人源化抗CD47单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及抗体药物
技术领域：
，尤其涉及人源化抗cd47单克隆抗体及其应用。
背景技术：
：cd47cd47，也称作整联蛋白相关蛋白(iap)，最初从人胎盘与整合素avβ3共纯化及从血小板与β3整合素共免疫沉淀而为人所知，是一种广泛表达于细胞表面的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。cd47是细胞表面至关重要的标记物，分子量在47-55kda之间，在结构上包括一个氨基端细胞外可变区域，一个由3-5个高度疏水的跨膜片段构成的跨膜区域和一个亲水的羧基端胞质尾区。其与多种配体诸如：整联蛋白、sirpα(信号调节蛋白α)、sirpγ和血小板反应蛋白相互作用。sirpα信号调节蛋白α(sirpα)也是一种跨膜蛋白，主要表达于巨噬细胞、树突状细胞和神经细胞表面。其胞外区含有3个免疫球蛋白超家族样区域，其中n末端的区域介导与cd47的结合，而其细胞内结构域具有典型的免疫受体酪氨酸抑制性序列(itim)。当与cd47结合后，sirpα的itim被磷酸化，产生级联反应，抑制巨噬细胞的吞噬作用。cd47/sirpα参与肿瘤免疫的逃逸机制在先天免疫系统中，cd47作为自身标志物、通过结合由髓样细胞诸如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞表达的sirpα而传递抑制性“别吃我”信号而发挥功能。因此，cd47在生理条件下广泛表达的作用是保护健康细胞免于被先天免疫系统消除。然而，肿瘤细胞则通过过表达cd47而有效逃脱免疫监视。近年来，cd47和cd47-sirpα信号系统受到广泛关注。其中，最令人瞩目的是其作为肿瘤治疗的潜在药靶。已有研究证实，cd47表达在大部分人类癌症(例如，nhl、aml、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、膀胱癌和前列腺癌)中上调，并且提高的cd47表达水平与侵袭性疾病和差的存活相关。斯坦福大学的weissman系统地研究了多种实体瘤中cd47的表达水平，结果表明，所有人类实体瘤细胞中的cd47都呈高表达，其平均表达水平是对应正常细胞的3.3倍左右。而且，他们发现实体瘤病人cd47mrna的水平与预后指数呈负相关。进一步针对原位免疫缺陷型小鼠异种移植动物模型的实验发现，抗cd47单克隆抗体的施用能够抑制大型肿瘤的生长和转移，而对于小型肿瘤则可以治愈。willingham等人还在原位小鼠乳腺癌模型实验中证实了抗cd47单克隆抗体的有效性和安全性。该项研究不仅证实了高表达cd47是肿瘤细胞逃避免疫监视的普遍机制，也为通过阻断cd47-sirpα信号通路来治疗肿瘤提供了有重要价值的借鉴。治疗性抗cd47抗体cd47在多类肿瘤中高表达并作为“别吃我”信号抑制吞噬作用，意味着靶向cd47-sirpα通路可作为多类肿瘤的治疗方法。rauh等人通过体内外实验证实阻断性抗cd47单克隆抗体能促进巨噬细胞对肿瘤细胞进行吞噬，抑制急性粒细胞白血病(aml)在小鼠体内形成，并消除已在体内移植成功的aml，还可靶向清除白血病干细胞(lsc)。chao等人对急性淋巴细胞白血病的研究发现抗cd47单克隆抗体联合利妥昔单抗不仅可消除原始移植部位的肿瘤，还能消除血液循环及向肝、脾、淋巴结等部位扩散的肿瘤，达到长期生存且抑制肿瘤复发的效果，而单独使用抗cd47单克隆抗体或抗cd20单克隆抗体只能抑制nhl的生长速度却不能完全消除nhl。为进一步证实抗cd47单克隆抗体对肿瘤的作用，willingham等人用有免疫活性的小鼠建立移植瘤模型，抗鼠及抗人cd47单克隆抗体均可显著抑制肿瘤的生长，并证实抗cd47抗体可消除多种实体瘤肿并抑制肿瘤的转移及复发，此外抗cd47单克隆抗体对肿瘤干细胞(csc)及其分化亚型也有抗瘤作用，并能将致瘤性的tam转变成抗瘤性的效应因子并增强其吞噬作用。抑制小鼠cd47的表达还能增强肿瘤细胞对放疗的敏感性，而对正常组织具有保护作用，这一作用可能与诱导宿主免疫细胞产生保护性自噬反应有关。抗cd47单克隆抗体治疗肿瘤与多种机制有关。首先，抗cd47单克隆抗体通过阻断肿瘤细胞上的cd47与巨噬细胞上的sirpα结合而使肿瘤细胞被吞噬。其次，与抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用和补体依赖性的细胞毒作用有关，研究发现抗cd47抗体可诱导nk细胞参与的抗头颈肿瘤细胞的细胞毒作用。再次，通过直接诱导凋亡而清除肿瘤细胞。最后，对有免疫活性的小鼠进行研究发现抗cd47单克隆抗体可激活cd8+t细胞，引起获得性t细胞免疫反应，进一步杀伤肿瘤细胞。随着人们对肿瘤分子发生机制研究的不断深入，分子免疫治疗逐渐成为除手术及化学药物治疗之外的另一有效的治疗手段。目前生物治疗在肿瘤治疗中的作用逐年提高，生物治疗在防止肿瘤复发、治疗晚期癌症及其并发症等诸多方面具有诸多优势。因此，存在对于能够靶向cd47的抗体和治疗的需要。尽管已经获得了一些在治疗上有很大优势的人源化单克隆抗体，但是筛选出具有所需性质和功能的人源化单克隆抗体绝非易事，现实中依然存在对这类人源化单克隆抗体的迫切需求。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供人源化抗cd47单克隆抗体及其应用。并提供编码该单克隆抗体的核苷酸的载体、宿主细胞及其用途。由本发明涉及的抗体基因可变区的序列，可构建全长抗体分子，作为药物用于临床上发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。本发明提供的人源化抗cd47的单克隆抗体：其重链包含三个cdr区，其中至少一个cdr区的氨基酸序列具有如seqidno:1、2或3所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列；其轻链包含三个cdr区，其中至少一个cdr区的氨基酸序列具有如seqidno:4、5或6所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列。本发明中，所述重链的三个cdr区的氨基酸序列分别具有如seqidno:1、2和3所示的氨基酸序列；所述轻链的三个cdr区的氨基酸序列分别具有如seqidno:4、5和6所示的氨基酸序列。其中，seqidno:1所示的序列为nyvx1h，x1为i或m；seqidno:2所示的序列为yinpyndgtkx2sekfkg，x2为y或h；seqidno:3所示的序列为gglftfdx3w，x3为y或n；seqidno:4所示的序列为x4ssqslvhrkx5ntylh，x4为r或s；x5为g或s；seqidno:5所示的序列为rvsnrfx6，x6为r或s；seqidno:6所示的序列为sqsx7hx8pfx9，x7为t或s；x8为e或v；x9为t或s。一些实施例中，其重链包含4个fr区其中至少一个fr区的氨基酸序列具有如seqidno:7、8、9或10所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列；其轻链包含4个fr区，其中至少一个fr区的氨基酸序列具有如seqidno:11、12、13或14所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列。一些实施例中，所述重链的4个fr区的氨基酸序列分别具有如seqidno:7、8、9或10所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列；所述轻链的4个fr区的氨基酸序列分别具有如seqidno:11、12、13或14所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列。其中，seqidno:7所示的序列为qx10qlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytft，x10为v或a；seqidno:8所示的序列为wvrqapgqrlewmg；seqidno:9所示的序列为rvtitrdtsax11taymelsslrsedtavyycax12，x11为s或n；x12为r或k；seqidno:10所示的序列为gqgtx13vtvx14s，x13为q或l；x14为p或s；seqidno:11所示的序列为divmtqsplslpvtpgepasisc；seqidno:12所示的序列为wylqkpgqspqlliy；seqidno:13所示的序列为gvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyyc；seqidno:14所示的序列为fgqgtkveik；本发明中，所述与具有至少80％序列同源性的序列为在原序列的基础上，经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。一些实施例中，其重链可变区具有如seqidno:15～22中任一项所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如seqidno:23～30中任一项所示的氨基酸序列。在本发明的一些具体实施方案中，所述人源化抗cd47单克隆抗体具有：氨基酸序列为seqidno:15,16,17,18,19,20,21,22的重链可变区，和氨基酸序列为seqidno:23的轻链可变区；氨基酸序列为seqidno:15,16,17,18,19,20,21,22的重链可变区，和氨基酸序列为seqidno:24的轻链可变区；氨基酸序列为seqidno:15,16,17,18,19,20,21,22的重链可变区，和氨基酸序列为seqidno:25的轻链可变区；氨基酸序列为seqidno:15,16,17,18,19,20,21,22的重链可变区，和氨基酸序列为seqidno:26的轻链可变区；氨基酸序列为seqidno:15,16,17,18,19,20,21,22的重链可变区，和氨基酸序列为seqidno:27的轻链可变区；氨基酸序列为seqidno:15,16,17,18,19,20,21,22的重链可变区，和氨基酸序列为seqidno:28的轻链可变区；氨基酸序列为seqidno:15,16,17,18,19,20,21,22的重链可变区，和氨基酸序列为seqidno:29的轻链可变区；氨基酸序列为seqidno:15,16,17,18,19,20,21,22的重链可变区，和氨基酸序列为seqidno:30的轻链可变区；一些具体实施例中，其重链可变区具有如seqidno:16所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seqidno:23所示的氨基酸序列；或重链可变区具有如seqidno:16所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seqidno:25所示的氨基酸序列；或重链可变区具有如seqidno:18所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seqidno:26所示的氨基酸序列；或重链可变区具有如seqidno:19所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seqidno:28所示的氨基酸序列；或重链可变区具有如seqidno:19所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seqidno:29所示的氨基酸序列；或重链可变区具有如seqidno:20所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seqidno:24所示的氨基酸序列；或重链可变区具有如seqidno:20所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seqidno:25所示的氨基酸序列；或重链可变区具有如seqidno:20所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seqidno:27所示的氨基酸序列；或重链可变区具有如seqidno:20所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seqidno:29所示的氨基酸序列；或重链可变区具有如seqidno:21所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seqidno:27所示的氨基酸序列。本发明所述的单克隆抗体，还包括恒定区，所述重链的恒定区为人igg1、igg2、igg3或igg4的任意一种；所述轻链的恒定区为κ型或λ型。本发明的人源化抗体的重链恒定区为人igg4，轻链恒定区为人κ链的恒定区。本发明提供的人源化抗cd47单抗能够结合人cd47；在某些实施方案中，抗体与其靶点之间的亲和力用ka(结合常数)、kd(解离常数)、kd(平衡解离常数)来表征，本发明提供抗体的kd值不高于30nm；本发明提供的人人源化抗cd47单抗可呈剂量依赖性阻断人sirp与人cd47的结合；本发明提供的抗cd47单抗能够结合细胞表面cd47，该效果的检测通过facs法进行；本发明提供的抗cd47单抗能够促进巨噬细胞对raji细胞的吞噬作用，该效果通过荧光成像法测定，结果以吞噬指数表示，本发明提供的抗cd47单抗能够抑制npg小鼠内人淋巴瘤的生长。raji细胞属淋巴瘤细胞，与其他恶性肿瘤相同，raji细胞表面cd47呈高表达。本发明通过对raji的实验证明，本发明提供的人源化cd47单抗能够通过阻断sirpα与人cd47的结合信号，阻止肿瘤细胞逃避肿瘤免疫的防御系统，发挥抗肿瘤的作用。亲和力成熟候选分子中，重链可变区的氨基酸序列如seqidno:16所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:25所示，的单克隆抗体与人cd47具有良好的亲和力，相对于人源化分子059-1.43.1-h1l3，其与肿瘤细胞表面cd47结合的效果较佳，其对npg小鼠接种人淋巴瘤模型的治疗疗效最佳。本发明还提供了编码所述人源化抗cd47单克隆抗体的核苷酸。本发明还提供了编码所述的单克隆抗体的核苷酸。本发明提供了编码所述单克隆抗体重链的核苷酸序列。本发明提供了编码所述单克隆抗体轻链的核苷酸序列。本发明提供了编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列。其中，编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如seqidno:31～38所示或为seqidno:31～38的互补序列。在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸具有与seqidno:31～38中任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的、且与seqidno:31～38中任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。在本发明的一些具体实施方案中，所述seqidno:31～38中任一项所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。本发明提供了编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。其中，编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:39～46所示或为seqidno:39～46的互补序列。在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸具有与seqidno:39～46中任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的、且与seqidno:39～46中任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。在本发明的一些具体实施方案中，所述seqidno:39～46中任一项所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。本发明提供的表达载体，包括编码所述人源化抗cd47单克隆抗体的核苷酸。本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主细胞。本发明所述人源化抗cd47单克隆抗体的制备方法，包括：培养所述宿主细胞、诱导人源化抗cd47单克隆抗体的表达。本发明还提供了经化学标记或生物标记的所述人源化抗cd47单克隆抗体。所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。所述酶标记优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。所述免疫毒素优选为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、pap、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。本发明所述人源化抗cd47单克隆抗体或其结合物与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。所述固体介质或非固体介质选自胶体金、聚苯乙烯平板或珠粒。本发明所述人源化抗cd47单克隆抗体、结合物和/或偶联物在制备检测cd47表达的产品中的应用。实验表明，本发明提供的人源化cd47单抗能够与cd47蛋白相结合，也可与表面表达cd47的细胞相结合。故而，本发明提供的人源化cd47单抗能够用于cd47蛋白或表面表达cd47的细胞的检测。并且，由于肿瘤细胞表面标志物cd47的高表达，本发明提供的抗体能够制备用于肿瘤表面标志物cd47检测的试剂盒。其中，cd47蛋白的检测采用elisa法，表面表达cd47的细胞的检测采用facs法。本发明所述的人源化抗cd47单克隆抗体、其结合物和/或偶联物在制备检测cd47表达的产品中的应用。本发明还提供了一种试剂盒，包括所述人源化抗cd47单克隆抗体、其结合物和/或偶联物。检测cd47蛋白的试剂盒中，还包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液和/或显色液。所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液。所述洗涤液中包括pbs、tween、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾。所述封闭液中包括pbs和bsa。所述显色液包括tmb溶液、底物缓冲液和终止液。所述底物缓冲液包括柠檬酸和磷酸氢二钠。所述终止液为过氧化氢水溶液。检测表面表达cd47的细胞的试剂盒中，还包括pbs、羊抗鼠iggfc和titc二抗。所述人源化抗cd47单克隆抗体、其结合物和/或偶联物在制备阻断cd47与sirpα结合的制剂中的应用。通常，表面表达cd47的细胞为肿瘤细胞。所述肿瘤细胞选自白血病细胞、淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、肠癌细胞、食管癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、肾癌细胞、膀胱癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤细胞和/或黑素瘤细胞。所述人源化抗cd47单克隆抗体、其结合物和/或偶联物在制备提高巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬指数的制剂中的应用。本发明所述肿瘤细胞为淋巴瘤细胞。所述人源化抗cd47单克隆抗体、其结合物和/或偶联物在制备促进肿瘤细胞凋亡的制剂中的应用。本发明中，所述肿瘤细胞为淋巴瘤细胞。所述人源化抗cd47单克隆抗体、其结合物和/或偶联物在制备防治疾病的药物中的应用；所述疾病为白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤和/或黑素瘤。一种药物，包括所述人源化抗cd47单克隆抗体、其结合物和/或偶联物。一种疾病的诊断方法，以本发明提供的试剂盒检测cd47表达，根据cd47的表达量判断是否患有疾病；所述疾病为白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤和/或黑素瘤。一种疾病的防治方法，给予本发明所述的药物；所述疾病为白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤和/或黑素瘤。本发明提供的人源化抗cd47单抗能有效抑制肿瘤生长；剂量依赖性阻断人sirpα与人cd47结合，可以促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，阻止肿瘤细胞逃避肿瘤免疫的防御系统，发挥抗肿瘤的作用。阻断肿瘤细胞表面cd47与巨噬细胞表面的sirpα的结合，可以阻断肿瘤细胞的“别吃我”信号，促进巨噬细胞对肿瘤细胞的识别摄取，促进肿瘤细胞被吞噬。肿瘤细胞表面的cd47与巨噬细胞表面sirpα的结合是一种普遍的“别吃我”信号，抗cd47抗体可以作为肿瘤免疫系统中的非常有前景的靶点，在人类肿瘤治疗方面发挥强大而有效的作用。附图说明图1示sds-page电泳检测纯化的人和猴的cd47；泳道m：蛋白质分子量标记；图1：泳道1：人cd47-连接肽-higg1fc；泳道2:人cd47-连接肽-his；图2示sds-page电泳检测纯化的鼠人嵌合抗体059-chab-1.43.1；泳道m：蛋白质分子量标记；图2-a中：泳道1：鼠人嵌合抗体059-chab-1.43.1非还原电泳；图2-b中：泳道1：鼠人嵌合抗体059-chab-1.43.1还原电泳；图2-c中：泳道1：阳性抗体059p03非还原电泳；泳道2：阳性抗体059p03还原电泳；图3示sds-page电泳检测纯化的人源化候选抗体；泳道m：蛋白质分子量标记；图3-a：泳道1-6分别为人源化候选抗体059-1.43.1-h1l3、059-1.43.1-h1l4、059-1.43.1-h3l3、059-1.43.1-h3l4、059-1.43.1-h4l3、059-1.43.1-h4l4非还原电泳；图3-b：泳道1-6分别为人源化候选抗体059-1.43.1-h1l3、059-1.43.1-h1l4、059-1.43.1-h3l3、059-1.43.1-h3l4、059-1.43.1-h4l3、059-1.43.1-h4l4还原电泳；图4示人源化候选抗体059-1.43.1-h1l3、059-1.43.1-h1l4、059-1.43.1-h3l3、059-1.43.1-h3l4、059-1.43.1-h4l3、059-1.43.1-h4l4及059-chab-1.43.1同抗原结合的ec50值；图5示抗体人源化候选抗体059-1.43.1-h1l3、059-1.43.1-h1l4、059-1.43.1-h3l3、059-1.43.1-h3l4、059-1.43.1-h4l3、059-1.43.1-h4l4阻断人cd47与sirpα的结果图；图6示抗体人源化候选抗体059-1.43.1-h1l3、059-1.43.1-h1l4、059-1.43.1-h3l3、059-1.43.1-h3l4、059-1.43.1-h4l3、059-1.43.1-h4l4同raji细胞表面cd47结合的ec50值；图7示抗体促进小鼠腹腔原代巨噬细胞对raji细胞的吞噬，其中红色标记为巨噬细胞，绿色标记为raji细胞；图8示亲和力成熟候选抗体竞争elisa结果图；图8-a示抗体059-1.43.1-h1l3-11～059-1.43.1-h1l3-35的结果；图8-b示抗体059-1.43.1-h1l3-36～059-1.43.1-h1l3-61的结果；图8-c示抗体059-1.43.1-h1l3-62～059-1.43.1-h1l3-86的结果；图8-d示抗体059-1.43.1-h1l3-87～059-1.43.1-h1l3-99的结果；图9示sds-page电泳检测纯化的亲和力成熟候选抗体；泳道m：蛋白质分子量标记；图9-a～9-b中：泳道1-10依次为亲和力成熟抗体059-1.43.1-h1l3-21，059-1.43.1-h1l3-23，059-1.43.1-h1l3-44，059-1.43.1-h1l3-56，059-1.43.1-h1l3-57，059-1.43.1-h1l3-62，059-1.43.1-h1l3-63，059-1.43.1-h1l3-65，059-1.43.1-h1l3-67，059-1.43.1-h1l3-75非还原电泳；图9-c～9-d中：泳道1-10分别为亲和力成熟抗体059-1.43.1-h1l3-21，059-1.43.1-h1l3-23，059-1.43.1-h1l3-44，059-1.43.1-h1l3-56，059-1.43.1-h1l3-57，059-1.43.1-h1l3-62，059-1.43.1-h1l3-63，059-1.43.1-h1l3-65，059-1.43.1-h1l3-67，059-1.43.1-h1l3-75还原电泳；图10示亲和力成熟候选抗体与细胞表面cd47表位竞争facs测定实验结果；其中，图10-a示抗体059-1.43.1-h1l3-21，059-1.43.1-h1l3-23，059-1.43.1-h1l3-44，059-1.43.1-h1l3-56，059-1.43.1-h1l3-57的实验结果；图10-b示抗体059-1.43.1-h1l3-62，059-1.43.1-h1l3-63，059-1.43.1-h1l3-65，059-1.43.1-h1l3-67，059-1.43.1-h1l3-75的实验结果；图11示亲和力成熟候选抗体对npg小鼠接种人淋巴瘤模型的治疗效果图。具体实施方式本发明提供了人源化抗cd47单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用l-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。抗体重链或轻链的“可变区”是该链的n端成熟区域。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α，γ(igg1，igg2，igg3，igg4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kda或大约214个氨基酸)包含一个由nh2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个cooh-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kda或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于fab，fv，scfv和fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。“人源化抗体”是指一种抗体，其包含来源于非人源抗体的cdr区、并且该抗体分子的其他部分来源于一种(或几种)人抗体。而且，为了保留结合亲和力，可以修饰骨架(称为fr)区段的一些残基。所述“单克隆抗体”系指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。所述药物中含有至少一种功能成分，还包括可药用的载体。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如pbs(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。本文使用的“cdr区”或“cdr”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如kabatetal.所定义(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nih,1991,以及以后版本)。存在三个重链cdr和三个轻链cdr。根据情况，本文所用术语cdr或cdrs是为了指示这些区域之一、或者这些区域的几个或者甚至全部，所述区域包含通过抗体对抗原或其识别表位的亲和力而负责结合的大部分氨基酸残基。本发明提供了一种抗体人源化改造方法，在参考多摸板进行fr移植来进行合理的抗体人源化设计，再通过亲和力成熟得到亲和力较高的人源化抗体。本发明提供的人源化抗cd47单克隆抗体的制备方法包括：步骤1：抗体人源化，通过ncbi工具上进行序列比对，完成人源化改造，对改造抗体进行筛选；步骤2：对筛选得到的人源化抗体通过噬菌体展示方法进行亲和力成熟，制得人源化抗cd47单克隆抗体。具体的，该方法包括：所述cd47人源化抗体的制备方法为：以专利cn106084052a中制备的鼠源抗体059-1.43.1为模板，pcr扩增获得抗体重链可变区基因vh和轻链可变区基因vl，将其翻译成氨基酸序列，然后将氨基酸序列在ncbi数据库中人抗体序列进行比对，分别选择与可变区vh和vl相似性最高的5条人抗体序列，作为人源化改造的参考模板，确定鼠源抗体059-1.43.1的cdr区，保留cdr区不变，将上述vh和vl分别5条参考模板中的fr区移植至059-1.43.1中得到人源化序列，经密码子优化后分别构建瞬转表达载体；表达载体转至293e细胞中表达，获得与cd47特异性结合的人源化抗体；对人源化抗体经过亲和力测定、与细胞表面抗原结合ec50值测定、剂量依赖性阻断人cd47与人sirpα的结合及介导小鼠腹腔原代巨噬细胞对raji细胞的吞噬实验，最终获得人源化cd47抗体。为进一步提高抗体的亲和力，选择人源化cd47抗体059-1.43.1-h1l3进行亲和力成熟，以059-1.43.1-h1l3质粒为模板，进行随机突变并构建随机突变文库，通过噬菌体展示筛选得到具有更高亲和力的抗体，对初步筛选抗体经过表达量、elisa测定、竞争elisa、抗原表位竞争、biacorekoff测定、与细胞表面cd47结合的测定、与细胞表面表位竞争测定、对npg小鼠接种人淋巴瘤模型的治疗疗效实验，最终获得亲和力成熟的人源化cd47抗体。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1抗原蛋白、嵌合抗体及阳性对照抗体的制备1.抗原基因合成及表达载体构建融合人源cd47蛋白胞外区氨基酸序列与连接肽-higg1fc或连接肽-7his氨基酸序列，氨基酸序列设计如下所示：人源cd47-higgfc氨基酸序列如下(seqidno:47)：mwplvaalllgsaccgsaqllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspsggggsasepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk人源cd47-7his氨基酸序列如下(seqidno:48)：mwplvaalllgsaccgsaqllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspsggggshhhhhhh上述设计的人cd47蛋白胞外区融合蛋白(cd47ecd-连接肽-higg1fc或cd47ecd-连接肽-7his)所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化，并在优化后的序列5’端加上hindⅲ酶切位点和kozak序列gccgccacc，3’端加上终止密码子tag和ecori酶切位点，并委托金斯瑞公司合成优化后的dna，克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得人puc57simple-cd47-连接肽-higg1fc和或cd47ecd-连接肽-7his质粒。酶切(hindⅲ和ecori)质粒人puc57simple-cd47-连接肽-higg1fc、puc57simple-cd47ecd-连接肽-7his和载体pcdna3.1，电泳回收得到的融合基因片段cd47-连接肽-higg1fc和cd47ecd-连接肽-7his，并与pcdna3.1载体进行连接反应重组构建获得表达质粒：pcdna3.1-人cd47ecd-连接肽-higg1fc；pcdna3.1-人cd47ecd-连接肽-7his；2.059-1.43.1鼠人嵌合抗体表达载体构建分别选择pgs003-higg4ch和pgs003-higkcl作为构建抗人cd47鼠人嵌合抗体的重链和轻链的表达载体。以合成的1.43.1鼠源序列为模板，进行pcr扩增后，使用酶切连接的方法将vh和vl鼠源抗体基因分别克隆到pgs003-higg4ch和pgs003-higkcl得到鼠人嵌合抗体的重链及轻链瞬转表达载体pgs003-059-chab-1.43.1-higg4ch和pgs003-059-chab-1.43.1-higkcl。1.43.1鼠人嵌合抗体重链氨基酸序列如下(seqidno:49)：evqlqqsgpelvkpgasvrmsckasgytftnyvmhwvkqkpgqglewigyinpyndgtkysekfkgkatltsdkssitaymelssltsedsavyycakgglftfdywgqgttltvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg1.43.1鼠人嵌合抗体轻链氨基酸序列如下(seqidno:50)：dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhskgntylhwylqkpgqspklliyrvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpftfgsgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec3.阳性对照抗体表达载体构建分别选择pgs003-higg4ch和pgs003-higkcl作为构建抗人cd47阳性抗体的重链和轻链的表达载体，对阳性抗体可变区氨基酸序列进行密码子优化后，使用酶切方法将vh和vl阳性抗体基因分别克隆到pgs003-higg4ch和pgs003-higkcl得到阳性抗体的重链及轻链瞬转表达载体pgs003-059-p03vh-higg4ch和pgs003-059-p03vl-higkcl。059p03阳性抗体重链可变区氨基酸序列如下(seqidno:87)：qmqlvqsgaevkktgssvkvsckasgfnikdyylhwvrqapgqalewmgwidpdqgdteyaqkfqdrvtitrdrsmstaymelsslrsedtamyycnaaygsssypmdywgqgttvtvss059p03阳性抗体轻链可变区氨基酸序列如下(seqidno:88)：niqmtqspsamsasvggdrvtitckasqdihrylswfqqkpgkvpkhliyranrlvsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyyclqydefpytfgggtkveik4.瞬转表达pcdna3.1-人cd47ecd-连接肽-higg1fc；pcdna3.1-人cd47ecd-连接肽-7his；pgs003-059-chab-1.43.1-higg4ch和pgs003-059-chab-1.43.1-higkcl；pgs003-059-p03vh-higg4ch和pgs003-059-p03vl-higkcl进行瞬时表达。使用freestyletm293e细胞在freestyle培养基中进行瞬转表达。转染前24小时，在125ml锥形瓶中接种0.5×106细胞/ml的293e细胞30ml，37℃5％co2温箱中130rpm摇床培养。转染时先取60微升的293efectin加入到1ml的opti-mem中，充分混匀后，室温孵育5分钟；同时将重组载体总质粒dna的量为30μg，溶于1ml的opti-mem中。然后将质粒dna和293efectin充分混合，总体积为2ml，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞培养孔中，混匀，37℃5％co2温箱中130rpm摇床培养7天。将培养液进行高速离心后取上清进行微孔滤膜抽真空过滤。5.蛋白纯化根据厂家提供的操作方法采用proteina柱(蛋白纯化液相色谱系统/aktapurifier10，ge)、镍柱进行纯化，得到纯化的人cd47ecd-连接肽-higg1fc(hcd47-hfc)，人cd47ecd-连接肽-7his(hcd47-his)融合蛋白，鼠人嵌合抗体059-chab-1.43.1及阳性抗体059-p03。如图1～2。实施例2人源化选取专利cn106084052a中的鼠源抗体059-1.43.1为进行人源化，人源化过程包括主要为人源模板搜索及移植。人源化改造的主要目标是可变区中fr序列。以专利cn106084052a中的鼠源抗体059-1.43.1vh及vl的氨基酸为模板，在ncbi网站上进行序列比对，找到人源化参考序列5条，作为抗体fr区人源化改造的参考模板设计人源化改造序列。cdr区具体序列见表1，blastp具体序列见表2，保留fr区移植后的人源化抗体序列见表3。表1、059-1.43.1抗体cdr区具体序列表2、059-1.43.1抗体人源化参考序列表3、059-1.43.1抗体人源化序列实施例3cd47人源化全长抗体的制备1.全长抗体瞬时转染表达载体的构建分别选择pgs003-higg4ch和pgs003-higkcl作为构建抗人cd47全长抗体的重链和轻链的表达载体。对1.43.1人源化抗体序列进行密码子优化，经pcr扩增后，重链使用hindⅲ及nhei进行酶切，轻链使用hindⅲ及nari进行酶切，然后将5个vh和5个vl抗体基因分别克隆到pgs003-higg4ch和pgs003-higkcl，如表4。测序鉴定抗体基因正确插入后，将重组表达载体转化大肠杆菌top10f’，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃振荡培养16小时。使用zymoresearch的去内毒素大提试剂盒抽提质粒，最后将质粒溶于1ml超纯水，用分光光度计测定质粒浓度和od260/280。od260/280在1.8～1.9为纯度较高的质粒dna。表4、重链和轻链瞬时转染表达载体列表重链表达载体名称轻链表达载体名称h1l1h2l2h3l3h4l4h5l52.在哺乳动物细胞293e中的转染、表达和检测将上述5个重链表达载体和5个轻链表达载体两两组合(共25种组合)后进行2ml293e体系的瞬时转染表达评估，对25种组合进行表达量和elisa值评估，具体数值见表5，优选h1l3、h1l4、h3l3、h3l4、h4l3、h4l4这6个全长抗体，分别命名为059-1.43.1-h1l3、059-1.43.1-h1l4、059-1.43.1-h3l3、059-1.43.1-h3l4、059-1.43.1-h4l3、059-1.43.1-h4l4。表5、5×5组合全长抗体小体系瞬时转染表达的表达量及ec50检测值使用293e在freestyle培养基中进行6个候选抗体的瞬时转染表达。转染前24小时，在1l细胞培养瓶中接种0.5×106细胞/ml的293e细胞300ml，37℃5％co2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取300μl的293fectin加入到5.7ml的opti-mem中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将重链和轻链表达质粒各300μg使用opti-mem稀释至6ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％co2温箱中120rpm摇床培养7天。3.抗体的纯化及检测2000g20min离心细胞培养液，收集上清，用octet检测上清中抗体表达量，见表6。表6、6个候选抗体300ml瞬时转染表达的表达量检测抗体名称重链序列轻链序列瞬时转染表达量(mg/l)059-1.43.1-h1l3h1l398.4059-1.43.1-h1l4h1l486.5059-1.43.1-h3l3h3l385.9059-1.43.1-h3l4h3l479.6059-1.43.1-h4l3h4l3111.2059-1.43.1-h4l4h4l492.5将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后过mabselectsure亲和层析柱(ge)，20mm枸橼酸-枸橼酸纳，ph3.0洗脱，用1mtrisbase调节ph至中性，加入10×pbs调节成等渗溶液。4～20％梯度胶(南京金斯瑞生物科技有限公司)进行sds-page检测纯化蛋白质，结果见下图3。实施例4人源化候选抗体ec50值测定包被：将人cd47ecd-连接肽-7his用cbs(ph9.4)稀释成1μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔50μl，2～8℃下孵育过夜。封闭：用pbst洗板三次后，用3％bsa封闭，每孔200μl，25℃下孵育1小时。样品处理：分别取人源化候选抗体及059-chab-1.43.1嵌合抗体50μl，以10μg/ml为起始浓度进行2倍梯度稀释(20～2-11)。加抗体：用pbst洗板四次后，加入抗人igg(h+l)-hrp抗体，1:5000稀释液，50μl/孔，25℃孵育1h。显色：洗板四次后，加tmb显色液，每孔50μl，室温下避光显色3分钟。终止：直接加终止液终止反应，每孔50μl。检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其od值，保存原始数据。数据处理：将原始数据输入到软件softmaxpro6.2.1中进行数据处理。具体数据图见图4和表7。结果显示相对于059-chab-1.43.1嵌合抗体，6个人源化候选抗体均与hcd47有结合。表7、6个候选抗体同抗原结合ec50值抗体名称ec50(μg/ml)059-1.43.1-h1l30.11600059-1.43.1-h1l40.09508059-1.43.1-h3l30.10500059-1.43.1-h3l40.08422059-1.43.1-h4l30.08958059-1.43.1-h4l40.07212059-chab-1.43.10.04903实施例5人源化候选抗体kd值的测定应用biacore-t200检测，使用proteina芯片捕获候选抗体或阳性抗体，用不同浓度的cd47流经芯片，根据采集数据进行拟合分析。检测样品浓度分别200nmol/l、100nmol/l、50nmol/l、25nmol/l、12.5nmol/l、6.25nmol/l、3.125nmol/l、1.56nmol/l，其中以6.25nmol/l样品为重复检测样品。检测条件为：捕获时间，30s；抗原结合时间120s；解离时间300s；流速30μl/min，再生条件为gly-hcl(ph1.5)，150s。具体实验结果见表8。由实验结果可知，相对于鼠人嵌合抗体，人源化抗体kd值可同鼠源抗体保持相当水平。表8、6个候选抗体kd值检测抗体名称ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)059-1.43.1-h1l33.79e+055.61e-031.48e-08059-1.43.1-h1l43.90e+053.44e-038.83e-09059-1.43.1-h3l37.08e+056.52e-039.21e-09059-1.43.1-h3l45.13e+054.13e-038.04e-09059-1.43.1-h4l34.11e+053.84e-039.34e-09059-1.43.1-h4l44.04e+052.39e-035.92e-09059-chab-1.43.11.10e+062.83e-032.58e-09注：e-03：×10-3；e-08：×10-08；e-09：×10-09；e+05：×105；e+06：×106；实施例6人源化候选抗体剂量依赖性阻断人cd47与人sirpα的结合(elisa法)包被：hcd47-hfc用pbs稀释成2μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔100μl，4℃下孵育过夜。封闭：洗板3次后用1％bsa+pbs封闭，每孔300μl，室温下孵育1小时。候选抗体及阳性对照b6h12(商业化cd47抗体，购自abcam，货号：ab3283)与人sirpα-his(购自义翘神州)的混合：纯化的候选抗体及阳性对照分别用pbst稀释成20μg/ml，以pbst溶液进行3倍梯度稀释，共稀释7个梯度；人sirpα-his蛋白用pbst稀释成500ng/ml，1:1混合不同稀释梯度的候选抗体和人sirpα-his蛋白，室温下孵育30min。加候选抗体与人sirpα-his蛋白的混合物：每孔100μl,室温下反应1h，对照孔加入igg同种型对照与人sirpα-his蛋白的混合物。加二抗：洗板3次后，加入抗anti-his-hrp(1:3000)，每孔100μl，室温条件下反应1小时。显色：洗板4次后，加tmb显色液，每孔100μl，室温下避光显色10分钟。终止：直接加终止液终止反应，每孔100μl。检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其od值，保存原始数据。数据处理：将原始数据输入到软件softmaxpro6.2.1中进行数据处理。结果如表9、图5所示(图中的数据为最终计算所得数据)。结果表明相对于鼠人嵌合抗体059-chab-1.43.1，人源化候选抗体059-1.43.1-h1l3、059-1.43.1-h1l4、059-1.43.1-h3l3、059-1.43.1-h3l4、059-1.43.1-h4l3、059-1.43.1-h4l4均有阻断效果，其中059-1.43.1-h1l3、059-1.43.1-h4l4抗体阻断效果较好。表9、6个候选抗体抗原表位竞争elisa值抗体名称sirpαic50(μg/ml)059-1.43.1-h1l32.713059-1.43.1-h1l43.225059-1.43.1-h3l33.446059-1.43.1-h3l43.398059-1.43.1-h4l33.084059-1.43.1-h4l42.689059-chab-1.43.13.410b6h123.339实施例7人源化候选抗体与细胞表面cd47结合的测定(facs法)培养raji细胞后收集，1500rpm离心4min，弃上清，pbs洗涤1次后进行活细胞计数，1500rpm离心4min，弃上清，pbs重悬细胞浓度至1×106/ml，将稀释好的细胞加入96孔板中，每孔50μl。对人源化候选抗体进行2倍梯度稀释，共稀释12个梯度。1500rpm4min离心96孔板中raji细胞，用上述稀释好的人源化抗体重悬细胞，每孔100μl，4℃孵育1小时。1500rpm4min离心上述96孔板，弃上清，pbs重悬细胞，每孔180μl。1500rpm4min离心上述96孔板，弃上清，加入100μl抗fc二抗，4℃孵育0.5小时。1500rpm4min离心上述96孔板，弃上清，pbs重悬细胞，每孔180μl。1500rpm4min离心上述96孔板，pbs重悬细胞，每孔100μl，立即上机测试。结果如表10、图6所示。结果显示，相对于嵌合抗体，6个人源化候选抗体均与细胞表面cd47有结合活性，其中059-1.43.1-h1l4、059-1.43.1-h4l4结合活性较强。表10、6个候选抗体与raji细胞表面cd47结合的结果实施例8cd47抗体介导小鼠腹腔原代巨噬细胞对raji细胞的吞噬实验1.c57鼠腹腔原代巨噬细胞制备引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器注10mldpbs液入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mleagle培养基，计数细胞。为获取3×105贴附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用eagle液冲洗1～2次后，再加新eagle培养液置37℃，5％co2温箱中培养。2.巨噬细胞吞噬实验通过荧光成像法考察实施例3制备的cd47抗体对c57bl小鼠腹腔原代巨噬细胞对raji细胞吞噬作用的影响。提前一天用pkh26染料对小鼠巨噬细胞进行染色(4微摩、5min)，以2万细胞/孔接种于96孔板；次日用cfse染料染色raji细胞(2微摩、10min)，清洗后raji细胞重悬于无血清培养基中，以8万细胞/孔接种于巨噬细胞上。接板raji细胞前2小时将巨噬细胞中有血清培养基换成无血清培养基，将各种抗体以10微克/ml的浓度加入到两种混悬细胞中。培养2小时后，洗去未被吞噬的raji细胞，荧光显微镜进行细胞成像后，通过计算每100个巨噬细胞中吞噬多少raji细胞，即吞噬指数，来定量分析cd47抗体促吞噬作用的优劣。结果见图7(吞噬效果图)和表11(吞噬指数)。结果显示，当加入抗体浓度为10微克/ml时，相对于鼠人嵌合抗体，人源化候选抗体吞噬作用均较弱；加入抗体浓度为50微克/ml时，059-1.43.1-h1l3与鼠人嵌合抗体的吞噬指数接近。表11、cd47抗体促进巨噬细胞对raji细胞的吞噬抗体名称吞噬指数(raji-10μg/ml)吞噬指数(raji-50μg/ml)059-1.43.1-h1l32452059-1.43.1-h1l42531059-1.43.1-h3l32631059-1.43.1-h3l42228059-1.43.1-h4l32320059-1.43.1-h4l43535059-chab-1.43.15858igg07b6h122831实施例9人源化抗体亲和力成熟为了进一步提高人源化抗体的亲和力，选取059-1.43.1-h1l3构建单链scfv抗体，正确克隆为a5895，对a5895进行随机突变，构建随机突变库，并将突变的单链抗体库进行噬菌体展示，然后通过elisa筛选得到更高亲和力的抗体。采用agilenttechnologies公司的genemorphiirandommutagenesis试剂盒(200550)，以a5895质粒为模板，以vh正向引物和vl反向引物进行易错pcr扩增，将扩增好的pcr产物进行纯化、酶切、连接到pgs249载体上，然后电转化到tg1感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培养，获得随机突变体库。取100倍突变体库容量的菌液接种880ml2yt-ag培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)，37℃、200rpm培养至od600＝0.5～0.6，加入细胞密度100倍的辅助噬菌体，侵染1.5h，离心收集菌体，用400ml2yt-ak培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和75μg/ml卡那霉素)重悬细胞，30℃、200rpm培养过夜。将上一步培养物10000g4℃离心20min，收集上清加入1/4体积的peg/nacl，混匀，冰上静置1h；12000g4℃离心25min，弃上清，离心管倒扣在平板纸上，使液体除尽；用2ml预冷1×pbs重悬噬菌体沉淀，12000g4℃离心10min；转移上清到新的15ml离心管中，加入终浓度为3％bsa，即获得第一轮起始噬菌体。以hcd47-his(实施例1制备)为抗原包被免疫管，采用2％的m-pbs封闭；然后加入1013的第一轮起始噬菌体进行抗体抗原结合，用pbst洗去未结合的噬菌体，用ph3.0的洗脱液洗脱并用ph8.0的tris-hcl中和，将洗脱得到的噬菌体重新感染tg1，进行洗脱产物的扩增，培养过夜后收集上清，peg/nacl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行4轮噬菌体库的富集筛选，抗原量依次降低，洗涤强度依次增强，每轮洗脱产物均进行滴度测定。将第1～4轮淘选后的菌液有限稀释涂布平板，培养过夜后；挑取单克隆于分装有0.5ml/孔2yt-ag培养基的96孔深孔板培养过夜；然后将过夜培养物按照1:10转接至含有0.5ml/孔2yt-ag培养基的96孔深孔板中，培养至od600＝0.5～0.6，3000g离心收集菌体，用2yt-ai培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和1mmiptg)重悬菌体，30℃诱导过夜，第二天离心转移上清至洁净的96孔深孔板，加入终浓度为3％bsa，获得单克隆phage样品。以hcd47-his(实施例1制备)为抗原包被96孔酶标板，封闭后向每孔中加入50μl单克隆phage样品，25℃孵育1h；然后向每孔中加入200μlpbst，振荡5～10s，弃溶液，重复3～5次；之后向每孔中加入抗m13-hrp抗体pbs稀释液50μl，25℃孵育1h；然后向每孔中加入200μlpbst，振荡5～10s，弃溶液，重复5次；向每孔中加入50μltmb显色液，显色3～10min(具体显色时间视显色速度而定)，之后向每孔中加入50μl1mh2so4终止显色；使用酶标仪测定od450值。依据单克隆phageelisa数据共筛选3906个克隆，根据elisa结果送测759个克隆进行测定，结合elisa值，最终获得独特的单克隆抗体序列共8条重链8条轻链，包含骨架区的重链可变区及轻链可变区的具体序列见表12。表12、059-1.43.1-h1l3亲和力成熟单克隆抗体可变区具体序列实施例10亲和力成熟全长抗体制备1.全长抗体瞬时转染表达载体的构建分别选择pgs003-higg4ch和pgs003-higkcl作为构建抗cd47全长抗体的重链和轻链的表达载体。根据vh、vl的基因序列及载体中的多克隆位点设计引物。经pcr扩增后，使用体外重组的方法将8个vh和8个vl抗体基因分别克隆到pgs003-higg4ch和pgs003-higkcl，如表13。测序鉴定抗体基因正确插入后，将重组表达载体转化大肠杆菌top10f’，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃振荡培养16小时。使用zymoresearch的去内毒素大提试剂盒抽提质粒，最后将质粒溶于1ml超纯水，用分光光度计测定质粒浓度和od260/280。od260/280在1.8～1.9为纯度较高的质粒dna。表13、重链和轻链瞬时转染表达载体列表重链表达载体名称轻链表达载体名称ah1al1ah2al2ah3al3ah4al4ah5al5ah6al6ah7al7ah8al82.在哺乳动物细胞293e中的转染、表达和检测将上述亲和力成熟候选8个重链表达载体、8个轻链表达载体及嵌合抗体的重链和轻链两两组合(共81种组合)后进行2ml293e体系的瞬时转染表达评估，对81种组合进行表达量评估，对表达量评估后将81种表达上清均稀释至100ng/ml后进行elisa测定评估，具体数值见表14。表14、9×9组合全长抗体小体系瞬时转染表达的表达量和elisa结果3.亲和力成熟候选抗体抗原表位竞争elisa将上述9个重链表达载体和9个轻链表达载体两两组合(共81种组合)后，分成4次进行竞争elisa评估，其中嵌合抗体ah9al9为对照，对81种组合进行竞争elisa，具体数值见表15。为方便描述，后续亲和力抗体组合名称直接以阿拉伯数字的编号表述。包被：hcd47-hfc用pbs稀释成1μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔50μl，4℃下孵育过夜。封闭：洗板3次后用1％bsa+pbs封闭，每孔300μl，室温下孵育1小时。亲和力成熟候选抗体与生物素化059-chab-1.43.1蛋白的混合：亲和力成熟候选抗体分别用pbst稀释成10μg/ml，以pbst溶液进行4倍梯度稀释，共稀释4个梯度；生物素化059-chab-1.43.1蛋白用pbst稀释成0.33μg/ml,1:1混合不同稀释梯度的候选抗体和人sirp-his蛋白，室温下孵育1h。加候选抗体与生物素化059-chab-1.43.1蛋白的混合物：每孔50μl,室温下反应1h，阳性对照孔加入059-chab-1.43.1纯化蛋白与生物素化059-chab-1.43.1蛋白的混合物。加二抗：洗板3次后，加入抗生物素(sa)标签抗体，sa-hrp(1:5000)，每孔50μl，室温条件下反应1小时。显色：洗板4次后，加tmb显色液，每孔50μl，室温下避光显色3分钟。终止：直接加终止液终止反应，每孔50μl。检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其od值，保存原始数据。数据处理：将原始数据输入到软件softmaxpro6.2.1中进行数据处理。结果如表15、图8所示(图中的数据为最终计算所得数据)。表15、9×9组合全长抗体小体系瞬时转染表达的竞争elisa检测值4亲和力成熟候选抗体biacorekoff测定应用biacore8k检测，使用proteina芯片捕获候选抗体或阳性抗体，用不同浓度的cd47流经芯片，根据采集数据进行拟合分析。检测样品浓度分别0nmol/l、100nmol/l。检测条件为：捕获时间，30s；抗原结合时间60s；解离时间120s；流速30μl/min，再生条件为gly-hcl(ph1.5)，30s。具体实验结果见表16。表16、9×9组合全长抗体biacorekoff检测值5、抗体的纯化及检测根据亲和力成熟候选抗体的表达、竞争elisa测定及biacorekoff测定，选定059-1.43.1-h1l3-21，059-1.43.1-h1l3-21，059-1.43.1-h1l3-44，059-1.43.1-h1l3-56，059-1.43.1-h1l3-57，059-1.43.1-h1l3-62，059-1.43.1-h1l3-63，059-1.43.1-h1l3-65，059-1.43.1-h1l3-67，059-1.43.1-h1l3-7510个分子作为亲和力成熟候选分子进行扩大培养。使用293e细胞在freestyle培养基中进行10个候选抗体的瞬时转染表达。转染前24小时，在1l细胞培养瓶中接种0.5×106细胞/ml的293e细胞300ml，37℃5％co2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取300μl的293fectin加入到5.7ml的opti-mem中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将重链和轻链表达质粒各300μg使用opti-mem稀释至6ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％co2温箱中120rpm摇床培养7天。2000g20min离心细胞培养液，收集上清，用octet检测上清中抗体表达量，见表17。表17、10个亲和力成熟候选抗体300ml瞬时转染表达的表达量检测将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后过mabselectsure亲和层析柱(ge)，20mm枸橼酸-枸橼酸纳，ph3.0洗脱，用1mtrisbase调节ph至中性，加入10×pbs调节成等渗溶液。4～20％梯度胶(南京金斯瑞生物科技有限公司)进行sds-page检测纯化蛋白质，结果见图9。实施例11与细胞表面cd47结合的测定(facs法)培养raji细胞后收集，1500rpm离心4min，弃上清，pbs洗涤1次后进行活细胞计数，1500rpm离心4min，弃上清，pbs重悬细胞浓度至1*106/ml，将稀释好的细胞加入96孔板中，每孔50μl。对人源化候选抗体进行2倍梯度稀释，共稀释12个梯度梯度。1500rpm4min离心96孔板中raji细胞，用上述稀释好的人源化抗体重悬细胞，每孔100μl，4℃孵育1小时。1500rpm4min离心上述96孔板，弃上清，pbs重悬细胞，每孔180μl。1500rpm4min离心上述96孔板，弃上清，加入100μl抗fc二抗，4℃孵育0.5小时。1500rpm4min离心上述96孔板，pbs重悬细胞，每孔180μl。1500rpm4min离心上述96孔板，pbs重悬细胞，每孔100μl，立即上机测试。结果如表18所示。结果显示，亲和力成熟抗体亲和力相对于人源化抗体059-1.43.1-h1l3，10个亲和力成熟候选抗体中有9个抗体的亲和力均有提升，其中059-1.43.1-h1l3-23、059-1.43.1-h1l3-57、059-1.43.1-h1l3-62、059-1.43.1-h1l3-63、059-1.43.1-h1l3-65、059-1.43.1-h1l3-67结合活性较强。表18、10个亲和力成熟候选抗体与细胞表面cd47结合测定结果样品名称kd(m)bmax(mol/l)059-1.43.1-h1l3-211.52e-111.22e-10059-1.43.1-h1l3-233.75e-121.32e-10059-1.43.1-h1l3-442.40e-091.15e-10059-1.43.1-h1l3-561.10e-091.25e-10059-1.43.1-h1l3-578.50e-121.30e-10059-1.43.1-h1l3-629.40e-121.28e-10059-1.43.1-h1l3-634.76e-121.44e-10059-1.43.1-h1l3-654.35e-121.41e-10059-1.43.1-h1l3-672.71e-121.40e-10059-1.43.1-h1l3-752.33e-111.20e-10059-1.43.1-h1l31.19e-098.70e-11实施例12亲和力成熟候选抗体细胞表面表位竞争测定(facs法)1500转，4分钟，离心raji细胞弃上清，pbs重悬细胞浓度至1×106/ml后，加入96孔板中，100μl/孔。对10个亲和力成熟候选抗体进行16倍梯度稀释，共稀释12个梯度梯度。同样方式稀释生物素化的人源抗体059-1.43.1-h1l3。将亲和力成熟候选抗体及生物素化的人源抗体059-1.43.1-h1l3以1：1的比例混合。1500转，4分钟，离心上述细胞，弃上清，用亲和力成熟候选抗体及生物素化的人源抗体的混合液重悬细胞，100μl/孔。4℃孵育0.5小时。pbs洗板两次后，加入抗fc二抗，100μl/孔，4℃避光孵育0.5小时。pbs洗板两次后，用1％牛血清白蛋白重悬细胞，100μl/孔，4℃避光存放至上机。实验结果见表19及图10。结果显示10个亲和力成熟候选抗体同细胞表面的的结合表位同人源化抗体相同或相近。表19、10个亲和力成熟候选抗体与细胞表面表位竞争测定结果bin1:与059-1.43.1-h1l3结合表位相同或相近bin2:与059-1.43.1-h1l3的结合表位相近bin3:与059-1.43.1-h1l3的结合表位不同实施例13cd47亲和力成熟抗体介导小鼠腹腔原代巨噬细胞对raji细胞的吞噬实验1.c57鼠腹腔原代巨噬细胞制备引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器注10mldpbs液入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mleagle培养基，计数细胞。为获取3×105贴附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用eagle液冲洗1～2次后，再加新eagle培养液置37℃，5％co2温箱中培养。2.巨噬细胞吞噬实验通过facs法考察cd47人源化亲和力成熟候选抗体059-1.43.1-h1l3-23、059-1.43.1-h1l3-57、059-1.43.1-h1l3-63、059-1.43.1-h1l3-65、059-1.43.1-h1l3-67对c57bl小鼠腹腔原代巨噬细胞对raji细胞吞噬作用的影响。提前一天用pkh26染料对小鼠巨噬细胞进行染色(4μmol、5min)，以6万细胞/孔接种于96孔板；次日用cfse染料染色raji细胞(2μmol、10min)，清洗后raji细胞重悬于无血清培养基中，以24万细胞/孔接种于巨噬细胞上。接板raji细胞前2小时将巨噬细胞中有血清培养基换成无血清培养基，将各种抗体以0.06μg/ml及0.25μg/ml的浓度分别加入到两种混悬细胞中。孵育2小时后，洗去未被吞噬的raji细胞，每孔加200μl胰蛋白酶消化5min，消化下来的细胞2000rpm离心5min后，用500μlpbs重悬于流式管中，流式细胞仪facscantoⅱ上机检测分析后，计算巨噬细胞pkh26双阳的细胞群占总巨噬细胞的比例，即吞噬指数，来定量分析cd47抗体促吞噬作用的优劣。结果见表20(吞噬指数)。结果显示，相对于人源化抗体059-1.43.1-h1l3，当加入抗体浓度为0.06μg/ml时，5个亲和力成熟抗体吞噬作用均有明显提高；加入抗体浓度为0.25μg/ml时，5个亲和力成熟抗体吞噬作用均有提高。表20、cd47抗体促进巨噬细胞对raji细胞的吞噬抗体名称吞噬指数(％)(raji-0.06μg/ml)吞噬指数(％)(raji-0.25μg/ml)059-1.43.1-h1l3-234852059-1.43.1-h1l3-574852059-1.43.1-h1l3-634855059-1.43.1-h1l3-655259059-1.43.1-h1l3-675151059-1.43.1-h1l3737iggna5实施例14亲和力成熟优选抗体对npg小鼠接种人淋巴瘤模型的治疗疗效根据实施例11、12及13实验结果，优选3个亲和力成熟抗体059-1.43.1-h1l3-23、059-1.43.1-h1l3-63、059-1.43.1-h1l3-67进行动物实验。实验动物采用npg小鼠，体重18～20g，鼠6～8周龄。体外培养raji肿瘤细胞，将raji肿瘤细胞与基质胶1：1混合，按2*106cells/100μl接种到npg小鼠右腹侧腋下处。观察皮下瘤后生长情况，当平均瘤体积达到70-100mm3时，随机将30只肿瘤小鼠分成a、b、c、d、e共5组，每组6只。其中a组为059-1.43.1-h1l3-63抗体治疗组；b组为059-1.43.1-h1l3-67抗体治疗组；c组为dpbs阴性对照组；d组为059-1.43.1-h1l3-23抗体治疗组；e组为059-1.43.1-h1l3抗体治疗组；f组为059p03阳性对照组；分别于第7、10、13、16、19天腹腔注射药物，给药剂量为5mg/kg，同时监测记录小鼠皮下瘤体积大小。完成5次给药后，观察3-6天荷瘤小鼠的肿瘤生长情况。评价药物疗效的标准是给药组荷瘤小鼠的肿瘤生长停止或减慢。由实验结果可知，实验结束时，pbs对照组小鼠肿瘤平均体积达到2430mm3。而a、b、d、e、f组产生显著的抑制肿瘤生长效果，肿瘤的平均体积分别为61、388、563、474、404mm3(见图11)，肿瘤抑制率分别为97％，84％，76％，80％，83％。通过方差分析，a、b、d、e四种抗体相对于对照组，其p值<0.001，具有显著性差异，表现出显著的抗肿瘤疗效。相对于人源化抗体059-1.43.1-h1l3，亲和力成熟候选抗体059-1.43.1-h1l3-63、059-1.43.1-h1l3-67、059-1.43.1-h1l3-23均有疗效，其中组a059-1.43.1-h1l3-63的疗效最为显著，与其他各组相比，皆存在统计学差异，p<0.05，结果见图11。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>长春金赛药业股份有限公司<120>人源化抗cd47单克隆抗体及其应用<130>mp1809592<160>88<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(4)..(4)<223>xaa=ile或met<220><221>unsure<222>(4)..(4)<223>the'xaa'atlocation4standsforgln,arg,pro,orleu.<400>1asntyrvalxaahis15<210>2<211>17<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(11)..(11)<223>xaa=tyr或his<220><221>unsure<222>(11)..(11)<223>the'xaa'atlocation11standsforgln,arg,pro,orleu.<400>2tyrileasnprotyrasnaspglythrlysxaaserglulysphelys151015gly<210>3<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(8)..(8)<223>xaa=tyr或asn<220><221>unsure<222>(8)..(8)<223>the'xaa'atlocation8standsforgln,arg,pro,orleu.<400>3glyglyleuphethrpheaspxaatrp15<210>4<211>16<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(1)..(1)<223>xaa1=arg或ser<220><221>unsure<222>(11)..(11)<223>xaa1=gly或ser<220><221>unsure<222>(1)..(1)<223>the'xaa'atlocation1standsforgln,arg,pro,orleu.<220><221>unsure<222>(11)..(11)<223>the'xaa'atlocation11standsforgln,arg,pro,orleu.<400>4xaaserserglnserleuvalhisarglysxaaasnthrtyrleuhis151015<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(7)..(7)<223>xaa=arg或ser<220><221>unsure<222>(7)..(7)<223>the'xaa'atlocation7standsforgln,arg,pro,orleu.<400>5argvalserasnargphexaa15<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(4)..(4)<223>xaa=thr或ser,<220><221>unsure<222>(6)..(6)<223>xaa=glu或val<220><221>unsure<222>(9)..(9)<223>xaa=thr或ser<220><221>unsure<222>(4)..(4)<223>the'xaa'atlocation4standsforgln,arg,pro,orleu.<220><221>unsure<222>(6)..(6)<223>the'xaa'atlocation6standsforgln,arg,pro,orleu.<220><221>unsure<222>(9)..(9)<223>the'xaa'atlocation9standsforgln,arg,pro,orleu.<400>6serglnserxaahisxaaprophexaa15<210>7<211>30<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(2)..(2)<223>xaa=val或ala<220><221>unsure<222>(2)..(2)<223>the'xaa'atlocation2standsforgln,arg,pro,orleu.<400>7glnxaaglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethr202530<210>8<211>14<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8trpvalargglnalaproglyglnargleuglutrpmetgly1510<210>9<211>32<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(11)..(11)<223>xaa=ser或asn；<220><221>unsure<222>(32)..(32)<223>xaa=arg或lys<220><221>unsure<222>(11)..(11)<223>the'xaa'atlocation11standsforgln,arg,pro,orleu.<220><221>unsure<222>(32)..(32)<223>the'xaa'atlocation32standsforgln,arg,pro,orleu.<400>9argvalthrilethrargaspthrseralaxaathralatyrmetglu151015leuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysalaxaa202530<210>10<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(5)..(5)<223>xaa=gln或leu；<220><221>unsure<222>(9)..(9)<223>xaa=pro或ser<220><221>unsure<222>(5)..(5)<223>the'xaa'atlocation5standsforgln,arg,pro,orleu.<220><221>unsure<222>(9)..(9)<223>the'xaa'atlocation9standsforgln,arg,pro,orleu.<400>10glyglnglythrxaavalthrvalxaaser1510<210>11<211>23<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>11aspilevalmetthrglnserproleuserleuprovalthrprogly151015gluproalaserilesercys20<210>12<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>12trptyrleuglnlysproglyglnserproglnleuleuiletyr151015<210>13<211>32<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>13glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr151015leulysileserargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcys202530<210>14<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>14pheglyglnglythrlysvalgluilelys1510<210>15<211>117<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>15glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530valilehistrpvalargglnalaproglyglnargleuglutrpmet354045glytyrileasnprotyrasnaspglythrlystyrserglulysphe505560lysglyargvalthrilethrargaspthrseralaserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglyglyleuphethrpheasptyrtrpglyglnglythrleu100105110valthrvalserser115<210>16<211>117<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>16glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530valmethistrpvalargglnalaproglyglnargleuglutrpmet354045glytyrileasnprotyrasnaspglythrlystyrserglulysphe505560lysglyargvalthrilethrargaspthrseralaserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglyglyleuphethrpheaspasntrpglyglnglythrleu100105110valthrvalserser115<210>17<211>117<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>17glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530valmethistrpvalargglnalaproglyglnargleuglutrpmet354045glytyrileasnprotyrasnaspglythrlyshisserglulysphe505560lysglyargvalthrilethrargaspthrseralaserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglyglyleuphethrpheasptyrtrpglyglnglythrleu100105110valthrvalserser115<210>18<211>117<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>18glnalaglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalase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