碳水化合物结合模块及其在固定化酶制备与融合蛋白纯化上的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种碳水化合物结合模块及其在固定化酶制备与融合蛋白纯化上的应用。

背景技术：

随着分子生物学技术的进展，外源基因的克隆表达成为高价值蛋白的重要获取手段。蛋白亲和纯化标签是重组蛋白纯化的最主要途径，也是一种重要的固定化酶制备策略。一些亲和纯化标签已经得到商业化应用，如his-tag,gst-tag,halotag^tm等。但由于亲和纯化标签需要特定的吸附载体，而目前常见的载体(如葡聚糖凝胶)制备过程繁琐，价格昂贵，导致重组蛋白纯化成本居高不下，相应的固定化酶策略也受此限制无法规模化应用。因此，开发低成本、特异性的重组蛋白纯化-固定化策略，发掘相应的新型蛋白纯化标签，在重组蛋白纯化及固定化领域具有重要意义。

糖类是自然界中广泛分布的一类重要有机化合物。随着研究人员对碳水化合物代谢的深入研究，在纤维素、半纤维素降解酶中陆续发现了碳水化合物结合模块(carbohydratebindingmodule，cbm)。它们具有独立的折叠结构，没有催化活性，但能够与碳水化合物特异性结合。不同的cbm能特异识别纤维素、几丁质、葡聚糖、木聚糖、菊粉、甘露聚糖、半乳聚糖、淀粉或糖原类物质，此外还有一些cbm能结合细胞表面的多糖。cbm的多样性使得其在促进酶与底物结合(尤其是不溶性底物)、底物特异识别、以及酶稳定性等方面都有重要作用。利用cbm结合底物的特异性，以及cbm的相对独立性和分子量小的特点，亦可开发cbm作为蛋白纯化标签。由于天然多糖价格低廉，直接用其作为填料用于蛋白纯化或固定化酶制备具有巨大的价格优势。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种碳水化合物结合模块及其在固定化酶制备与融合蛋白纯化上的应用。本发明碳水化合物结合模块是一种用于蛋白质纯化/固定化的融合蛋白标签。

本发明涉的碳水化合物结合模块与特定的多糖具有特异性的结合能力。利用该模块作为标签构建融合蛋白，可以建立一种简便、低成本的固定化酶和重组蛋白纯化方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种碳水化合物结合模块，所述碳水化合物结合模块是由seqidno：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者由seqidno：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。

本发明所述碳水化合物结合模块可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明还保护编码所述碳水化合物结合模块的基因。

编码所述碳水化合物结合模块的基因是seqidno：2所示的dna分子，或者seqidno：2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

本发明还保护含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明所述碳水化合物结合模块具有结合多糖能力。

本发明还提供一种酶的固定化方法，即固定化酶的制备方法。

上述酶的固定方法具体为：将编码所述碳水化合物结合模块的基因与目的蛋白基因进行融合表达，形成融合蛋白，利用多糖固定化载体将所述融合蛋白一步纯化并固定化，得到固定化酶。

所述多糖固定化载体选自以下物质中的一种或两种及两种以上的混合物：酵母葡聚糖、昆布多糖、可得然多糖、纤维素、β-葡聚糖或几丁质。

本发明还提供一种含有所述碳水化合物结合模块作为标签的融合蛋白的构建方法，该方法为：

a)将seqidno：2所示的dna分子通过重叠pcr方法与目的蛋白dna分子连接并导入重组质粒；或，

b)通过限制性内切酶将seqidno：2所示的dna分子与目的蛋白dna分子构建在同一重组质粒中，将重组质粒导入宿主菌中得到的重组菌，诱导培养上述重组菌，得到重组融合蛋白。

进一步，本发明还提供一种重组融合蛋白质纯化方法，所述重组融合蛋白质纯化方法为：

a)在碳水化合物结合模块(纯化标签)和目的蛋白的连接肽(linker)上加入凝血酶、肠激酶或其他可以切除的酶切位点；

b)通过限制性内切酶将seqidno：2所示的dna分子与目的蛋白dna分子构建在同一重组质粒中，并进行异源表达；

c)利用多糖纯化填料吸附异源表达所得蛋白混合溶液中的目标融合蛋白；

d)通过相应的特异性蛋白酶酶切洗脱得到纯化的重组蛋白。

所述多糖纯化填料选自以下物质中的一种或两种及两种以上的混合物：酵母葡聚糖、昆布多糖、可得然多糖、纤维素、β-葡聚糖或几丁质。

与传统方法相比，本发明所述的固定化方法，纯化方法操作简单，耗时短，经济成本低。对缓冲液的要求低，可保持目的蛋白的高活性。

附图说明

图1可得然多糖固定化酶扫描电镜图；

图2可得然多糖吸附的融合蛋白sds-page。

具体实施方式

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例，是作为对本发明作进一步的说明，并不构成对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

碳水化合物结合模块标签cbm56-tag基因的获得

依据genbank数据库中巴伦葛兹类芽孢杆菌(paenibacillusbarengoltzii)序列信息(在文献“int.j.syst.evol.microbiol.2006,56,1509–1514”中公开)，以其中编码glycosidehydrolase(gh)64家族β-葡聚糖酶(genbank编号：wp_016313499)的目的基因序列为模板序列，全基因合成其中编码cbm模块的目的基因。以上述基因为模板，以人工合成的上游引物cbm56-up(5’-attcatgccatggctgatttcactcaaggagcgg-3’，下划线示ncoⅰ酶切位点)和下游引物cbm56-down(5’-attattccgctcgagtcgataagtgaatgttgtggtgtc-3’，下划线示xhoⅰ酶切位点)，进行pcr扩增，得到目的dna片段。

pcr扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次；最后72℃后延伸10min。

pcr产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以ncoⅰ和xhoⅰ双酶切。将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的原核表达载体pet-28a(+)(美国novagen公司，产品编号：69864-3)片段以t4dna连接酶进行连接，得到重组质粒，并将其转化至宿主大肠杆菌dh5α。挑选菌落pcr(pcr所用的引物和扩增条件与本段前述pcr的相同)验证为阳性的转化子测序。

测序结果表明：重组质粒为在载体pet-28a(+)的ncoⅰ和xhoⅰ位点间插入了seqidno:2所示的dna片段，阳性转化子即为含有上述重组质粒的大肠杆菌dh5α。

将序列表序列seqidno:2所示的基因命名为基因cbm56，将该基因所编码的蛋白命名为蛋白cbm56-tag，其氨基酸序列如序列表seqidno:1所示。

实施例2

cbm56-tag用于固定化酶制备

1)用于固定化酶制备的融合蛋白cbm56-gscsn46的构建采用重叠pcr技术将cbm56连接于gscsn46的n端，得到融合蛋白cbm56-gscsn46。

具体操作为：以上述cbm56重组菌为模板，以人工合成的上游引物cbm56-f(5’-cgccatatgttagctgatttcactcaaggagcgg-3’，下划线示ndeⅰ酶切位点)和下游引物cbm56-rm(5’-ctgctgagcggtcagctgagccgaaggttccggatcgggtt-3’，下划线示重叠序列)，进行pcr扩增，得到编码目的cbm56-tagdna片段；以gynuellasunshinyii来源壳聚糖酶gscsn46基因(在文献“foodchemistry,2018,253:139–147”中公开)为模板，以人工合成的上游引物46-fm(5’-cgaaggttccggatcgggttggctcagctgaccgctcagcag-3’，下划线示重叠序列)和下游引物46-r(5’-attccgctcgagttaacggatcggcaggatgaaaac-3’，下划线示xhoⅰ酶切位点)进行pcr扩增，得到目的gscsn46dna片段；最后以上游引物cbm56-f和下游引物46-r进行pcr扩增，得到连接后的cbm56-gscsn46基因。

pcr产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以ndeⅰ和xhoⅰ双酶切。将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的原核表达载体pet-28a(+)(美国novagen公司，产品编号：69864-3)片段以t4dna连接酶进行连接，得到重组质粒，并将其转化至宿主大肠杆菌dh5α。挑选菌落pcr(pcr所用的引物和扩增条件与本段前述pcr的相同)验证为阳性的转化子测序验证。提取经测序验证后的质粒。

2)重组融合蛋白cbm56-gscsn46的表达

将1)中的重组质粒转化表达至宿主大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌，并将其接种至1llb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)，在37℃，200rpm条件下培养至od600在0.6-0.8之间，加入iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mm，30℃诱导过夜。离心收集菌体后，将菌体按照1:10(v/v)的比例，用缓冲液a(20mmtris-hcl冲液，0.5mnacl，20mm咪唑,ph8.0)重悬浮，然后于冰水浴中超声破碎(200w，超声2s，间歇3s，120次)，再离心收集上清液即为粗酶液，粗酶液中含有重组融合蛋白cbm56-gscsn46。

3)固定化酶制备

将纤维素，可得然多糖，酵母葡聚糖按2:0.5:1的质量比例混合，制备固定化酶载体。取0.5克上述固定化酶载体，加入50mm醋酸-醋酸钠缓冲液5ml(ph5.5)充分混匀，离心后去除上清液，加入上述实施例3所述粗酶液5ml，20℃下孵育20min，离心去除上清。加入50mm醋酸-醋酸钠缓冲液5ml(ph5.5)，移液枪轻吹使沉淀重悬，离心弃上清，缓冲液重复洗涤3次。弃去上清后的沉淀即为一步纯化-固定化所得固定化酶载体(图1)。经测定固定化酶与原始酶在30度下的半衰期分别为12.91与4.67小时，该固定化酶的制备策略能够显著提高酶的稳定性。

实施例3

cbm56-tag用于重组蛋白纯化

1)用于蛋白纯化的融合蛋白cbm56-enterokinase-gscsn46的构建

以实例1的重组大肠杆菌dna为模板以人工合成的上游引物cbm56-up(5’-attcgccatatggctgatttcactcaaggagcgg-3’，下划线示ndeⅰ酶切位点)和下游引物cbm56-down(5’-attggaagatcttcgataagtgaatgttgtggtgtc-3’，下划线示bglii酶切位点)，进行pcr扩增，得到目的dna片段。

pcr扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次；最后72℃后延伸10min。

pcr产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以ndeⅰ和bglii双酶切。将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的原核表达载体pet-30a(+)(美国novagen公司，产品编号：69864-3)片段以t4dna连接酶进行连接，得到重组质粒，并将其转化至宿主大肠杆菌dh5α。挑选菌落pcr(pcr所用的引物和扩增条件与本段前述pcr的相同)验证为阳性的转化子测序。

以目的基因的重组大肠杆菌dna为模板以人工合成的上游引物46-up(5’-attcatgccatgggctcagctgaccgctcagcag-3’，，下划线示ncoⅰ酶切位点)和下游引物cbm56-down(5’-attccgctcgagttaacggatcggcaggatgaaaac-3’，下划线示xhoi酶切位点)，进行pcr扩增，得到目的dna片段。

pcr产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以ncoⅰ和xhoi双酶切。将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的原核表达载体pet-30a(+)(美国novagen公司，产品编号：69864-3)片段以t4dna连接酶进行连接，得到重组质粒，并将其转化至宿主大肠杆菌dh5α。挑选菌落pcr(pcr所用的引物和扩增条件与本段前述pcr的相同)验证为阳性的转化子测序。测序结果表明：重组质粒为在载体pet-30a(+)的ndeⅰ和xhoⅰ位点间插入融合基因cbm56-enterokinase-gscsn46，阳性转化子即为含有上述重组质粒的大肠杆菌dh5α。

2)cbm56-enterokinase-gscsn46的表达

将1)中的重组质粒转化表达至宿主大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌，并将其接种至1llb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)，在37℃，200rpm条件下培养至od600在0.6-0.8之间，加入iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mm，30℃诱导过夜。离心收集菌体后，将菌体按照1:10(v/v)的比例，用缓冲液a(20mmtris-hcl冲液，0.5mnacl，20mm咪唑,ph8.0)重悬浮，然后于冰水浴中超声破碎(200w，超声2s，间歇3s，120次)，再离心收集上清液即为粗酶液，粗酶液中含有重组融合蛋白cbm56-enterokinase-gscsn46。

3)cbm56-enterokinase-gscsn46融合蛋白纯化

将几丁质，酵母葡聚糖，微晶纤维素按1:0.5:2的质量比例混合，制备固定化酶载体。取上述固定化酶载体2g，加入50mm醋酸-醋酸钠缓冲液10ml(ph5.5)充分混匀，将悬液装填入1*5cm的玻璃层析柱中。用蠕动泵泵入20ml50mm醋酸-醋酸钠缓冲液(ph5.5)，清洗上述填料，上样流速1ml/min。带填料清洗平衡后，泵入含有重组融合蛋白cbm56-enterokinase-gscsn46的粗酶液5ml，上样流速0.5ml/min。上样后室温孵育15min。随后采用蠕动泵泵入50mm醋酸-醋酸钠缓冲液(ph5.5)，洗涤未吸附的杂蛋白，上样流速1ml/min，待流穿液od280低于0.1后停止洗涤。经sds-page检测，仅融合蛋白吸附于可得然多糖载体，杂蛋白均被洗涤(图2)。随后采用含适量肠激酶的50mm醋酸-醋酸钠缓冲液(ph5.5)洗脱目的蛋白，上样流速0.2ml/min，梯度收集洗脱的目的蛋白，即可得到纯化后的目的蛋白。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华东理工大学

<120>碳水化合物结合模块及其在固定化酶制备与融合蛋白纯化上的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>85

<212>prt

<213>巴伦葛兹类芽孢杆菌(paenibacillusbarengoltzii)

<400>1

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151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

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<210>2

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<212>dna

<213>巴伦葛兹类芽孢杆菌(paenibacillusbarengoltzii)

<400>2

gctgatttcactcaaggagcggacgtctccggcaacaacgtaactttatggttcaaatca60

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