一株过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用与流程

本发明涉及一株过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术：

生物被膜又被称为生物膜，是细菌为在环境中更好生长和繁殖的生存形式。生物膜的形成分为四个阶段：吸附，增值，成熟和分散，分散出来的细胞再次进入第一个阶段如此以往的循环，其中吸附时期分为可逆与不可逆阶段。在生物膜形成过程中细胞分泌出胞外物质，其中主要成分为蛋白，多聚糖，edna，这些化学成分聚合为致密的包涵体，从而促使了生物膜的形成。以往的研究表明蛋白作为支柱支撑着生物膜空间结构，多糖作为粘合剂充实整个空间，但最新研究表明edna是生物膜的灵魂主宰，并且从生物膜初始阶段就参与整个形成过程，无论是从时空上还是空间上，edna都无处不在。

已经有研究表明edna可以增加菌体初始对载体以及菌体自身之间的粘附，从而促使生物膜的后期形成，并且可以稳固生物膜的结构。生物膜的形成从第一批细胞到载体上就已经开始了，细胞开始分泌出dna，dna作为一种载体与细胞之间的粘合剂使得细胞与载体之间无法分开，接着以相同的方法拉近细胞与细胞之间的距离。随后细胞便会分泌出多糖和蛋白用来巩固dna形成的网状结构，使生物膜不易被破坏。这三样胞外分泌物质是生物膜形成过程中不可缺少的。胞外dna的增加有多种方法，如外源加入dna，去除细胞本身分泌的胞外核酸酶，促进细胞分泌dna，增加胞外多糖也可以从另一方面使edna增多。ⅳ型分泌系统在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中均有发现，它们的分泌底物范围很广，例如蛋白质及核糖核蛋白复合物等大分子物质还可以有效地分泌出dna。我利用这个特点增加胞外dna含量，通过过表达ⅳ型分泌系统蛋白从而促使dna的分泌使得成膜效果增强。原始的谷氨酸棒状杆菌形成生物膜的效果不理想，但它作为产氨基酸的重要菌株，我们需要对这株菌进行分子改造，使其成膜效果增强，后期连续化发酵才有所效果。

固定化细胞连续发酵技术现如今已经投入到生产当中，其中用生物膜的方式进行固定化连续发酵已初见成效。

了解和阐明edna对生物膜的重要作用有助于我们运用到谷氨酸棒状杆菌上，弄清edna与生物膜中其他胞外分泌物的关系可以为我们筛选改造谷氨酸棒状杆菌的基因，以此来促进谷氨酸棒状杆菌生物膜的形成，并为固定化发酵提高产量提供基础。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，提供一株过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌以解决现有技术中谷氨酸棒杆菌成膜能力弱，不能用于连续化发酵的问题。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌在发酵制备脯氨酸中的应用。

一株过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌，该菌株中过表达三磷酸腺苷酶。

ⅳ型分泌通路的形成是由于鞭毛脱落造成的，在细胞内通过virb11将胞内的virb4转换成vird4，即可将胞外的菌毛脱落从而形成可将dna分泌出去的通路，而本发明过表达的三磷酸腺苷就是为中间转换蛋白virb11提供能量，从而促使菌毛脱落形成ⅳ型分泌通路。

其中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌atcc13032。

其中，所述三磷酸腺苷酶的基因序列如seqidno:1所示。

上述过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将seqidno:1所示核苷酸序列克隆到质粒上，得到重组质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组质粒导入宿主细胞中，即过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌。

步骤(1)中，所述质粒为pxmj19。

步骤(2)中，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌atcc13032。

上述过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌在微生物发酵中的应用。

上述过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌在发酵制备脯氨酸中的应用。

有益效果：

本发明通过在谷氨酸棒杆菌中过表达atpase，为中间转换蛋白virb11提供能量，从而促使菌毛脱落形成ⅳ型分泌通路，增多胞外dna，使得细菌的初始粘附能力增强，提高生物膜结构的稳定性，利用本发明构建的重组菌发酵产脯氨酸其脯氨酸产量提高36％，发酵周期缩短22％。

附图说明

图1谷氨酸棒状杆菌atcc13032原始菌和重组菌的电镜图。

图2谷氨酸棒状杆菌atcc13032原始菌和重组菌脯氨酸发酵产量对比图。

图3谷氨酸棒状杆菌atcc13032原始菌和重组菌发酵周期图。

图4谷氨酸棒状杆菌atcc13032原始菌和重组菌六孔板实验。

图5谷氨酸棒状杆菌atcc13032原始菌和重组菌96孔板实验。

图6pxmj19/*atpase质粒琼脂糖凝胶电泳图，泳道1是原始pxmj19质粒，泳道2是构建好的质粒pxmj19+atpase。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：构建重组质粒。

atpase上引物atpase-f和下引物atpase-r分别以原始菌株谷氨酸棒状杆菌atcc13032基因组为模板进行常规pcr，获得atpase基因片段，在进行纯化。

atpase-f：gcctgcaggtcgactctagaggatccatgactgacattgatctggtggtggaa(前20bp质粒上的，粗体字为bamhⅰ酶切位点)；

atpase-r：aattcgagctcggtacccggggatccctagggcataaaccatgcctcttcg(后20bp质粒上的，粗体字为bamhⅰ酶切位点)。

将该片段与经bamhⅰ单酶切后的pxmj19质粒进行一步克隆，得到用于过表达atpase基因的重组质粒pxmj19/*atpase，琼脂糖凝胶电泳图见图6。

实施例2：

将得到的pxmj19/*atpase重组质粒导入到谷氨酸棒状杆菌atcc13032感受态中，在含6.5ug/ml氯霉素的lb平板上进行筛选，培养2～3天后挑出转化子再在含6.5ug/ml氯霉素的lb液体培养基中进行培养，30℃、200rpm/min培养1-2天，后进行菌落pcr验证，得到过表达三磷酸腺苷酶atpase的重组菌。验证引物1：aattaagcttgcatgcctgcaggt，验证引物2：atcggcgctacggcgtttca。改造菌株构造成功后进行96孔板以及6孔板实验，以及fesem和clsm电镜实验。电镜照片可以直观具体的看出生物膜多少及形态。成膜效果提升之后进行连续化发酵。

图1中，a和b分别是原始菌和重组菌，均用dapi染剂染色，用clam进行电镜检测，可以明显看出改造菌成膜效果比原始菌成膜效果好，生物膜形成量多。

图4是进行的六孔板实验，在每孔装有5-8ml活化培养基的无菌六孔板中分别加入0.5-1ml的原始菌和改造菌的菌液，培养到12h、24h、36h、48h、60h、72h提取其生物膜中的edna。从图中可以明显看出过表达三磷酸腺苷酶的菌株分泌edna的量明显增多。

图5是进行的96孔板实验，在每孔装有200ul的无96孔板中分别加入20ul的原始菌和改造菌的菌液，培养到12h、24h、36h、48h时用结晶紫染色法和酶标仪测其od570。从图中可以明显看出过表达三磷酸腺苷酶的菌株成膜效果要比原始菌株好。

实施例3：重组菌脯氨酸发酵实验。

活化培养基每升组分如下：葡萄糖10-20g、蛋白胨8-15g、酵母粉5-12g、氯化钠8-15g。

种子培养基每升组分如下：葡萄糖25-35g、玉米浆15-25g、硫酸铵5-10g、七水硫酸镁0.1-1g、磷酸二氢钾0.5-2g、尿素1-5g。

发酵培养基每升组分如下：葡萄糖80-120g、玉米浆20-25g、硫酸铵20-30g、七水硫酸镁0.1-1g、磷酸二氢钾0.5-2g、尿素1-5g。

每50ml离心管加5ml活化培养基，分别接出发菌谷氨酸棒状杆菌atcc13032和重组菌，在28～34℃，200～250rpm条件下活化18h。

活化完成后分别倒入装有50ml种子培养基的500ml摇瓶中，在28-34℃，200-250rpm条件下培养12h。

将载体放入倒有发酵液的摇瓶当中一起灭菌，115℃，15min。

每500ml的摇瓶倒入50ml的发酵培养基，接3-5ml种子液，在28-34℃，200～250rpm条件下发酵72h。

从图2可以看出改造后的菌株固定化产量比原始菌高出36％，从图3可以看出改造后的菌株固定化发酵周期比原始菌缩短22％。

利用出发菌和重组菌进行固定化连续发酵实验，实验结果如表1所示，由表中数据可以看出，连续化发酵到第七批时产量达到最高，出发菌和重组菌第七批次产量分别为13.01g/l和15.7g/l，均比出发菌的初始产量高。

表1出发菌和重组菌固定化连续发酵实验

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序列表

<110>南京工业大学

<120>一株过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1134

<212>dna

<213>谷氨酸棒状杆菌atcc13032(corynebacteriumglutamisatcc13032)

<400>1

atgactgacattgatctggtggtggaaaacgtccaaaggattatcgccaccaaagagaca60

ccgccgacctctgcggaaatagcgagcctgattcgggaacaagcaggcgtgatcagtaac120

gaggacatcgtgatggtgttgcgtcgactgcgcagtgattctgtgggcgtgggaccgttg180

gaatctctgcttgcgcttcctggcgtgacggatgtgttggttaatgcccatgacagcgtg240

tggattgatcgcggtcagggcgtggagaaagtcgacatggatctgggctcagaggaggcg300

gtgcgtcgccttgccacccggttggcgttgacctgtggcagacgcttagatgatgcgcag360

cctttcgctgatggccgaatcaccagggacgacggcagcgtgttgcgcattcacgcggtg420

ttggcacccttggcggaatccggcacgtgcatcagtgtgcgagtactgcgtcaagcacgg480

ctgagccttgatgatcttatccaaagcggcacggtgcctgaggacatcgcgcctgcgctc540

cggaacatcatcaatcaacggcgctcgttccttgttgtcggtggcaccggcacagggaaa600

accacattgctgtccgcgatgctcaccgaagttcccgctgatcaacgaatcatctgcatc660

gaggacaccgcagagcttcatcccggccatccaagcaccatcaacttggtgtctcgccaa720

gcaaacgtcgagggcgccggcgccgtgagcatggcggatttgttgaaacaatcgctgcgc780

atgaggcctgaccggattgtcgtcggagagattcgcggtgcggaagtcgtggatcttttg840

gctgcgatgaataccggacacgacggcggtgctggcaccattcacgcgaactccatctct900

gaagttcccgcgcgcatggaagctcttgcggcgaccggcggattggaccgcatggcattg960

cattctcaactcgcggccgcagtggacattgtgctggtcatgaaacacaccccttttggc1020

cgcaggctagctcaactcggggtgctccgcggaaatcctgtgaccacgcaggtggtgtgg1080

gatttggaccacggcatgcacgaagggagcgaagaggcatggtttatgccctag1134

<210>2

<211>53

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcctgcaggtcgactctagaggatccatgactgacattgatctggtggtggaa53

<210>3

<211>51

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aattcgagctcggtacccggggatccctagggcataaaccatgcctcttcg51