甘蔗原生质体超低温保存方法与流程

本发明属于植物种质资源的细胞保存技术领域，特别是甘蔗原生质体超低温保存方法。

背景技术：

植物体细胞融合育种，是根据细胞的全能性和细胞膜的流动性原理，用酶解法去除细胞壁，将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂合体植株的技术。其打破了有性杂交不亲和性的界限，广泛地组合各种基因型，从而有形成有性杂交方法所无法获得的新型杂合体植株，而且细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，转移的基因基本不存在基因安全性问题，因为被转移的基因本身存在于甘蔗中，在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，加之体细胞杂交来自双亲的遗传物质并非简单的堆积，而是发生了复杂的遗传重组，这正是改良作物所期望的。植物体细胞融合育种是改造细胞遗传物质的有力手段，有着重大的实践意义。

原生质体是体细胞融合的必需材料，同时还可以用于突变体筛选和遗传转化等研究，是科学研究的理想材料。由于植物材料的获得受季节和植物生长发育阶段的影响，导致原生质体融合育种等实验也会受到以上因素的限制，实验不能随时随地进行。当前国内对原生质体的获得，大多数是及时采样并且及时酶解。这样做的缺点是：酶解耗时长；未用完的原生质体只能培养要么丢弃，效率低；材料的季节性导致有些季节实验因没有材料而搁置。原生质体冻存技术可以很好的解决这些问题。超低温条件能够较好保存种质资源。随着原生质体再生植株种类的不断增多，玉米、水稻、小麦等禾谷类的主要农作物的原生质体也成为种质保存的重要材料。冻存过程对原生质体的主要伤害是冰晶刺破的伤害，二甲基亚砜(dmso)是一种高效的渗透性保护剂，可迅速渗透细胞，降低细胞内细胞液冰点是低温保护剂，它易于透入细胞内部，使之不至于在细胞冻融时因强烈脱水而损伤。目前，许多实验室广泛采用dmso作冻存保护剂，除了价格低廉、保护效果良好外，dmso另一特点是很容易洗脱干净。但不同浓度dmso会触发冻存细胞复苏后大量细胞凋亡，对细胞有一定的毒害作用。如何优化植物原生质体冻存条件，降低冻存试剂的毒性作用，改善冻存效果，最大程度保留原生质体的生物学特性是体细胞融合育种顺利进行的重要环节之一。

甘蔗是我国食糖工业的重要支柱，也是能源、纤维、糖基化工和饲料的原料，作为再生能源作物，甘蔗有很大的潜力。然而蔗糖生产中存在着糖料蔗品种单一，选育的新品种不能满足甘蔗生产需求等问题，严重影响了蔗糖业健康稳定发展和竞争能力的进一步提高。因此，增强甘蔗育种的创新力度，提供更多优良的甘蔗品种已成为糖业发展，乃至经济发展急需解决的问题。

由于甘蔗不仅生育期长，而且是亚热带作物，生长受季节和地域性的限制，如果缺乏合适的甘蔗原生质体冻存方法，会导致甘蔗原生质体融合育种研究不在甘蔗生长季节和亚热带地区时，找不到研究材料，而在生长季节时大量的实验材料因无法得到及时利用和长期保存而被浪费，极大地限制了甘蔗体融合育种研究顺利进行。因此，研究甘蔗原生质体冻存方法，为后期甘蔗原生质体的融合育种以及以甘蔗原生质体为受体进行遗传转化等研究提供储备材料，为体细胞融合育种、遗传学和转基因提供材料和技术支撑。

技术实现要素：

本发明提供了一种甘蔗原生质体超低温保存方法，该方法能优化甘蔗原生质体冻存条件、降低冻存试剂的毒性作用，改善冻存效果，最大程度保留原生质体的生物学特性、保证甘蔗遗传稳定性，提高保存后的复苏活力。

甘蔗原生质体超低温保存方法，包括以下步骤：

(1)甘蔗幼叶的酶解：

以健壮甘蔗尾鞘作为幼叶酶解材料，先剥去外面2～3层叶鞘，然后用质量浓度75％的酒精灭菌30s，再用无菌水清洗3次后，切除外层和两端叶鞘，漏出淡黄色心叶，并留下生长点以上1～5cm嫩叶，切成厚度为1mm的薄片，收集幼叶0.5g，加入5ml质量浓度13％的甘露醇溶液，使材料质壁分离0.5～1h后，除去所述甘露醇溶液，加入5ml酶液常温酶解4h，然后分别过100目和200目细胞筛，收集原生质体悬浮液，梯度离心纯化原生质体，所得原生质体为幼叶原生质体；

(2)冻存：

采用65％～75％的km8p培养基+20％的小牛血清蛋白+5％～15％的二甲基亚砜作为冻存液，将步骤(1)所得的原生质体按细胞密度1×10⁶个/ml悬浮于所述冻存液中，每只冻存管内放细胞悬液200μl，采用缓慢冻存的方法，即将装有细胞悬液的冻存管首先放入4℃中40min，之后置于-20℃中30～60min，再置于-80℃放置过夜，最后置于-80℃冰箱中或-196℃液氮罐中保存；

(3)解冻复苏：

采用快速化冻的方法，即从步骤(2)所述冰箱中或液氮罐中取出冻存管放入37℃的恒温水浴锅中不断摇晃致解冻，然后离心弃掉冻存液，用含9％甘露醇清洗3遍，用km8p培养基培养得到得到保存后的原生质体。

所述步骤(1)的酶液为2％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.1％离析酶+0.3％半纤维素酶。

所述步骤(1)的甘露醇溶液和酶液的ph均为5.8。

所述冻存液为70％的km8p培养基+20％的小牛血清蛋白+10％的二甲基亚砜。

本发明的优点在于：本发明方法优化了甘蔗原生质体的冻存条件，降低冻存试剂的毒性作用，改善冻存效果，最大程度保留原生质体的生物学特性、保证甘蔗遗传稳定性，幼叶原生质体冻存后复苏活力显著提高，复苏活力高达72.3％；经本发明方法冻存的幼叶原生质体，其再生能力强。本发明方法为甘蔗原生质体的超低温保存提供科学依据，为体细胞融合育种、遗传学和转基因研究提供了材料和技术支撑。

附图说明

图1是冻存温度对甘蔗原生质体活力的影响的柱状分析图。

图2-a、图2-b、图2-c分别一一对应培养0d、培养6d、培养15d的冻存后甘蔗细胞分裂的原生质体图。图中bar＝10μm。

图3-a是4℃冻存原生质体复苏后培养7d的原生质体第一次分裂的原生质体图。图中bar＝10μm。

图3-b是-80℃冻存原生质体复苏后培养7d的原生质体第一次分裂的原生质体图。图中bar＝10μm。

图3-c是-196℃冻存原生质体复苏后培养7d的原生质体第一次分裂的原生质体图。图中bar＝10μm。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的具体实施方式作详细说明，但不构成对本发明权利要求保护范围的限制。

甘蔗原生质体超低温保存方法：

1、材料准备

分别选取甘蔗roc22号伸长初期的茎尖和幼叶作为研究材料。

2、酶解方法

2.1甘蔗幼叶的酶解方法

以健壮甘蔗尾鞘作为幼叶酶解材料，先剥去外面2-3层叶鞘，然后用质量浓度75％酒精灭菌30s，无菌水清洗3次后，再切除外层和两端叶鞘，漏出淡黄色心叶，并留下生长点以上1-5cm嫩叶，切成厚度为1mm左右的薄片，收集幼叶0.5g，加入5mlcpw溶液(质量浓度13％的甘露醇溶液，ph为5.8)，使材料质壁分离0.5-1h后，除去cpw溶液，加入5ml组合酶液常温酶解4h，然后分别过100目和200目细胞筛，收集原生质体悬浮液，梯度离心纯化原生质体，所得原生质体为幼叶原生质体。

2.2甘蔗茎尖的酶解方法

取伸长初期的甘蔗茎尖，剥去幼叶，然后用质量浓度75％酒精灭菌30s，无菌水清洗3次后，再切除外层和两端叶鞘，将包裹生长锥的几片大的幼叶剥去，仅保留生长锥附近的第3至第6片幼叶或叶原基。将甘蔗茎尖修成1cm×1cm×2cm的组织块，其中包括幼叶原基、生长锥、伸长区的初生增粗分生组织和部分成熟区，将茎尖切成1mm左右的薄片，加入5mlcpw(质量浓度13％的甘露醇溶液，ph为5.8)溶液，使材料质壁分离0.5-1h后，除去cpw溶液，加入5ml组合酶液常温酶解4h，然后分别过100目、200目细胞筛，收集原生质体悬浮液，梯度离心纯化原生质体，所得原生质体为茎尖原生质体。

上述步骤2.1和2.2的所述组合酶液为2％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.1％离析酶+0.3％半纤维素酶，ph为5.8。

3、不同冻存液组合和冻存方法

用km8p培养基、bsa(小牛血清蛋白)、以及dmso(二甲基亚砜)组合成不同的冻存液，设计组合1冻存液为75％培养基+20％bsa+5％dmso，组合2冻存液为70％培养基+20％bsa+10％dmso，组合3冻存液为65％培养基+20％bsa+15％dmso。

将步骤2分别酶解的原生质体用细胞计数板调密度至1×10⁶个/ml分别悬浮于不同组合的冻存液中，分别设3个处理温度为4℃、-80℃、-196℃，每个处理3个重复。每只冻存管内放细胞悬液200μl，分别冻存7d、30d、60d和90d后复苏，观察原生质体的活力和培养观察再生能力。

采用缓慢冻存的方法，将装有细胞悬液的冻存管首先放入4℃40min；之后置于-20℃30-60min；再置于-80℃放置过夜；最后置于液氮罐-196℃中或-80℃冰箱中长期保存。

4、甘蔗原生质体的复苏方法

采用快速化冻的方法，从液氮罐或-80℃冰箱中取出冻存管快速放入37℃的恒温水浴锅中不断摇晃，使其快速解冻，然后离心弃掉冻存液，用cpw溶液(质量浓度9％的甘露醇溶液)清洗3遍，加km8p培养基培养。

5、甘蔗原生质体的活力测定

4％台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用pbs稀释至0.4％。测定时，被染蓝色即为死细胞。

原生质体活力(％)＝(有活力的原生质体数/原生质体总数)×100％。

6、甘蔗原生质体细胞壁的观察

将荧光增白剂vbl溶于cpw溶液，质量浓度0.1％；cpw溶液为用无离子水配制，ph5.8，质量浓度9％。待完全溶解后，于85×g离心10分钟，去沉淀杂质，用上清液。

向原生质体悬浮液中加入等体积的vbl染色液，常温下静置染色5min，用质量浓度9％cpw溶液清洗3-4次，浮于cpw溶液中。吸取适量染色后的悬浮液滴于载玻片上，于波长345nm、倍数100倍的荧光显微镜下观察细胞壁的生长情况。

结果与分析：

一、不同处理对原生质体活力的影响

1、不同冻存液组合对甘蔗原生体活力的影响

从表1可得出，在用缓慢冻存的方式冻存不同时间段后，在组合1至组合3三种冻存液组合中冻存的甘蔗原生质体和冻存前比活力都会有所降低，降低幅度总体表现为组合1＞组合3＞组合2，不同组合之间原生质体活力差异显著。最佳的冻存液为组合2(70％培养基+20％小牛血清蛋白+10％dmso)，冻存后7d复苏，组合2原生质体活力比组合1高27.69％，比组合3高18.43％；冻存后30d复苏，组合2原生质体活力比组合1高27.13％，比组合3高16.17％；冻存后90d复苏，组合2原生质体活力比组合1高28.45％，比组合3高18.36％。

表1不同冻存液对冻存活力的影响

注：同列内相同字母表示经邓肯氏新复极差测验在5％水平上差异不显著，不同字母表示差异显著。

2、不同取材部位对甘蔗原生体活力的影响

从表2可知，在分别对幼叶和茎尖酶解后，分别冻存7d、15d、30d后复苏，幼叶的活力均显著高于茎尖，分别比茎尖高35.91％、37.56％和36.5％。冻存7d后复苏，幼叶和茎尖活力降低10％左右，差异显著。分别冻存7d、15d、30d后复苏，幼叶和茎尖活力降低差异不显著。

表2取材部位对冻存效果的影响

.注：同列内相同字母表示经邓肯氏新复极差测验在5％水平上差异不显著，不同字母表示差异显著。

3、不同冻存温度对甘蔗原生体活力的影响

由图1可看出，冻存7d后复苏，不同冻存温度4℃、-80℃、-196℃之间，原生质体活力差异不显著；冻存30d和60d后复苏，-80℃和-196℃中复苏的原生质体活力差异不显著，但显著高于4℃处理，分别高40％和60％，达到显著性差异；冻存90d后复苏，-196℃原生质体活力最高，4℃处理最低，-196℃中复苏的原生质体活力较-80℃处理高22.81％，较4℃处理高71.37％，差异显著。处理时间对在液氮-196℃中冻存的原生质体活力影响不显著。.

二、不同处理对甘蔗原生质体细胞壁再生的影响

1、不同冻存液组合对甘蔗原生体细胞壁形成的影响

细胞壁的形成是一个逐渐形成的过程，整个再生过程中，随着培养时间的增加，荧光强度由弱变强。冻存30d后复苏培养，不同冻存液组合对细胞壁形成的影响差异不显著，原生质体培养1d于荧光显微镜下观察，细胞周围均无蓝色荧光，说明培养1d没有形成细胞壁；培养2-3d之后，在荧光显微镜下可看到由于vbl和细胞壁的纤维素结合而在细胞周围开始发出淡蓝色的荧光；培养5-6d左右，在荧光显微镜下观察到整个细胞边缘蓝色荧光均匀、强烈且明显，表明细胞壁在逐渐形成，5d左右基本形成完整。

2、不同取材部位对甘蔗细胞壁再生的影响

冻存30d后复苏培养，培养1d没有形成细胞壁；在第3-4d的时候，茎尖细胞壁形成完整；而幼叶在第5-6d的时候才观察到细胞壁形成，茎尖细胞壁早形成于幼叶。但是二者形成细胞壁的过程并无差异。

3、不同冻存温度对甘蔗原生体细胞壁形成的影响

在后期的细胞壁形成过程中，分别冻存于4℃、-80℃、-196℃的原生质体形成细胞壁的时间上无显著差异，均为：培养1d没有形成细胞壁；培养2-3d之后，在荧光显微镜下可看到细胞周围开始发出淡蓝色的荧光；培养5-6d左右可以在荧光显微镜下观察整个细胞边缘蓝色荧光均匀、强烈且明显，表明细胞壁在逐渐形成。

三、不同处理对甘蔗原生质体细胞分裂的影响

1、不同冻存液组合对甘蔗细胞分裂的影响

冻存90d后，复苏观察。结果表明不同的冻存液组合冻存90d后，原生质体复苏启动分裂的时间并无差别。均为：培养0d三个组合的原生质体都未观察到细胞分裂相，原生质体呈圆球形，细胞膜边缘清晰，如图2-a所示。培养6d后，细胞分裂相增多，出现较多的第一次细胞分裂，如图2-b所示。培养第15d左右，出现少量细胞团，细胞排列紧密，如图2-c所示。

2、不同取材部位对甘蔗原生体细胞分裂的影响

由表3可知，茎尖比幼叶更早启动分裂，且差异显著。第一次分裂，茎尖比幼叶早2d，第二次分裂，茎尖比幼叶早3d，形成小细胞团所需时间比幼叶早5d，形成小愈伤所需时间比幼叶早10d，但分裂过程并无差异。

表3取材部位对分裂的影响

注：同列内相同字母表示经邓肯氏新复极差测验在5％水平上差异不显著，不同字母表示差异显著。

3、不同冻存温度对甘蔗原生质体细胞分裂的影响

不同冻存温度4℃、-80℃、-196℃对第一次分裂启动时间都是7d左右，差异不显著。如图3-a、图3-b、图3-c所示，三种冻存温度分别培养一周后均可观察到原生质体第一次分裂。

结论：

dmso(二甲基亚砜)是超低温保存中常用的一种高效的渗透性低温保护剂，在常温下dmso对细胞有轻度药害，但随着温度的降低，药害作用也随之减小。

通过上述实验，发现不同的冻存液组合对甘蔗原生质体活力影响差异显著，最适合甘蔗原生质体的冻存液组合是组合2(70％培养基+20％bsa+10％dmso)，在此冻存液中原生质体的活力最高。原因是5％dmso浓度过低，起不到充分保护的作用，造成细胞被冰晶刺破；而15％dmso浓度又过高，可能对细胞产生了毒害作用，造成细胞的活力下降。

通过上述实验发现，不同取材部位冻存后复苏细胞活性、细胞分裂和再生能力也不一样。幼叶原生质体冻存后复苏较茎尖原生质体冻存后复苏获得高更高活力的原生质体，但是茎尖酶解所得原生质体冻存后复苏更早进行分裂。植物茎尖细胞具有持续、周期性分裂的能力，茎尖原生质体冻存后复苏更早分裂的原因可能是茎尖细胞小，细胞壁薄，细胞核大，细胞质浓，具有很强且持续的分裂能力，导致其更早进行分裂。

通过上述实验还发现，不同的冻存温度复苏后对原生质体活力有一定的差异性。如果是短时间(90d内)冻存，-80℃冰箱和-196℃液氮冻存后复苏原生质体的活力差异不显著。如果长期保存，-80℃冰箱冻存后复苏，原生质体活力有下降趋势。4℃保存30d后原生质体活力显著下降，不能用来长期存放细胞。而冻存温度对细胞的再生能力无明显影响，原生质体可以在第5d左右形成完整的细胞壁，第7d左右可进行第一次分裂。

综上，本发明优化甘蔗原生质体的冻存条件结论为：幼叶原生质体冻存后复苏活力显著高与茎尖原生质体；冻存剂dmso组合为(70％培养基+20％血清+10％dmso)保护原生质体冻存90d后复苏活力高达72.3％；冻存幼叶原生质体3个月内复苏，-80℃和液氮-196℃冻存效果差异不显著，超过3个月后，-196℃冻存温度显著高于-80℃，甘蔗原生质体经超低温保存后，其再生能力并没有太大变化。以上结论为甘蔗原生质体的超低温保存提供科学依据，为体细胞融合育种、遗传学和转基因研究提供了材料和技术支撑。