液的作用下可以促进巨噬细胞的向上迁移，从而保护气道上皮细胞。

经细胞计数，检测巨噬细胞进入上室的数量，结果如图4b所示，其中横坐标1-4分别表示control组1、control组2、300μg/ml-1、300μg/ml-2，其中，control组1和control组2为两个平行对照组，300μg/ml-1和300μg/ml-2为染毒液浓度为300μg/ml的两个平行实验组。

从图4b可以看出染毒液浓度为300μg/ml的两个实验组进入上室的巨噬细胞的数量明显高于control组1和control组2。

6、elisa：按100ul/孔加入细胞共培养上清液样品至样品孔，设置空白孔，同时制作标准曲线，封板膜封板，37℃温育90min。300ul/孔洗板三次后，100ul/孔加入稀释后的生物素化的抗体，盖上封板膜，37℃温育90min。洗板三次后100ul/孔加入稀释后的streptavidin-hrp，盖上封板膜，放在湿盒中，37℃温育30min，洗板三次后，100ul/孔加入tmb，显色15min后，迅速100μl/孔加入终止液，通过酶标仪用450nm的波长读值，结果如图5所示。

从图5可以看出染毒液浓度为300μg/ml时il-6炎症因子的蛋白表达水平明显高于对照组。

本申请完成了beas-2b和人肺巨噬细胞系的共培养，并对beas-2b暴露于cs培养，cs暴露浓度300μg/ml，beas-2b细胞气液界面培养染毒后，可以吸引下室共培养的巨噬细胞向上室迁移，并且elisa检测炎症因子il-6浓度实验组与对照组相比具有显著性差异。

该方法可以适用于卷烟主流烟气、侧流烟气、环境烟气等烟气气溶胶的体外暴露模型。