一种温度/pH双响应型几丁质纳米纤维水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及纳米纤维水凝胶制备领域，具体而言，涉及一种温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶及其制备方法。

背景技术：

几丁质(chitin)是以β-(1-4)糖苷键连接而成的天然高分子聚合物，经过部分脱乙酰处理后可以在弱酸溶液中被分散。几丁质纤维晶体表面足够的自由氨基以及酸性条件下表面带有高密度正电荷，经一定的机械处理后获得纳米纤维。几丁质纳米纤维具有特别优良的生物学性能，且其表面足够的氨基数量使其具有更好的生物及化学反应性能，可被广泛应用于生物医学产品，药物传递系统等等。随着人们对一些昂贵难溶性的药物利用率要求的提高和对药物缓释、控释特性方面的日益重视，纳米材料水凝胶作为包埋微乳液型药物载体具有更广阔的应用前景。如今纳米材料领域与生物医学等相关领域的紧密结合，为医学治疗提供了全新的思路。具有温度/ph双响应型纳米纤维水凝胶是生物医药领域研究的重点，但由于目前温度/ph双响应型纳米纤维水凝胶制备过程主要涉及化学接枝改性，反应过程复杂、不可控因素较多，限制了温度/ph双响应型纳米纤维水凝胶的发展。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶的制备方法，通过简单的物理复合和生物因子复配即可制备得到具有温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶，制备方法简单，操作性强。本发明的另一目的是提供一种温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶，该水凝胶材料具有优异的温度/ph双响应性能，生物相容性和药物缓释性能，

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)部分脱乙酰几丁质制备；

(2)几丁质纳米纤维分散液的制备；

(3)将水相、油相和表面活性剂按比例缓慢滴加混合，经过2-72小时不停搅拌得到澄清透明的水包油型(o/w)微乳液；

(4)将几丁质纳米分散液、微乳液、β-磷酸甘油(β-gp)和生物复合因子按比例混合均匀，经过碱性凝固浴得到具有温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶。

步骤(1)中，几丁质至少来自蟹或虾的外骨骼、鱿鱼顶骨、昆虫的角质层和真菌的细胞壁中一种；脱乙酰几丁质的制备方法为化学脱乙酰和生物酶法脱乙酰。

步骤(2)中，几丁质纳米纤维分散液的质量百分浓度为0.2-0.8％，介质为酸性介质；其中，所述酸性介质至少为醋酸、葡萄糖酸、衣康酸、柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、盐酸、磷酸和硫酸中的一种。

步骤(3)中，微乳液的粒径为2～100nm，油相至少选自肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、乙酸乙酯、玉米油、橄榄油、石油醚和润滑油中的一种；表面活性剂至少为tween系列和span系列中的一种。

步骤(4)中，β-gp由β-磷酸甘油或β-磷酸甘油盐配置，优选浓度范围30-60％(w/w)；生物复合因子至少为壳聚糖、天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、木聚糖和淀粉中的一种，优选浓度范围1-10％(w/w)。

所述的温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶的制备方法，β-gp与几丁质纳米纤维的质量比为1∶0.4-5；生物复合因子与几丁质纳米纤维的质量比为1∶0.2-3。

所述的温度/ph双响应型水凝胶的制备方法制备得到的温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶。

所述的温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶，温度响应范围为20-50℃，ph响应范围为1.5-7.4。

所述的温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶在制备缓释材料中的应用。

所述的温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶在制备缓释药物中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优势有：利用几丁质纳米纤维水凝胶与β-gp和生物复合因子复合制备同时具有温度敏感性和ph敏感性的水凝胶，使复水凝胶具有优异的温度敏感性，制备方法简单，制备过程绿色经济，可操作性强；本发明制备的温度/ph双响应型几丁质纳米纤维水凝胶具有绿色环保、生物相容性好和药物缓释性能。

附图说明

图1是几丁质纳米纤维分散液与β-gp复合后在不同温度下的应力扫描图；

图2是几丁质纳米纤维复合水凝胶的机械性能图；

图3是柠檬酸分散的几丁质纳米纤维复合水凝胶缓释图；

图4是添加甘氨酸的几丁质纳米纤维温敏型凝胶在25℃和40℃条件下的缓释曲线图；

图5是添加木聚糖的几丁质纳米纤维温敏型凝胶在25℃和40℃条件下的缓释曲线图；

图6是添加甘氨酸淀粉的几丁质纳米纤维温敏型凝胶在25℃和40℃条件下的缓释曲线图

图7是几丁质纳米纤维水凝胶在不同ph和温度条件下的缓释图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。实施例是为说明而非限制本发明。本领域中任何普通技术人员能够理解这些实施例不以任何方式限制本发明，可做适当的修改而不违背本发明的实质和偏离本发明的范围。

实施例1

(1)部分脱乙酰几丁质制备

螃蟹壳剪成1cm²大小，1mol/lnaoh浸泡12h以上除去蛋白质，蒸馏水洗涤至中性后继而用1mol/lhcl浸泡12h以上除去矿物质，洗涤至中性。以上步骤重复三次。配置0.5％(w/w)的naclo2、醋酸调节至ph5后，70℃水浴漂白2h，间歇搅拌，将几丁质洗涤至中性。榨汁机粉碎处理，过滤除水，4℃冰箱中保存，平衡水分1-2天。

称取1g纯化后的几丁质(干重)，浸泡于50ml35％(w/w)naoh溶液中，90℃水浴、搅拌4h进行部分脱乙酰处理。反应结束后，洗涤至中性，收集固体。4℃冰箱保存，水分平衡。

(2)几丁质纳米分散液的制备

配置质量比0.2％(w/w)的几丁质/水混合体系于200ml烧杯中，将醋酸溶液滴加至几丁质分散液中使溶液维持在ph3-4，充分溶胀后，进行匀浆机匀质30s和超声分散5min各五次。离心10000rpm/min、5min除去未分散的固体，收集上清液倾倒至试剂瓶中收集，此即为几丁质纳米分散液。

(3)添加液的配置

β-磷酸甘油(β-gp)溶液配置：β-gp由β-磷酸甘油二钠配置，将β-gp配置成50％(w/w)的溶液，保存在4℃冰箱中。

将生物复合因子壳聚糖(cs)、天冬氨酸(asp)、丝氨酸(ser)、甘氨酸(gly)、木聚糖(xylan)和淀粉(starch)分别配置成1.5％(w/w)的溶液。cs用醋酸溶解，并加热搅拌；asp、ser、gly、xyaln和starch用蒸馏水溶解。

(4)复合双响应型水凝胶的制备

将浓度为0.4％的几丁质纳米纤维分散液和浓度为1.5％的混合生物复合因子溶液按照1∶1.5比例混合，加入和纳米纤维比例为1∶2的β-gp和微乳液，混合均匀在碱性氨水浴的条件下制备具有温度敏感和ph敏感的水凝胶。

(5)水凝胶的缓释

水凝胶与缓冲液(ph＝7.475mm)按照2∶100(v/v)比例进行缓释，一定时间内取600ul样品并用相同量新缓冲液替换，保持缓释总体积不变。条件为：转速30±2rpm/min，模拟人体环境。

实施例2

(1)部分脱乙酰几丁质制备

鱿鱼顶骨在1mol/lnaoh中浸泡12h以上除去蛋白质，蒸馏水洗涤至中性后继而用1mol/lhcl浸泡12h以上除去矿物质，洗涤至中性。以上步骤重复三次。配置0.5％(w/w)的naclo2、醋酸调节至ph为5后，70℃水浴漂白2h，间歇搅拌，将几丁质洗涤至中性。榨汁机粉碎处理，过滤除水，4℃冰箱中保存，平衡水分1-2天。

称取1g纯化后的几丁质(干重)，浸泡于50ml35％(w/w)naoh溶液中，90℃水浴、搅拌4h进行部分脱乙酰处理。反应结束后，洗涤至中性，收集固体。4℃冰箱保存，水分平衡。

(2)几丁质纳米分散液的制备与实施例1相同

(3)添加液的配置

β-gp溶液配置：β-gp由β-磷酸甘油钙配置，将β-gp配置成30％(w/w)的溶液，保存在4℃冰箱中。

将生物复合因子壳聚糖(cs)、天冬氨酸(asp)、丝氨酸(ser)、甘氨酸(gly)、木聚糖(xylan)和淀粉(starch)分别配置成5％(w/w)的溶液。cs用醋酸溶解，并加热搅拌；asp、ser、gly、xyaln和starch用蒸馏水溶解。

(4)复合双响应型水凝胶的制备

将浓度为0.6％的几丁质纳米纤维分散液和浓度为5％的甘氨酸溶液按照1∶3比例混合，加入和纳米纤维比例为1∶4的β-gp和微乳液，混合均匀在碱性氨水浴的条件下制备具有温度敏感和ph敏感的水凝胶。

(5)水凝胶的缓释与实施例1相同

实施例3

(1)部分脱乙酰几丁质制备

蝉蜕壳在1mol/lnaoh中浸泡12h以上除去蛋白质，蒸馏水洗涤至中性后继而用1mol/lhcl浸泡12h以上除去矿物质，洗涤至中性。以上步骤重复三次。配置0.5％(w/w)的naclo2、醋酸调节至ph5后，70℃水浴漂白2h，间歇搅拌，将几丁质洗涤至中性。榨汁机粉碎处理，过滤除水，4℃冰箱中保存，平衡水分1-2天。

称取1g纯化后的几丁质(干重)，浸泡于50ml35％(w/w)naoh溶液中，90℃水浴、搅拌4h进行部分脱乙酰处理。反应结束后，洗涤至中性，收集固体。4℃冰箱保存，水分平衡。

(2)几丁质纳米分散液的制备

配置质量比0.2％(w/w)的几丁质/水混合体系于200ml烧杯中，将柠檬酸溶液滴加至几丁质分散液中使溶液维持在ph3-4，充分溶胀后，进行匀浆机匀质30s和超声分散5min各五次。离心10000rpm/min、5min除去未分散的固体，收集上清液倾倒至试剂瓶中收集，此即为几丁质纳米分散液。

(3)添加液的配置

β-磷酸甘油(β-gp)溶液配置：β-gp由β-磷酸甘油二钠配置，将β-gp配置成50％(w/w)的溶液，保存在4℃冰箱中。

将生物复合因子壳聚糖(cs)、天冬氨酸(asp)、丝氨酸(ser)、甘氨酸(gly)、木聚糖(xylan)和淀粉(starch)分别配置成3.0％(w/w)的溶液。cs用醋酸溶解，并加热搅拌；asp、ser、gly、xyaln和starch用蒸馏水溶解。

(4)复合双响应型水凝胶的制备

将浓度为0.4％的几丁质纳米纤维分散液和浓度为3.0％的木聚糖溶液按照1∶1.5比例混合，加入和纳米纤维比例为1∶1的β-gp和微乳液，混合均匀在碱性氨水浴的条件下制备具有温度敏感和ph敏感的水凝胶。

(5)水凝胶的缓释与实施例1相同

实施例4

(1)部分脱乙酰几丁质制备

虾壳在1mol/lnaoh中浸泡12h以上除去蛋白质，蒸馏水洗涤至中性后继而用1mol/lhcl浸泡12h以上除去矿物质，洗涤至中性。以上步骤重复三次。配置0.5％(w/w)的naclo2、醋酸调节至ph5后，70℃水浴漂白2h，间歇搅拌，将几丁质洗涤至中性。榨汁机粉碎处理，过滤除水，4℃冰箱中保存，平衡水分1-2天。

称取1g纯化后的几丁质(干重)，浸泡于ph为9.0的缓冲溶液中，加入一定酶活的几丁质脱乙酰酶，在50℃进行酶促脱乙酰反应48h。反应终止，样品洗涤至中性后得到部分脱乙酰几丁质。于4℃冰箱保存，24h后测定含水量，作为酶促部分脱乙酰几丁质湿样待用。

(2)几丁质纳米分散液的制备

配置质量比0.2％(w/w)的几丁质/水混合体系于200ml烧杯中，将柠檬酸溶液滴加至几丁质分散液中使溶液维持在ph3-4，充分溶胀后，进行匀浆机匀质30s和超声分散5min各五次。离心10000rpm/min、5min除去未分散的固体，收集上清液倾倒至试剂瓶中收集，此即为几丁质纳米分散液。

(3)添加液的配置

β-磷酸甘油(β-gp)溶液配置：β-gp由β-磷酸甘油二钠配置，将β-gp配置成50％(w/w)的溶液，保存在4℃冰箱中。

将生物复合因子壳聚糖(cs)、天冬氨酸(asp)、丝氨酸(ser)、甘氨酸(gly)、木聚糖(xylan)和淀粉(starch)分别配置成1.5％(w/w)的溶液。cs用醋酸溶解，并加热搅拌；asp、ser、gly、xyaln和starch用蒸馏水溶解。

(4)复合双响应型水凝胶的制备

将浓度为0.4％的几丁质纳米纤维分散液和浓度为1.5％的木聚糖溶液按照1∶1比例混合，加入和纳米纤维比例为1∶1的β-gp和微乳液，混合均匀在碱性氨水浴的条件下制备具有温度敏感和ph敏感的水凝胶。

(5)水凝胶的缓释与实施例1相同

实施例5

(1)部分脱乙酰几丁质制备

虾壳在1mol/lnaoh中浸泡12h以上除去蛋白质，蒸馏水洗涤至中性后继而用1mol/lhcl浸泡12h以上除去矿物质，洗涤至中性。以上步骤重复三次。配置0.5％(w/w)的naclo2、醋酸调节至ph5后，70℃水浴漂白2h，间歇搅拌，将几丁质洗涤至中性。榨汁机粉碎处理，过滤除水，4℃冰箱中保存，平衡水分1-2天。

称取1g纯化后的几丁质(干重)，浸泡于ph为9.0的缓冲溶液中，加入一定酶活的几丁质脱乙酰酶，在50℃进行酶促脱乙酰反应48h。反应终止，样品洗涤至中性后得到部分脱乙酰几丁质。于4℃冰箱保存，24h后测定含水量，作为酶促部分脱乙酰几丁质湿样待用。

(2)几丁质纳米分散液的制备

配置质量比0.2％(w/w)的几丁质/水混合体系于200ml烧杯中，将盐酸溶液滴加至几丁质分散液中使溶液维持在ph3-4，充分溶胀后，进行匀浆机匀质30s和超声分散5min各五次。离心10000rpm/min、5min除去未分散的固体，收集上清液倾倒至试剂瓶中收集，此即为几丁质纳米分散液。

(3)添加液的配置

β-磷酸甘油(β-gp)溶液配置：β-gp由β-磷酸甘油二钠配置，将β-gp配置成50％(w/w)的溶液，保存在4℃冰箱中。

将生物复合因子壳聚糖(cs)、天冬氨酸(asp)、丝氨酸(ser)、甘氨酸(gly)、木聚糖(xylan)和淀粉(starch)分别配置成1.5％(w/w)的溶液。cs用醋酸溶解，并加热搅拌；asp、ser、gly、xyaln和starch用蒸馏水溶解。

(4)复合双响应型水凝胶的制备

将浓度为0.3％的几丁质纳米纤维分散液和浓度为1.5％的木聚糖与丝氨酸混合溶液按照1∶1比例混合，加入和纳米纤维比例为1∶1的β-gp和微乳液，混合均匀在碱性氨水浴的条件下制备具有温度敏感和ph敏感的水凝胶。

(5)水凝胶的缓释与实施例1相同

实施例6

(1)部分脱乙酰几丁质制备与实施例1相同；

(2)几丁质纳米分散液的制备与实施例1相同；

(3)添加液的配置

β-磷酸甘油(β-gp)溶液配置：β-gp由β-磷酸甘油钙配置，将β-gp配置成50％(w/w)的溶液，保存在4℃冰箱中。

将生物复合因子壳聚糖(cs)、天冬氨酸(asp)、丝氨酸(ser)、甘氨酸(gly)、木聚糖(xylan)和淀粉(starch)分别配置成1.5％(w/w)的溶液。cs用醋酸溶解，并加热搅拌；asp、ser、gly、xyaln和starch用蒸馏水溶解。

(4)复合双响应型水凝胶的制备

将浓度为0.5％的几丁质纳米纤维分散液和浓度为1.5％的天冬氨酸溶液按照1∶1比例混合，加入和纳米纤维比例为1∶1的β-gp和微乳液，混合均匀在碱性氨水浴的条件下制备具有温度敏感和ph敏感的水凝胶。

(5)水凝胶的缓释与实施例1相同

实施例7

(1)部分脱乙酰几丁质制备

螃蟹壳在1mol/lnaoh中浸泡12h以上除去蛋白质，蒸馏水洗涤至中性后继而用1mol/lhcl浸泡12h以上除去矿物质，洗涤至中性。以上步骤重复三次。配置0.5％(w/w)的naclo2、醋酸调节至ph5后，70℃水浴漂白2h，间歇搅拌，将几丁质洗涤至中性。榨汁机粉碎处理，过滤除水，4℃冰箱中保存，平衡水分1-2天。

称取1g纯化后的几丁质(干重)，浸泡于ph为9.0的缓冲溶液中，加入一定酶活的几丁质脱乙酰酶，在50℃进行酶促脱乙酰反应48h。反应终止，样品洗涤至中性后得到部分脱乙酰几丁质。于4℃冰箱保存，24h后测定含水量，作为酶促部分脱乙酰几丁质湿样待用。

(2)几丁质纳米分散液的制备与实施例1相同

(3)添加液的配置

β-磷酸甘油(β-gp)溶液配置：β-gp由β-磷酸甘油钙配置，将β-gp配置成60％(w/w)的溶液，保存在4℃冰箱中。

将生物复合因子壳聚糖(cs)、天冬氨酸(asp)、丝氨酸(ser)、甘氨酸(gly)、木聚糖(xylan)和淀粉(starch)分别配置成2.0％(w/w)的溶液。cs用醋酸溶解，并加热搅拌；asp、ser、gly、xyaln和starch用蒸馏水溶解。

(4)复合双响应型水凝胶的制备

将浓度为0.5％的几丁质纳米纤维分散液和浓度为2.0％的淀粉溶液按照1∶1比例混合，加入和纳米纤维比例为1∶1的β-gp和微乳液，混合均匀在碱性氨水浴的条件下制备具有温度敏感和ph敏感的水凝胶。

(5)水凝胶的缓释与实施例1相同

实施例8

对实施例1-7制备的水凝胶，进行性能检测，具体如下：

图1是几丁质纳米纤维分散液与β-gp复合后在不同温度下的应力扫描图，可以看出添加β-gp复合几丁质纳米纤维分散液在前一段温度表现的是液体性质，经过一个交点后转变为固体性质，交点对应的相位角为35℃。

图2是几丁质纳米纤维复合水凝胶的机械性能图，可以看出添加β-gp会影响复合凝胶的机械性能。

图3是柠檬酸分散的几丁质纳米纤维复合水凝胶缓释图，可以看出在两种温度条件下，相同条件制备的水凝胶缓释量差40％，这也说明添加了β-gp有助于提升纳米纤维水凝胶的温度敏感性。

图4-图6是不同生物复合因子复合的几丁质纳米纤维水凝胶的缓释图，复合几丁质纳米纤维水凝胶表现出良好的温度敏感性.

图7是几丁质纳米纤维水凝胶在不同ph和温度条件下的缓释图，表明该复合水凝胶具有优异的温度/ph双响应性。