本发明涉及多糖提取
技术领域：
，尤其是涉及羊栖菜抗衰老多糖的提取方法。
背景技术：
：多糖（polysaccharide）广泛存在于动植物和微生物等有机体中，是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚合物，它是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的高分子化合物。一般植物多糖由成百上千个单糖组成，由于单糖的种类和连结方式以及异头碳的构型都会影响多糖的结构，因此从自然界获得到的多糖在结构上远比蛋白质和核酸的结构要复杂很多。进入20世纪90年代后，多糖及复合物的分离纯化、组分测定和结构分析等方面的研究有了长足进步，同时由于细胞生物学和分子生物学的发展，研究发现了糖类化合物特别是糖复合物上的糖链参与了各种生命现象的调节，如细胞识别、粘连与融合、信号传达、免疫与应答、细胞转化和分化都离不开糖链的参与。由于糖复合物的种种功效，其研究也成为生命科学研究领域的新前沿。大量研究表明，多糖具有抗肿瘤、抗凝血、降血糖、抗氧化和免疫等活性，且没有细胞毒性，应用于生物体毒副作用小，因此在临床和功能食品上得到了广泛使用，相关多糖生物资源的研究和开发利用受到海内外科学家的日益关注，成为天然药物研发、生物化学等领域的研究热点。羊栖菜系褐藻门马尾藻科马尾藻属植物，别名玉草、海草、六角菜，作为药食两用经济海藻，有“长寿菜”美称，被推崇为益寿食品。多糖是羊栖菜中含量最多的特色成分，约占其干重的45%-65%。研究表明，除作为膳食纤维调理胃肠功能、调节机体对脂类和糖类等的代谢作用外，羊栖菜多糖还具有抗氧化、抗肿瘤和增强免疫等生物活性。这些作用能够直接或间接地改善人体健康状况，降低有害刺激对机体的损伤，减缓与衰老相关疾病的进程。由此推测，多糖是羊栖菜发挥抗衰老作用的有效成分。目前，羊栖菜多糖提取技术主要有酶解法、碱解法、酸解法、水提取法、超声波辅助，但现有羊栖菜多糖的提取方法中，都存有不足，包括成本太高，操作复杂，耗能耗材较多，多糖含量和纯度不高等。最重要的是：多糖粗提取物往往是复杂的混合物，既包括分子量不同、结构不同的多糖片段，又包括蛋白质、色素等物质。因此需要对其进行分离纯化处理。现有技术如授权公告号为cn105601762b的中国发明专利，公开了一种操作步骤简单、耗能耗材少、多糖含量及纯度较高的羊栖菜多糖的提取方法，包括如下步骤：(1)烘干羊栖菜，粉碎成粉，过40-200目筛网；(2)将步骤(1)中得到的羊栖菜藻粉和95%乙醇充分混合，进行回流脱脂；(3)回收步骤(2)中脱脂后的藻粉，加入蒸馏水，通过绢筛进行过滤多次收集滤液，合并上述滤液，进行减压浓缩，得到浓缩液；(4)步骤(3)中浓缩液，按照浓缩液，加入95%乙醇，醇沉后，离心，收集沉淀，加入蒸馏水，搅拌至完全溶解；(5)将步骤(4)中的多糖溶液，冷冻真空干燥，得到多糖产物。但是该羊栖菜多糖的纯度均较低，色泽较差。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种提取方法简单可行，多糖的提取效率、得率和纯度均较高，色素去除率高的羊栖菜抗衰老多糖的提取方法。本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，包括褐藻粗多糖提取液制备、大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，具体步骤为：抗衰老粗多糖制备：将羊栖菜粉利用浓度为93-97%的乙醇溶液回流1.5-2.5h，重复回流2-4次，除去色素、去脂以及去单糖，然后加入28-33倍量蒸馏水和羊栖菜粉重量0.03-0.05‰乳酸钙，在80-90℃、功率为120-170w下超声辅助提取2.5-3.5h，过滤，滤液即为抗衰老粗多糖溶液，利用超声波作用产生空化效应，在组织细胞内形成高压，高压的释放在溶液中形成强大的冲击波，能够有效地减小、消除水与羊栖菜之间的阻力，从而加大了传质效率，同时细胞组织受到冲击波产生的物理剪切力而变形破裂，释放出胞内物质，大大加速了提取过程，且由于抗衰老多糖是极性的，不溶于乙醇溶液，因此利用乙醇溶液使抗衰老多糖形成沉淀，从而使多糖与水溶性单糖等其他物质分离；大孔树脂纯化：将抗衰老粗多糖溶液调配成浓度3-5mg/ml的溶液后上样至大孔树脂d3520-cl柱进行纯化，用去离子水进行洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩至粘稠状态，再向浓缩液中加乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，备用，该步骤用d3520-cl在其中引入了具有较高活性的氯甲基(−ch2cl)，提高了非极性大孔树脂d3520的极性，使得抗衰老多糖中的色素和蛋白质易于进入d3520-cl的内部，与其内部的活性位点产生吸附作用，从而提高其吸附量，可以有效能够除去抗衰老多糖中的色素和蛋白质，有效提高多糖的纯度，同时可有效保护多糖的结构和活性；离子交换层析：将大孔树脂纯化后的多糖用去离子水配成浓度18-22mg/ml的溶液，上样至deaesepharosecl-6b柱进行离子交换层析纯化，分别用0mol/l、0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l的氯化钠溶液进行梯度洗脱，不同浓度的氯化钠溶液洗脱体积为3-4bv，洗脱的流速设置成0.7-0.8ml/min，采用苯酚-硫酸法跟踪检测多糖含量，样品直到没有sfps可以检出就可以，绘制洗脱曲线，分别收集各洗脱峰区间的洗脱液，经大孔树脂纯化后的多糖仍含有一定量的杂质，该步骤用deaesepharosecl-6b具有三维空间网状结构，不但具有离子交换作用，而且具有分子筛的作用，其分离多糖相对分子量的范围位于10kda-4000kda之间，使得该步骤可根据电荷和分子量的不同达到的双重分离效果，使多糖溶液实现浓缩和初步纯化，具有非常好的分离效能；透析：将离子交换层析后的洗脱液用截留分子量为3000-4000da透析袋透析至袋外溶液的电导率与去离子水的电导率相同，透析液冷冻干燥，备用，经盐溶液洗脱后的多糖中含有无机盐、低聚糖以及部分色素等杂质，若直接将回收液进行乙醇沉淀，大量的盐分会同时随多糖被沉淀下来，影响后续多糖的纯度和活性研究，因此选择简便有效的透析袋进行多糖的除盐；凝胶色谱柱纯化：将透析得到的多糖粗品配成浓度38-42mg/ml的溶液，分别上样至sephadexg-200凝胶柱进一步纯化，用蒸馏水进行洗脱，通过紫外-可见分光光度计跟踪检验其在480nm处的吸光度，分别以洗脱液的体积和吸光度为横纵坐标绘制洗脱曲线，收集各洗脱峰区域的洗脱液，选择抗老化效果最好的组分，浓缩至小体积，冷冻干燥，即得抗衰老多糖，用离子交换树脂分离各级多糖的依据是其所带电荷量的不同，所以各级分多糖很可能是带电荷量相同的几种多糖的混合物，而凝胶层析的原理是根据待分离物质分子量的大小进行分离的，能够获得高纯度的羊栖菜抗衰老多糖。作为优选，大孔树脂纯化步骤用d3520-cl的制备步骤为：将大孔树脂d3520用浓度为93-97%的乙醇溶液溶胀5-6h，随后用浓度为93-97%的乙醇溶液清洗2-4遍后自然风干，然后按固液比为1:3.5-4.0（g/ml）将d3520置于60-70℃的ccl4中溶胀30-40h，再加入zncl2、柠檬酸铁、nacl以及氯甲醚，在温度为45-55℃、超声功率为70-80w的条件下反应21-26h，即得d3520-cl。该步骤采取超声加热作用对d3520氯甲基化改性，可以增加树脂的溶胀度，使d3520中部分塌陷孔重新打开，增加d3520中活性位点的数目，且超声加热作用增加了反应体系的能量，这将增加活性分子数目和降低扩散层厚度，最终增加氯甲基化反应的速度和程度，使得到的大孔树脂的氯甲基化度为12.3%。进一步优选，d3520、zncl2、nacl和氯甲醚的重量比为1:1.3-1.5:0.40-0.42:0.15-0.17，zncl2和柠檬酸铁摩尔比为1:0.12-0.13。由于非极性d3520的高交联度会使其产生严重的空间位阻效应，使改性试剂难以进入d3520内部与之反应，这在很大程度上降低了d3520的改性程度，而柠檬酸铁的特殊存在能够协同超声波作用降低d3520表面扩散层厚度，促进zncl2、nacl、铁粉以及氯甲醚在d3520内部进行扩散，提高氯甲基化试剂和d3520的接触机会，使得反应更为容易进行，此外还有利于提高中间产物的生成速率，使得中间产物快速进入d3520内部，加快中间产物和δ+ch2cl的相互转换，从而提高d3520的氯甲基化度，进而提高大孔树脂纯化过程中可有效地除去抗衰老多糖中的色素和蛋白质，有效提高多糖的纯度、改善多糖的感官效果。作为优选，抗衰老粗多糖制备步骤中乳酸钙中l-乳酸钙和d-乳酸钙的比例为100:6.3-7.5。该乳酸钙的特殊存在能够和溶出的抗衰老多糖相结合，改变不溶于水的抗衰老多糖的亲水性，同时使水溶性的抗衰老多糖快速溶于水中，提高多糖的提取速率和得率，同时能够降低抗衰老粗多糖溶液的黏度，有利于色素分子扩散和减少液膜阻力，进而有利于色素在被d3520-cl吸附，且能增强色素和d3520-cl上功能基团的结合力，避免色素从d3520-cl上解吸，提高色素的去除率。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明抗衰老多糖的提取方法简单可行，多糖的提取效率、得率和纯度均较高，易于工业化生产，安全性更高，大大提高羊栖菜的附加值；本发明大孔树脂纯化步骤用大孔树脂具有较高活性的氯甲基(−ch2cl)，使得抗衰老多糖中的色素和蛋白质易于进入d3520-cl的内部，与其内部的活性位点产生吸附作用，从而提高其吸附量，有效提高多糖的纯度、改善多糖的感官效果；本发明提取方法能提高多糖的提取速率和得率，降低抗衰老粗多糖溶液的黏度，有利于色素在被d3520-cl吸附，且能增强色素和d3520-cl上功能基团的结合力，避免色素从d3520-cl上解吸，提高色素的去除率。具体实施方式下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，包括褐藻粗多糖提取液制备、大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，具体步骤为：1）抗衰老粗多糖制备：将羊栖菜粉利用浓度为93%的乙醇溶液回流1.5h，重复回流2次，除去色素、去脂以及去单糖，然后加入28-倍量蒸馏水和羊栖菜粉重量0.03‰乳酸钙，在80℃、功率为120-170w下超声辅助提取2.5h，过滤，滤液即为抗衰老粗多糖溶液，利用超声波作用产生空化效应，在组织细胞内形成高压，高压的释放在溶液中形成强大的冲击波，能够有效地减小、消除水与羊栖菜之间的阻力，从而加大了传质效率，同时细胞组织受到冲击波产生的物理剪切力而变形破裂，释放出胞内物质，大大加速了提取过程，且由于抗衰老多糖是极性的，不溶于乙醇溶液，因此利用乙醇溶液使抗衰老多糖形成沉淀，从而使多糖与水溶性单糖等其他物质分离；2）大孔树脂纯化：将抗衰老粗多糖溶液调配成浓度3mg/ml的溶液后上样至大孔树脂d3520-cl柱进行纯化，用去离子水进行洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩至粘稠状态，再向浓缩液中加乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，备用，该步骤用d3520-cl在其中引入了具有较高活性的氯甲基(−ch2cl)，提高了非极性大孔树脂d3520的极性，使得抗衰老多糖中的色素和蛋白质易于进入d3520-cl的内部，与其内部的活性位点产生吸附作用，从而提高其吸附量，可以有效能够除去抗衰老多糖中的色素和蛋白质，有效提高多糖的纯度，同时可有效保护多糖的结构和活性；3）离子交换层析：将大孔树脂纯化后的多糖用去离子水配成浓度18mg/ml的溶液，上样至deaesepharosecl-6b柱进行离子交换层析纯化，分别用0mol/l、0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l的氯化钠溶液进行梯度洗脱，不同浓度的氯化钠溶液洗脱体积为3bv，洗脱的流速设置成0.7ml/min，采用苯酚-硫酸法跟踪检测多糖含量，样品直到没有sfps可以检出就可以，绘制洗脱曲线，分别收集各洗脱峰区间的洗脱液，经大孔树脂纯化后的多糖仍含有一定量的杂质，该步骤用deaesepharosecl-6b具有三维空间网状结构，不但具有离子交换作用，而且具有分子筛的作用，其分离多糖相对分子量的范围位于10kda-4000kda之间，使得该步骤可根据电荷和分子量的不同达到的双重分离效果，使多糖溶液实现浓缩和初步纯化，具有非常好的分离效能；4）透析：将离子交换层析后的洗脱液用截留分子量为3000da透析袋透析至袋外溶液的电导率与去离子水的电导率相同，透析液冷冻干燥，备用，经盐溶液洗脱后的多糖中含有无机盐、低聚糖以及部分色素等杂质，若直接将回收液进行乙醇沉淀，大量的盐分会同时随多糖被沉淀下来，影响后续多糖的纯度和活性研究，因此选择简便有效的透析袋进行多糖的除盐；5）凝胶色谱柱纯化：将透析得到的多糖粗品配成浓度38mg/ml的溶液，分别上样至sephadexg-200凝胶柱进一步纯化，用蒸馏水进行洗脱，通过紫外-可见分光光度计跟踪检验其在480nm处的吸光度，分别以洗脱液的体积和吸光度为横纵坐标绘制洗脱曲线，收集各洗脱峰区域的洗脱液，选择抗老化效果最好的组分，浓缩至小体积，冷冻干燥，即得抗衰老多糖，用离子交换树脂分离各级多糖的依据是其所带电荷量的不同，所以各级分多糖很可能是带电荷量相同的几种多糖的混合物，而凝胶层析的原理是根据待分离物质分子量的大小进行分离的，能够获得高纯度的羊栖菜抗衰老多糖。大孔树脂纯化步骤用d3520-cl的制备步骤为：将大孔树脂d3520用浓度为93%的乙醇溶液溶胀5h，随后用浓度为93%的乙醇溶液清洗2遍后自然风干，然后按固液比为1:3.5（g/ml）将d3520置于60℃的ccl4中溶胀30h，再加入zncl2、柠檬酸铁、nacl以及氯甲醚，在温度为45℃、超声功率为70w的条件下反应21h，即得d3520-cl。上述d3520、zncl2、nacl和氯甲醚的重量比为1:1.3:0.40:0.15，zncl2和柠檬酸铁摩尔比为1:0.12。由于非极性d3520的高交联度会使其产生严重的空间位阻效应，使改性试剂难以进入d3520内部与之反应，这在很大程度上降低了d3520的改性程度，而柠檬酸铁的特殊存在能够协同超声波作用降低d3520表面扩散层厚度，促进zncl2、nacl、铁粉以及氯甲醚在d3520内部进行扩散，提高氯甲基化试剂和d3520的接触机会，使得反应更为容易进行，此外还有利于提高中间产物的生成速率，使得中间产物快速进入d3520内部，加快中间产物和δ+ch2cl的相互转换，从而提高d3520的氯甲基化度，进而提高大孔树脂纯化过程中可有效地除去抗衰老多糖中的色素和蛋白质，有效提高多糖的纯度、改善多糖的感官效果。该步骤采取超声加热作用对d3520氯甲基化改性，可以增加树脂的溶胀度，使d3520中部分塌陷孔重新打开，增加d3520中活性位点的数目，且超声加热作用增加了反应体系的能量，这将增加活性分子数目和降低扩散层厚度，最终增加氯甲基化反应的速度和程度，使得到的大孔树脂的氯甲基化度为12.3%。抗衰老粗多糖制备步骤中乳酸钙中l-乳酸钙和d-乳酸钙的比例为100:6.3。该乳酸钙的特殊存在能够和溶出的抗衰老多糖相结合，改变不溶于水的抗衰老多糖的亲水性，同时使水溶性的抗衰老多糖快速溶于水中，提高多糖的提取速率和得率，同时能够降低抗衰老粗多糖溶液的黏度，有利于色素分子扩散和减少液膜阻力，进而有利于色素在被d3520-cl吸附，且能增强色素和d3520-cl上功能基团的结合力，避免色素从d3520-cl上解吸，提高色素的去除率。实施例2：羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，包括褐藻粗多糖提取液制备、大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，具体步骤为：1）抗衰老粗多糖制备：将羊栖菜粉利用浓度为95%的乙醇溶液回流2.0h，重复回流3次，除去色素、去脂以及去单糖，然后加入30倍量蒸馏水和羊栖菜粉重量0.04‰乳酸钙，在85℃、功率为150w下超声辅助提取3.0h，过滤，滤液即为抗衰老粗多糖溶液；2）大孔树脂纯化：将抗衰老粗多糖溶液调配成浓度4mg/ml的溶液后上样至大孔树脂d3520-cl柱进行纯化，用去离子水进行洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩至粘稠状态，再向浓缩液中加乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，备用；3）离子交换层析：将大孔树脂纯化后的多糖用去离子水配成浓度20mg/ml的溶液，上样至deaesepharosecl-6b柱进行离子交换层析纯化，分别用0mol/l、0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l的氯化钠溶液进行梯度洗脱，不同浓度的氯化钠溶液洗脱体积为3bv，洗脱的流速设置成0.75ml/min，采用苯酚-硫酸法跟踪检测多糖含量，样品直到没有sfps可以检出就可以，绘制洗脱曲线，分别收集各洗脱峰区间的洗脱液；4）透析：将离子交换层析后的洗脱液用截留分子量为3500da透析袋透析至袋外溶液的电导率与去离子水的电导率相同，透析液冷冻干燥，备用；5）凝胶色谱柱纯化：将透析得到的多糖粗品配成浓度40mg/ml的溶液，分别上样至sephadexg-200凝胶柱进一步纯化，用蒸馏水进行洗脱，通过紫外-可见分光光度计跟踪检验其在480nm处的吸光度，分别以洗脱液的体积和吸光度为横纵坐标绘制洗脱曲线，收集各洗脱峰区域的洗脱液，选择抗老化效果最好的组分，浓缩至小体积，冷冻干燥，即得抗衰老多糖。大孔树脂纯化步骤用d3520-cl的制备步骤为：将大孔树脂d3520用浓度为95%的乙醇溶液溶胀5.5h，随后用浓度为95%的乙醇溶液清洗3遍后自然风干，然后按固液比为1:3.7（g/ml）将d3520置于65℃的ccl4中溶胀36h，再加入zncl2、柠檬酸铁、nacl以及氯甲醚，在温度为50℃、超声功率为75w的条件下反应24h，即得d3520-cl。上述d3520、zncl2、nacl和氯甲醚的重量比为1:1.4:0.41:0.16，zncl2和柠檬酸铁摩尔比为1:0.125。抗衰老粗多糖制备步骤中乳酸钙中l-乳酸钙和d-乳酸钙的比例为100:7.0。实施例3：羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，包括褐藻粗多糖提取液制备、大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，具体步骤为：1）抗衰老粗多糖制备：将羊栖菜粉利用浓度为97%的乙醇溶液回流2.5h，重复回流4次，除去色素、去脂以及去单糖，然后加入33倍量蒸馏水和羊栖菜粉重量0.05‰乳酸钙，在90℃、功率为170w下超声辅助提取3.5h，过滤，滤液即为抗衰老粗多糖溶液；2）大孔树脂纯化：将抗衰老粗多糖溶液调配成浓度5mg/ml的溶液后上样至大孔树脂d3520-cl柱进行纯化，用去离子水进行洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩至粘稠状态，再向浓缩液中加乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，备用；3）离子交换层析：将大孔树脂纯化后的多糖用去离子水配成浓度22mg/ml的溶液，上样至deaesepharosecl-6b柱进行离子交换层析纯化，分别用0mol/l、0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l的氯化钠溶液进行梯度洗脱，不同浓度的氯化钠溶液洗脱体积为4bv，洗脱的流速设置成0.8ml/min，采用苯酚-硫酸法跟踪检测多糖含量，样品直到没有sfps可以检出就可以，绘制洗脱曲线，分别收集各洗脱峰区间的洗脱液；4）透析：将离子交换层析后的洗脱液用截留分子量为4000da透析袋透析至袋外溶液的电导率与去离子水的电导率相同，透析液冷冻干燥，备用；5）凝胶色谱柱纯化：将透析得到的多糖粗品配成浓度42mg/ml的溶液，分别上样至sephadexg-200凝胶柱进一步纯化，用蒸馏水进行洗脱，通过紫外-可见分光光度计跟踪检验其在480nm处的吸光度，分别以洗脱液的体积和吸光度为横纵坐标绘制洗脱曲线，收集各洗脱峰区域的洗脱液，选择抗老化效果最好的组分，浓缩至小体积，冷冻干燥，即得抗衰老多糖。大孔树脂纯化步骤用d3520-cl的制备步骤为：将大孔树脂d3520用浓度为97%的乙醇溶液溶胀6h，随后用浓度为97%的乙醇溶液清洗4遍后自然风干，然后按固液比为1:4.0（g/ml）将d3520置于70℃的ccl4中溶胀40h，再加入zncl2、柠檬酸铁、nacl以及氯甲醚，在温度为55℃、超声功率为80w的条件下反应26h，即得d3520-cl。上述d3520、zncl2、nacl和氯甲醚的重量比为1:1.5:0.42:0.17，zncl2和柠檬酸铁摩尔比为1:0.13。抗衰老粗多糖制备步骤中乳酸钙中l-乳酸钙和d-乳酸钙的比例为100:7.5。对比例1：d3520-cl的制备步骤中未添加柠檬酸铁，其余部分和实施例2完全一致。对比例2：大孔树脂纯化步骤用大孔树脂为未经氯甲基化改性的d3520，其纯化方法和实施例2完全一致。实施例4：将实施例2设为试验组，对比例1、对比例2和分别设为对照组1、对照组2和对照组3。氯甲基化度的测定：精密称取0.100g试验组和对照组1得到的d3520-cl，0.300gkno3和0.300gnaoh，置于镍坩埚中，反复混合至均匀，将镍坩埚置于泥三角上，用酒精灯加热，使树脂燃烧灰化，待坩埚冷却至室温后放入700℃马弗炉中灼烧3h，停止加热。将坩埚移入干燥器冷却至室温后，转入250ml的烧杯中，加入适量的蒸馏水使坩埚刚好浸没于蒸馏水中，密封烧杯，浸泡15h后将坩埚取出，用蒸馏水反复冲洗坩埚内外10次，将浸泡和冲洗坩埚的蒸馏水合并入500ml容量瓶中，加入100ml0.1mol/lkno3，用10mol/lnaoh和hno3将溶液的ph值调节到2.95±0.02的范围内，之后用蒸馏水定容，测定溶液的电位，利用标准曲线计算溶液浓度，并以如下公式计算d3520-cl的氯甲基化度，结果如表1所示。式中cc和c1（mol/l）分别代表d3520-cl和d3520溶液中的氯离子浓度，mr和m1(g)分别代表d3520-cl和d3520的重量，0.5代表溶液的体积(l)。多糖回收率、色素去除率和蛋白去除率的测定：首先采用苯酚硫酸法、bradford法、比色法分别测得抗衰老粗多糖母液的多糖浓度、蛋白质浓度以及色素含量。然后收集合并含有多糖的洗脱液，测定收集的大孔树脂纯化洗脱液的多糖含量、蛋白和色素含量，计算多糖回收率、色素去除率和蛋白去除率，其结果如表1所示。表1测定结果项目氯甲基化度（%）多糖回收率（%）色素去除率（%）蛋白的去除率（%）试验组12.367.3389.9779.03对照组16.863.0985.2170.35对照组2-60.3581.5563.87由表1可知，试验组的氯甲基化度要大大高于对照组1，说明柠檬酸铁的加入能够提高d3520的氯甲基化度；试验组和对照组1的多糖回收率、色素去除率和蛋白去除率高于对照组2，且试验组的多糖回收率、色素去除率和蛋白去除率均高于对照组1和对照组2，说明d3520的氯甲基化改性有利于多糖的回收，对色素和蛋白的去除效果好，且d3520-cl的氯甲基化度高，效果更佳。本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12